22

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini menggunakan jenis penelitian eksperimental dengan desain

penelitian yang digunakan adalah Post Test Only Control Group Design.

4.2 Lokasi dan Waktu penelitian

- Penelitian dikerjakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang.

- Pemeriksaan kadar Superoksida Dismutase (SOD) dikerjakan di

Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

- Estimasi waktu penelitian selama 21 hari (Januari-Februari 2018)

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi dalam tikus ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegius

strain wistar).

4.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan adalah tikus putih jantan strain wistar yang

sesuai dengan kriteria inklusi.

4.3.3 Besar Sampel

Penentuan besar sampel ditentukan dengan rumus Federer (1999), yaitu

(n – 1) (t – 1) ≥ 15. Dengan t = banyaknya variabel perlakuan,

sedangkan n = besar sampel. Karena dalam penelitian ini akan

dilakukan 5 variabel perlakuan, maka banyak sampel yang dibutuhkan :

23

(n – 1) (5 – 1) ≥ 15

(n – 1) 4 ≥ 15

4n – 4 ≥ 15

4n ≥ 19

n ≥ 4,75 ≈ 5

∑ hewan = n x ∑ kelompok perlakuan

= 5 x 5 = 25

E (besar sampel)

= ∑ hewan - ∑ kelompok perlakuan

= 25 – 5

= 20

Rumus besar sampel untuk mengantisipasi kemungkinan sampel

terpilih mengalami drop out sebagai berikut:

n’ = [n/1-f]

n’ = 5 / (1-0,1)

= 5,55 ≈ 6

= 6 : 5 = 1,2 ≈ 1

= 1 x 5 kelompok = 5

Keterangan :

n’ = jumlah sampel penelitian

n = besar sampel yang dihitung

f = perkiraan proporsi drop out, (f = 0,1)

24

Setiap kelompok diisi 5 ekor tikus sehingga total sampel penelitian

ini adalah 25 ekor tikus. Pada penelitian ini terdapat 5 kelompok

perlakuan yaitu satu kelompok kontrol positif (+), satu kelompok

negatif (-) dan tiga kelompok perlakuan.

4.3.4 Teknik pengambilan sampel

Teknik pengambilan sampling pada penelitian ini adalah purposive

sampling.

4.3.5 Karakteristik sampel penelitian

4.3.5.1 Kriteria Inklusi

1. Umur 2-3 bulan

2. Jenis kelamin jantan

3. Berat badan tikus 180-200 gr

4. Sehat yang ditandai dengan gerakan yang aktif, bulu tebal

dan bulu berwarna putih, serta mata tikus yang jernih

4.3.5.2 Kriteria Drop Out

1. Tikus yang sakit selama eksperimen

2. Tikus yang mati selama eksperimen.

4.3.6 Variabel penelitian

4.3.6.1 Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian dosis

bertingkat ekstrak buah mengkudu.

25

4.3.6.2 Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah perubahan

kadar SOD darah pada tikus

4.3.7 Definisi operasional

- Ekstrak Buah Mengkudu

Ekstrak buah mengkudu didapat dari UPT Materia Medika Kota Batu

dalam keadaan cair yang dilarutkan dalam etanol 70%. Ekstrak ini

akan dibuat dalam 3 dosis. Dosis 1 : 22,4 mg/kgBB/hari; dosis 2 : 44,8

mg/kgBB/hari; dan dosis 3 : 89,6 mg/kgBB/hari (Budi et al, 2012).

Ekstrak mengkudu diberikan peroral menggunakan sonde setiap hari

selama 14 hari.

- Kadar SOD

Pemeriksaan Kadar SOD sebagai parameter antioksidan yang diukur

dengan spektofotometri dan hasil pengukuran dalam satuan unit/ml

pada setiap kelompok perlakuan yang diperiksa di Laboratorium

Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

Kadar normal SOD pada penelitian ini sesuai dengan kadar SOD pada

kelompok kontrol.

- Induksi Alkohol

Alkohol yang digunakan adalah alkohol dengan konsentrasi 20%.

Alkohol ini diberikan dengan dosis 0,01ml/kgBB. Alkohol diberikan

peroral menggunakan sonde setiap hari selama 14 hari.

26

4.4 Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1 Alat Penelitian

1. Alat Pembedah Tikus : Handscoon, alat bedah hewan percobaan

(scalpel, gunting, pinset, meja, jarum)

2. Alat Perawatan Tikus : Kandang tikus, timbangan, botol air, dan

tempat makan tikus

3. Alat Pembuatan Ekstrak : Oven, inkubator, rotary evaporator,

kertas saring whatman nomor 2, blender, pisau, dan pengaduk

4. Alat Pengukur SOD : Tabung sentrifuge 14cc, mesin sentrifuge,

timbangan analitik, ujung pipet (yellow and blue tips), inkubator,

kertas saring, water batch, dan spektofometer

5. Alat Lain : Sonde modifikasi, kamera digital, botol film, neraca

berat badan, spuit injeksi 3 ml, dan label

(Alexandru, 2011).

4.4.2 Bahan Penelitian

A. Bahan perlakuan tikus :

1. Tikus putih jantan galur wistar usia 2-3 bulan dengan berat

180-200 gram

2. Pakan standart BR II dan air untuk minum

3. Aquades

4. Alkohol

Alkohol yang digunakan adalah alkohol dengan kandungan

etanol 20%, dengan dosis 0,01 mL/ kgBB/hari.

5. Chlorofom

27

B. Bahan pembuatan ekstrak buah mengkudu : Buah mengkudu

masak, etanol 95%, dan aquades

C. Bahan Pengukuran SOD : Aquadest, EDTA, xanthin,

xanthineoksidase NBT, Na thiobikarbonat, HCl, Trichlorida etil

acid (TCA), Spektofotometer UV, dan buffer phosfatsolution.

4.5 Prosedur Penelitian

4.5.1 Adaptasi

Subjek penelitian diadaptasikan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama 7 hari, agar

tikus menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru. Tikus

dimasukkan ke kandang dan diberi makan dan minum standar

4.5.2 Pembagian kelompok tikus

Tikus yang digunakan sebanyak 25 ekor yang terbagi menjadi 5

kelompok yaitu satu kelompok kontrol positif (+), satu kelompok

kontrol negatif (-), dan 3 kelompok perlakuan. Setiap kelompok

terdapat 5 ekor tikus.

4.5.3 Pembuatan Ekstrak Mengkudu

Langkah pembuatan ekstrak mengkudu sebagai berikut (Surya, 2013).

Pertama, buah mengkudu dihaluskan dengan blender kemudian

direndam dengan alkohol 90% perbandingan 1:3 dan dikocok dengan

pengocok listrik (Strer) selama 2 jam, lalu didiamkan selama 24 jam.

Kedua, ektrak disaring dengan ampasnya direndam kembali

dengan alkohol 90% 1:2, kemudian dikocok selama 2 jam dan

didiamkan selama 24 jam.

28

Ketiga, hasil saringan (filtrat) yang dihasilkan kemudian diuapkan

dengan menggunakan mesin penguap listrik (evaporator) sampai

didapatkan ekstrak kental dengan rendemen + 7,65%.

4.5.4 Penentuan dosis ekstrak mengkudu

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Budi, et al (2012)

tentang teh rosela menyatakan bahwa dengan dosis 22,4 mg/mgBB

tikus dapat meningkatkan kadar SOD yang diinduksi dengan alkohol,

namun penurunannya tidak signifikan. Untuk menilai tingkat

keefektifannya dalam percobaan ini dilakukan orientasi tiga dosis yaitu

: 22,4 mg/kgBB; 44,8 mg/kgBB; dan 89,6 mg/kgBB. Volume cairan

yang disarankan untuk diberikan pada tikus putih menggunakan sonde

per oral adalah 5 ml/kgBB sehingga untuk tikus putih dengan berat 200

g, volume cairan yang diberikan adalah 1 ml/kgBB. Perhitungan

volume pengenceran ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L.):

C1 = Konsentrasi dosis tinggi

C2 = Konsentrasi dosis sedang

C3 = Konsentrasi dosis rendah

a. C1 = 89,6 mg/1 ml

b. C2

44,8 mg/X ml = 89,6 mg/1 ml

X = 44,8/89,6 = 0,5 ml

c. C3

22,4 mg/X ml = 89,6 mg/ 1ml

X = 22,4/89,6 = 0,25 ml

29

Sehingga, dosis ekstrak buah mengkudu 89,6 mg akan dilarutkan

dengan 1 ml aquades, dosis 44,8 mg akan dilarutkan dengan 0,5 ml

aquades dan dosis 22,4 mg akan dilarutkan dengan 0,25 ml aquades.

4.5.5 Penentuan dosis alkohol

Berdasarkan penelitian Kessova et al (2013) bahwa pemberian

alkohol 20% dosis 0,01 ml/kgBB dapat menurunkan kadar SOD dalam

darah. Sehingga pada penelitian ini peneliti ingin memberi induksi 0,01

ml/kgBB alkohol 20% pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain

wistar) yang diharapkan terdapat perubahan kadar SOD sehingga

peneliti bisa melihat efektifitas dari ekstrak buah mengkudu (Morinda

citrifolia L).

4.5.6 Pemaparan alkohol

Mengambil tikus yang sudah dikelompokkan berdasarkan

perlakuan secara satu persatu. Pengambilan tikus dilakukan dengan

hati-hati dan perlahan, agar tikus tidak takut dan tidak stress. Tikus

dipegang dengan cara memegang badan tikus dan menaruh bagian ekor

serta menjepitnya pada jari antara kelingking dengan jari manis, lalu

menyilangkan kaki depan tikus dan menjepitnya pada jari antara jari

telunjuk dengan jari tengah, sedangkan posisi kepala tikus siap untuk

diberi alkohol. Kemudian sonde dimasukkan melalui sudut mulut agar

tikus tidak menggigit sonde, pemasukan sonde dilakukan ketika tikus

melakukan gerakan menelan / menggerak – gerakkan lidahnya,

sehingga sonde tidak melukai bagian dalam mulut tikus. Setelah sonde

masuk sampai esofagus baru larutan etanol dimasukkan.

30

4.5.7 Pengambilan kadar SOD

Pada akhir intervensi tikus dikondisikan dalam keadaan puasa

untuk persiapan dilakukannya pembedahan. Tikus dilakukan

pembedahan dan diambil sampel darah melalui jantung untuk

mendapatkan jumlah darah yang maksimal. Pemeriksaan kadar SOD

dengan metode spektrofotometri. Darah yang telah disentrifuge,

dicampur dengan EDTA 100 mM, NBT 25 U, Xanthine 25 U, dan

Xanthin Oksidase 1 U hingga homogen, kemudian diinkubasi,

disentrifuge dan disaring bila terdapat koloid. Pembacaan dilakukan

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm.

(Kusumastuty, 2014).

4.5.8 Proses anestesi dan pembedahan hewan coba

1. Proses anastesi

Proses anastesi dilakukan satu persatu terhadap hewan coba yaitu

dengan memasukan hewan coba ke dalam toples kaca yang berisi

kapas yang sudah dicampur dengan kloroform. Anastesi dilakukan

secara inhalasi pada hewan coba dengan dosis ± 0,67 ml/hewan coba

selama ± 60 detik yang dihitung dengan menggunakan stopwatch

(Alexandru, 2011).

2. Proses pembedahan

Setelah hewan coba teranastesi dengan baik (keadaan pingsan),

hewan coba diletakkan pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba

difiksasi terhadap meja lilin dengan menggunakan jarum pentul.

Dengan menggunakan gunting bedah, dilakukan pembedahan pada

31

abdomen hingga setinggi leher. Kemudian dengan menggunakan

spuit 3 ml, darah hewan coba diambil dari jantung sebanyak ± 3 ml

(Alexandru, 2011).

3. Penanganan hewan coba setelah pembedahan

Hewan coba yang telah dibedah, pastikan bahwa hewan coba tidak

mengalami recovery. Sebelum mengubur hewan coba, dipastikan

bahwa denyut nadi sudah berhenti. Jika hewan coba mengalami

recovery maka harus dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya

dengan prosedur Cervical Dislocation, yaitu dengan cara

memisahkan tengkorak dan vertebrae. Teknik ini dilakukan dengan

memberikan tekanan ke bagian posterior dasar tulang tengkorak dan

vertebrae. Bila vertebrae terpisah dari otak, reflek kedip menghilang

dengan segera, rangsangan rasa sakit menghilang sehingga hewan

tidak merasakan sakit. Selanjutnya hewan coba yang sudah

dipastikan mati, dikumpulkan menjadi satu lalu dikubur (Alexandru,

2011).

32

4.6 Alur penelitian

Pencatatan hasil dan analisa data

Setiap tikus dianastesi dengan kloroform pekat secara inhalasi.

Pemeriksaan Kadar SOD

Keempat kaki hewan difiksasi dengan jarum pentul lalu

dilakukan pembedahan pada abdomen hingga setinggi leher

dan diambil darah sebanyak ± 3ml dari jantung.

Sampel tikus jantan

Adaptasi tikus selama 7 hari dan diberi

makan minum standar

KP

Kontrol positif

(KP)

Diberi standar

dan minum dan

induksi alkohol

20% peroral

0,01 ml/kgBB

selama 14 hari

KN

Kontrol negatif

(KN)

Diberi makan

standar dan

minum selama

14 hari

P1

Diberi pakan

standar

minum.

Induksi

alkohol 20%

peroral 0,01

ml/kgBB dan

ekstrak

mengkudu

dosis

22,4mg/kgBB/

hari selama 14

hari per sonde

P 2

Diberi pakan

standar dan

minum.

Induksi

alkohol 20%

peroral 0,01

ml/kgBB dan

ekstrak

mengkudu

dosis

44,8mg/kgBB/

hari selama 14

hari per sonde

P 3

Diberi pakan

minum

standar.

Induksi

alkohol 20%

peroral 0,01

ml/kgBB dan

ekstrak

mengkudu

dosis

89,6mg/kgBB/

hari selama 14

hari per sonde

33

4.7 Analisa data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis dengan uji normalitas

dan homogenitas terlebih dahulu. Selanjutnya apabila didapatkan distribusi

data normal dan homogen berlanjut ke uji One Way Anova, uji Post-Hoc

Bonferroni, dan uji Regresi Linier dengan menggunakan SPSS.

a. Uji normalitas dengan menggunakan metode analitik parameter Shapiro-

Wilk yang bertujuan untuk mengetahui sebaran data normal dengan

ketentuan normal jika sig > 0,05. Jika data tidak normal, maka dilakukan

transformasi data. Jika hasil transformasi data normal maka dilanjutkan

dengan uji One way Anova dan Post Hoc Bonferroni. Jika tetap tidak

normal maka menggunakan uji Kruskal-Wallis dan Post-Hoc Mann

Whitney.

b. Uji homogenitas dengan uji varian Levene’s test untuk mengetahui

kehomogenan atau varian data dari carian dari data yang diperoleh

(homogen jika sig > 0,05). Jika varian data sama maka berlanjut ke uji One

way Anova dan Post Hoc Bonferroni. Jika varian beda maka berlanjut ke

uji Post Hoc Games-Howell. Uji homogenitas ini sendiri menggunakan uji

Levene.

c. Bila uji normalitas didapatkan sebaran data normal, maka akan dilanjutkan

Uji One Way Anova untuk membuktikan adanya perbedaan yang

bermakna antara kontrol dengan perlakuan. Sedangkan bila uji normalitas

didapatkan sebaran data tidak normal akan menggunakan uji non

parametric dengan uji Kruskal-Wallis.

34

d. Uji Post-Hoc Bonferroni digunakan apabila sebaran data nomal dan

hmogen. Uji ini untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan

signifikan.

e. Uji Regresi Linier digunakan untuk mengetahui pengaruh dosis ekstrak

buah mengkudu terhadap kadar SOD yang di induksi alkohol.