37

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian True Experimental yang menggunakan

metode the posttest only control group design dimana sampel di pilih secara acak dan

dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu 3 kelompok kontrol, masing – masing kontrol positif

(K+), kontrol negatif (K-) dan kontrol hewan sehat (HS) dan 3 kelompok uji (P1, P2,

P3).

4.2 Tempat Dan Waktu Penelitian

4.2.1 Ekstrak Tanaman

Laboratorium Sintesa Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas

Muhammadiyah malang. Waktu penelitian yaitu pada Maret 2016.

4.2.2 Pengujian Aktifitas

Laboratorium Sintesa Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas

Muhammadiyah malang. Waktu pelaksanaan kegiatan pada bulan Maret 2016.

4.3 Populasi dan sampel

4.3.1 Populasi

Design penelitian ini adalah Eksperimental Laboratorium dengan menggunakan

jenis Randomized control group post test design. Hewan coba yang digunakan adalah

tikus jantan jenis Rattus Novergicus galur Wistar. Tikus yang digunakan adalah tikus

sehat yang ditandai dengan perilaku dan memiliki nafsu makan yang baik.

4.3.2 Sampel

Pada penelitian Eksperimental, belum banyak rumus yang dikembangkan untuk

menentukan besar sampel yang dibuutuhkan. Untuk menentukan besar sampel

(replikasi yang dibutuhkan digunakan rumus berikut :

38

(t-1)(n-1) ≥ 15 Keterangan :

(6-1)(n-1) ≥ 15 t : jumlah perlakuan

5(n-1) ≥ 15 n : replikasi (jumlah sampel)

5n-5 ≥ 15

5n ≥ 20

n ≥ 4

Dari data perhitungan tersebut, didapatkan data untuk enam perlakuan

dibutuhkan jumlah sampel atau replikasi sebanyak minimal 4 ekor hewan coba. Tikus

(Rattus norvegicus) diadaptasikan terlebih dahulu selama 7 hari (Gani et al, 2013) dan

diberi pakan standar. Untuk kelompok sehat, 5 tikus ditempatkan pada kandang

berukuran ± 17,5 x 23,75 x 17,5 cm berbahan plastik dan berpenutup kawat.

Sedangkan untuk kelompok kontrol negatif, kontrol positif, P1, P2, P3, tiap 2 tikus

ditempatkan pada kandang berukuran ± 17,5 x 23,75 x 17,5 cm berbahan plastik,

bersekat kawat pada bagian tengah dan berpenutup kawat.Kandang ditempatkan di

tempat bebas polutan dan kebisingan.

4.4 Alat dan Bahan

4.4.1 Alat

1. Blender

2. Timbangan untuk menimbang

daun dan ekstrak Persea

americana dan Annona

squamosa

3. Bejana kapasitas 5L

4. Beaker glass 1 L

5. Batang pengaduk

6. Kertas saring

7. Corong buchner

8. Erlenmeyer 500 ml

9. Rotary Evaporator

10. Corong gelas

11. Bejana untuk uji KLT

12. Lempeng silica gel untuk uji

KLT

13. Cawan Porselen

14. Spatula logam

15. Mortir dan stamper

16. Gelas ukur

17. Timbangan untuk menimbang

tikus (Rattus norvegicus)

18. Kandang

39

19. Penutup kandang dari anyaman

kawat

20. Botol minum tikus

21. Sonde

22. Spuit

23. Kapas

24. Mikropipet 200 µl, 500 µl

25. Auto analyser Konelab 200XT

4.4.2 Bahan

1. Hewan percobaan tikus putih

( Rattus norvegicus L)

2. Simplisia daun srikaya (

Annona squamosa )

3. Simplisia daun alpukat (

Persea americana )

4. Etanol 96%

5. Aqua destilata

6. CMC-Na

7. 4-amino antipirin

8. Cholesterol esterase

9. Cholesterol oxidase

10. Detergen (surfaktan)

11. DSBmt

12. Peroxidase

13. Good’s buffer solution

14. N-heksan

15. Etil asetat

16. Makan tinggi lemak dan

kalori

17. Pakan standart/pellet

18. Simvastatin

4.5 Pengumpulan Data

4.5.1 Ekstraksi

1. Ekstrak Daun Srikaya (Annona squamosa)

Dari ekstraksi 1,5 kg serbuk daun annona squamosa L. di rendam di dalam

bejana dengan etanol 96% sebanyak 6L dan dibiarkan selama 24 jam. Hasil

rendaman kemudian di saring dengan corong buchner untuk memperoleh filtrate.

Filtrat kemudian ditampung dan di uapkan dengan rotavapour hingga di peroleh

ekstrak kental. Residu hasil penyaringan di rendam kembali dengan etanol 96%

sebanyak 3 L dan di biarkan 24 jam kemudian di saring dan di uapkan dengan

cara yang sama. Proses ini dilakukan sampai di peroleh ekstrak kental yang

berwarna coklat kehitaman sebanyak 193,41 gram. Golongan senyawa

flavonoida yang terdapat pada ekstrak, di identifikasi dengan metode

40

Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase diam yang di gunakan adalah silica GF245

dengan fase gerak yang terdiri dari campuran kloroform dan etilasetat dengan

perbandingan sama banyak.

Daun Annona squamosa Linn dikeringkan pada suhu ruangan selama

satu minggu. Daun Annona squamosa L. kering kemudian dihancurkan dengan

menggunakan alat penggiling. Serbuk yang sudah ditimbang kemudian

diekstraksi menggunakan etanol sebagai pelarut. Larutan kemudian dievaporasi

sampai memperoleh ekstrak kental. Ekstrak disimpan pada suhu 2-80℃ sampai

akan digunakan.

Gambar 4.1 Bagan Alir Proses Ekstraksi Srikaya ( Annona squamosa )

2. Ekstraksi Daun Alpukat (Persea Americana)

Ekstraksi daun Alpukat di lakukan dengan metode maserasi menggunakan

pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1 : 10. Simplisia serbuk kering daun

alpukat 500 gram di rendam dengan etanol 96% sebanyak 2L dan dibiarkan

selama 24 jam. Hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring dan dipisahkan dari

endapannya. Ekstraksi daun alpukat kemudian di evaporasi menggunakan rotary

Disaring

Ekstraksi 1,5 kg serbuk daun srikaya

Maserasi dengan pelarut 6 L etanol 96% selama 24 jam

Residu

Filtrat ditampung Direndam di dalam bejana dengan etanol

96% 3L dibiarkan selama 24 jam

Di saring dan di uapkan

Di peroleh ekstak kental daun srikaya

41

vacuum evaporator untuk menghilangkan pelarut dalam ekstraksi, dengan suhu

di bawah titik didih pelarut (50-60 ℃). Residu hasil penyaringan di kumpulkan

kembali dan di rendam dengan etanol 96% sebanyak 1,5L dan di biarkan selama

24 jam (proses ini dilakukan 2 kali) hingga di peroleh filtrat yang kental.

Gambar 4.2Bagan Alir Proses Ekstraksi Daun Alpukat

4.5.2 Persiapan Hewan Coba

Sampel yang digunakan sebanyak 24 ekor tikus jantan Sprague Dawley dengan

berat badan rata-rata 140-260 gram dan berumur 8 minggu yang diperoleh dari

Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPTT) UGM Yogyakarta. Pada penelitian

ini menggunakan 4 kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus.

Penentuan besar sampel menggunakan rumus besar sampel eksperimen Fedeer, yaitu

(t-1)(n-1) ≥ 15. Pengelompokkan tersebut dilakukaan secara acak sederhana dengan

Simplisia serbuk kering daun alpukat 500 gram

Maserasi di dalam bejana dengan etanol 96% 6 L dibiarkan selama 24 jam

Disaring Residu

Dipisah dari endapannya Maserasi di dalam bejana dengan etanol 96%

1,5 L di biarkan selama 24 jam

Di peroleh ekstrak kental daun alpukat

Di uapkan dengan

rotavapor

42

pembeerian nomor pada ekor tikus yang kemudian nomor tersebut diambil dengan

system lotere. Masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor tikus yang dirawat dalam

kandang individu. Keempat kelompok diberi pakan standart ADII dan diet tinggi

lemak. Diet tinggi lemak dibuat dengan cara menambahkan pakan standart BR-2

dengan lemak sebanyak 10% diblender dengan juicer tanpa penambahan air.

Setiap kandang berisi dua ekor tikus dimana masing-masing dipisahkan oleh

sekat yang terbuat dari kawat dimaksudkan untuk menjamin setiap tikus memperoleh

jumlah pakan yang sama. Hal ini akan di lakukan selama proses induksi pakan

aterogenik. Pakan aterogenik diberikan secara per oral dalam campuran pakan standar.

4.5.3 Persiapan Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan adalah daun srikaya (Annona squamosa) dan daun

alpukat (Persea americana) yang diperoleh dari Pasuruan, Jawa Timur. Indentifikasi

tanaman di lakukan di UPT Materima Medika, Batu.

43

4.5.4 Alur Penelitian

Gambar 4.3Bagan alur penelitian

Tikus putih jantan Rattus novergicus

5 ekor tikus

kelompok

kontrol sehat

5 ekor tikus

kelompok

control

positif

5 ekor tikus

kelompok

control

positif

5 ekor tikus

kelompok

control

positif

5 ekor tikus

kelompok

control

positif

5 ekor tikus

kelompok

control

positif

Diadaptasi selama 7 hari

Tikus kelompok K+, K-, P1, P2, dan P3 di beri pakan

aterogenik selama 14 hari

Di beri

pakan

standar

K+ di beri

Simvastatin

0,35

mg/150gBB

K- di beri

suspense

CMC-Na 0,5

%

P1 di beri

ekstrak PA :

AS dosis 1,

yaitu 125

mg/KgBB :

125

mg/KgBB

P2 di beri

ekstrak PA :

AS dosis 2,

yaitu 125

mg/KgBB :

250

mg/KgBB

P3 di beri

ekstrak PA :

AS dosis 3,

yaitu 250

mg/KgBB :

125

mg/KgBB

Perlakuan selama 21 hari

Di ambil sampel darah di hari ke-22

Pengukuran kadar Triglisirida

Analisis Data

44

4.6 Prosedur Kerja

Tikus yang digunakan adalah tikus jantan Rattus norvegicus galur wistar bobot

130-180 gram berusia 70 hari sejumlah 30 ekor. Tikus lalu dibagi menjadi 6 kelompok,

masing-masing terdiri dari 5 ekor tikus :

1. 4 ekor tikus sebagai kontrol sehat, diberi pakan standart selama penelitian

2. 4 ekor tikus kontrol negative (K-), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik

selama 14 hari

3. 4 ekor tikus kontrol positif (K+), yaitu tikus yang di beri pakan aterogenik

selama 14 hari dan di beri simvastatin dosis 10 kg/KgBB yang dikonversikan

menjadi yaitu 0.135 mg/KgBB selama 21 hari

4. 4 ekor tikus kelompok perlakuan dosis 1 (P1), yaitu tikus yang di beri pakan

aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea americana dan

Annona squamosa masing-masing 125 mg/KgBB dan 125 mg/KgBB selama 21

hari

5. 4 ekor tikus kelompok perlakuan dosis 2 (P2), yaitu tikus yang di beri pakan

aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea Americana dan

Annona squamosa masing-masing 125 mg/KgBB dan 250 mg/KgBB selama 21

hari

6. 4 ekor tikus kelompok perlakuan dosis 3 (P3), yaitu tikus yang di beri pakan

aterogenik selama 14 hari dan di beri kombinasi ekstrak Persea Americana dan

Annona squamosa masing-masing 250 mg/KgBB dan 125 mg/KgBB selama 21

hari

4.7 Analisis Data

Analisis data dalam penelitian ini yaitu dengan menggunakan metode One way

ANOVA, yaitu analisis varian dimana terdapat variable numerik lebih dari dua

kelompok, dalam penelitian ini yaitu tiga macam dosis kombinasi ekstrak daun alpukat

dan srikaya. Metode ini menggunakan soft ware SPSS (Statistic Program for Social

Science) 16.0 for windows. Sebelum pengolahan data harus di pastikan bahwa data

yang di peroleh memiliki distribusi normal dan homogennitas sehingga dapat dipakai

45

dalam statistik parametik (statistic inferensial). Data yang memiliki normalitas yang

baik adalah yang memiliki nilai signifikan >0.05 artinya tidak memiliki perbedaan

yang signifikan sehingga data yang digunakan, sedangkan data yang bersifat homogeny

memiliki signifikan >0.05. Kesimpulan penerimaan hipotesis dapat di lihat apabila

nilai yang di peroleh dari hasil analisis yaitu <0.05.