bab iv. jenis kegiatan (perlu edit)

BAB IV

JENIS KEGIATAN

A. Pembuatan Media Reagensia

1. Media

Bakteri seperti makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi untuk

pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu

di dalam mengkultivasi, mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba.

Mikroba memiliki karakteristik dan ciri-ciri yang berbeda di dalam

persyaratan pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada

media yang mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu hidup

dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah

yang meyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan

mikroba.

Bakteri agar bisa dibiakan didalam laboratorium memerlukan

media yang memungkinkan tumbuh dan berkembang secara optimal.

Oleh karena itu media pembiakan harus mengandung cukup nutrien

untuk pertumbuhan bakteri, selain suhu dan pH .Meskipun persyaratan

nutrien bakteri amat beragam, namun sebagai makhluk hidup mereka

mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air,karbon, energi,

mineral . Unsur carbon misal asam asetat, sedangkan mineral berasal

dari unsur logam-logam. Unsur energi diambil dari bahan protein seperti

amino, Pepton.pH medium amat penting bagi pertumbuhan bakteri.

Sebagian besar bakteri tumbuh baik pada pH 7, oleh karena itu media

yang digunakan harus disesuaikan pH nya untuk tumbuhnya bakteri.

2. Macam-macam media

Menurut wujudnya dikenal ada 3 macam media

a. Liquid media : media cair misalnya BGLB, LTB

b. Solid media : media padat misal nutrient agar, selenit

c. Semi solid media : media setengah padat, misal Carry and Blair

19

20

Menurut sifat media

a. Transport media : media yang digunakan untuk mengirim

specimen dari suatu tempat ke Laboratorium,misal carry and blair

b. Enrichment media : media yang dipergunakan untuk memperbanyak

bakteri, missal BHI.

c. Selective media : media yang dapat digunakan untuk

menghambat pertumbuhan bakteri lainnya , sedangkan yang

diinginkan tetap tumbuh sehingga media ini dapatmembedakan

bakteri yang satu dengan yang lainnya, misal EMB, Mac Conkey.

BGLB

d. Universal media : media yang bisa ditumbuhi oleh hampr

semua Bakteri, misal BHI, BP ( Blood Agar Plate).

e. Exclusif media : media yang hanya dapat ditumbuhi

segolongan bakteri saja, sedangkan yang lain akan tidak tumbuh dan

dapat dibedakan satu dengan yang lainnya, misal TCBS

3. Fungsi Media

a. Untuk tumbuh kembangnya bakteri

b. Untuk mengetahui sifat biokimia dan kultur bakteri

c. Untuk menyimpan bakteri

4. Bahan yang digunakan

a. Media Lauryl Tryptose Broth k.Mio medium

b. Media Briliant green Lactose Bile Broth l.Malonate broth

c. Media EC medium m.Phenyalanine agar

d. Mac conkey agar n.Simon citrat agar

e. SIM medium o.TSIA

f. Urea agar base p.Mueller hinton agar

g. Lysine iron agar q.Phenol red broth

agar base

h. Gula- gula r.TCBS

i. SS s.SPS

j. Clary Blair

21

5. Peralatan

a. Tabung reaksi g. Pengaduk

b. Gelas ukur h. Pipet ukur 5 mL

c. pH meter i. Neraca

d. Autoclave j. sendok sungu

e. Tabung durham k.Hot plate stirer

f. Erlenmeyer

6. Cara pembuatan

a. Media Lauryl Tryptose Broth

1) Timbang 106,8 gram media Lauryl Tryptose Broth ( 1,5 % ) dan

timbang Lauryl Tryptose Broth 35,6 gram ( 0,5 % ).

2) Masukan Lauryl Tryptose Broth ke dalam 1 liter aquadest.

3) bahan dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk pelan-

pelan atau memakai hot palte stirer, sampai bahan larut.

4) pH diatur sehingga didapatkan pH 6,8 ± 0,2

5) Diisikan ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham

terbalik masing- masing kurang lebih 5 mL untuk media LTB

( 1,5 %) dan 10 mL untuk media 0,5 % tutup dengan tutup plastik

6) Sterilkan dalam autoclave 121 0 C, tek.1 atm selama 15

menitsetelah dingin simpan di tempat yang bersih dan kering.

b Media Brilliant green lactose Bile Broth

1) Timbang 40 gram media BGLB

2) Masukan BGLB ke dalam 1 liter aquadest.

3) Bahan dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk

pelanpelanatau memakai hot plate stirer, sampai bahan larut.


5) Diisikan ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham

terbalik masing- masing kurang lebih 10 mL dan tutup dengan

tutup plastik

6) Sterilkan dalam autoclave 121°C, 15 menit

7) Setelah dingin simpan di tempat yang bersih dan kering.

22

c Media EC medium

1) Timbang 37 gram media EC medium

2) Masukan EC Medium ke dalam 1 liter aquadest.

3) bahan dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk pelan-pelan

atau memakai hot plate stirer, sampai bahan larut.


5) Diisikan ke dalam tabung reaksi yang berisi tabung durham terbalik

masing- masing kurang lebih 10 mL dan tutup dengan tutup plastik

6) Sterilkan dalam autoclave 121°C, 15 menit

7) setelah dingin simpan di tempat yang bersih dan kering.

d. Blood Agar Plate

1) Timbang 28 gram Nutrient agar

2) Larutkan dengan 1 liter aquadest

3) Sterilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit

4) Dinginkan hingga 40 celsius tambahkan 5 – 7 persen darah domba,

tuangkan dalam petridish steril

e. Mac Conkey Agar

1) Timbang 51, 5 gram



4) Dinginkan hingga 40 celsius tuang dalam petridish steril 20 ml

f. Mueller Hinton agar

1)Timbang 38 gram

2)Larutkan dengan 1 liter aquadest

3)Sterilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit

4)Dinginkan hingga 40 celsius tuang dalam petridish steril 20 mL

g. SIM medium

1)Timbang 30 gram

2)Larutkan dengan 1 liter aquadest dalam waterbath hingga homogen

3)Tuang ke dalam tabung 5 mL tutup dgn kapas

4)Sterilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit

23

h. Simmons Citrat agar

1) Timbang 23 gram

2) Larutkan dengan 1 liter aquadest dalam waterbath hingga

homogen

3) Tuang ke dalam tabung 5 mL tutup dgn kapas


5) Dinginkan dalam posisi miring

i. TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

1) Timbang 65 gram


homogen

3) Tuang ke dalam tabung 5 mL tutup dgn kapas



j. Urea agar base

1) Timbang 2,4 gram

2) Larutkan dengan 95 mL liter aquadest

3) Sterilisasi dengan autoclave 115 celcius waktu 20 menit

4) Dinginkan hingga 50 °C ditambah 5 mL 40 % urea solution SR 20

gojog hingga homogen

5) Tuang dalam tabung steril diamkan dalam posisi miring

k. Lysine iron agar (LIA)

1) Timbang 34 gram


3) Panaskan hingga larut , masukkan ke dalam tabung

4) Sterilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit 15 menit

5) Dinginkan tabung steril dan diamkan dalam posisi miring

l. Malonat Broth

1) Timbang 8 gram


3) Tuang ke dalam tabung 5 ml


24

m. Phenyl Alanine (PAA)

1) Timbang 23 gram bahan


homogen

3) Tuang ke dalam tabung ± 5 mL

4) Sterilkan dengan autoclave 121 0 C 15 menit


n. MIO MEDIUM

1) Timbang 31 gram bahan

2) Larutkan dengan 1 liter aquadest di dalam water bath hingga

homogen

3) Tuang ke dalam tabung ± 5 mL

4) Sterilkan dengan autoclave 121 0 C 15 menit

o. PHENOL RED BROTH BASE

1) Timbang 15 gram phenol red broth base


3) Sterilkan dengan autoclave 121 0 c 15 menit

p. GULA – GULA

1) Larutkan 0,85 gram media gula gula: glocuse, manitol,lactose,

maltose,sakarose ke dalam media phenol red broth base masing

masing 100 mL

2) Tuang ke dalam tabung masing masing ± 5 mL

3) Sterilkan dengan autoclave 1210 C 15 menit

q. Media TCBS

1) Larutkan 88g/L dan tuangkan ke plate.

2) Jangan diautoclave PH 8.6±0.2 pada suhu 25 0C.

r. Media SS

1) Larutkan 60g/L secarar sempurna,tuangkan kedalam plate.

2) Jangan autoclave PH 7.0±0.2 pada suhu 25 0C.

s. Media SPS (sulfat, polimixin sulfadiazine)

1) Larutkan 40g/ liter autoclave ( 15 menit 121 0C) PH 7.0±0.2 pada

suhu 25 0C.

2) Pertumbuhan dari clostridia yang sensitive sulfit yang juga di

perlihatkan.

25

t. Media Cary Blair

1) Timbang 1,5 g Sodium Thioglycollate

2) 1,1 g Disodium Hydrogen Phosphate , 5 g Bacteriological Agar ,

larutkan dengan aquadest 990 ml , diamkan pada suhu 50ᴼ C dan

tambahkan 9 ml larutan Calcium Chloride 1 %

3) Sesuaikan pHnya menjadi 8,4.

4) Masukkan 7 – 10 ml kedalam botol bertutup ulir

5) Sterilkan dengan Autoclave selama 15 menit.simpan pada suhu

kamar

B. Pemeriksaan Bakteri Gram Negatif

1. Escherecia coli

a. Tujuan

1) Memisahkan bakteri satu dengan yang lainnya (yang ditanam

spesimen).

2) Memperbanyak bakteri

3) Membedakan koloni bakteri

b. Prinsip

Menanam bakteri pada media Mac Conkey untuk mengisolasi bakteri

dan memperbanyak bakteri agar bakteri membentuk koloni. Salah

satu koloni bakteri yang terpisah ditanam pada media lain untuk

dilakukan uji biokimia agar dapat diidentifikasi.

c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3)Lampu Bunsen

4) Rak dan tabung reaksi

26

5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula

3) TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

4) SIM (Sulfit Indol Motility)

5) SC (Simmon Citrate)

6) NA (Nutrient Agar)

7) Reagen Kovac

e. Cara kerja

Hari 1

1) Ose disterilkan dengan api bunsen.

2) Diambil bakteri dengan ose penuh.

3) Dioleskan pada media Mac Conkey pada satu bidang, tunggu

sampai suspensi plate mengering.

4) Ose disterilkan kembali dan ditunggu sampai dingin.

5) Ose disentuhkan pada bagian olesan tadi dan digoreskan secara

zig-zag pada 4 bidang permukaan.

6) Diinkubasi pada suhu 370C selam 24 jam.

Hari 2

1) Diamati ciri ko0loni yang terbentuk.

2) Memilih salah satu koloni bakteri yang terpisah.

3) Diambil bakteri yang kemudian ditanam lagi dalam media gula-

gula, NA, SIM, TSIA dan SC.

4) Diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.

27

Hari 3

1) Diamati hasil dari uji biokimia.

2) Khusus untuk media SIM, ditambahkan reagen kovac untuk uji

indol.

f. Hasil

1) Ciri koloni : merah violet, bulat, ukuran 2 mm, cembung, keruh dan

berkabut..

2) Uji biokimia

NA : tumbuh

Gula-gula : +g +g +g +g +g

SIM : -/+/+

TSIA : k/k, H2S (-), gas (+)

SC : -

2. Aerobacter aerogenosa

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip





28

c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula





7) Reagen Kovac

e. Cara kerja

Hari 1









29

Hari 2






Hari 3



indol.

f. Hasil

1) Ciri koloni : merah violet, bulat, kecil, cembung, jernih.

2) Uji biokimia

NA : tumbuh


SIM : -/-/-

TSIA : k/k, H2S (-), gas (+)

SC : +

3. Klebsiella pneumonia

a. Tujuan


spesimen).



30

b. Prinsip


dan memperbanyak bakteri agar bakteri membentuk koloni. Salah satu

koloni bakteri yang terpisah ditanam pada media lain untuk dilakukan uji

biokimia agar dapat diidentifikasi.

c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula





7) Reagen Kovac

e. Cara kerja

Hari 1





31





Hari 2






Hari 3



indol.

f.Hasil

1) Ciri koloni : merah muda, bulat, sedang-besar, cembung dan

berlendir.

2) Uji biokimia

NA : tumbuh


SIM : -/-/+

TSIA : k/k, H2S (-), gas (+)

SC : +

32

4. Salmonella typhosa

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip



koloni bakteri yang terpisah ditanam pada media lain untuk dilakukan

uji biokimia agar dapat diidentifikasi.

c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula





7) Reagen Kovac

33

e. Cara kerja

Hari 1









Hari 2






Hari 3



indol.

f. Hasil

1) Ciri kolonI : tidak berwarna, bulat, kecil, cembung, jernih.

2) Uji biokimia

NA : tumbuh

Gula-gula : +g - + + -

34

SIM : +/-/+

TSIA : m/k, H2S (+), gas (-)

SC : -

5. Salmonella paratyphosa

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip





c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula

3) TSIA

4) SIM

5) SC

6) NA

35

7) Reagen Kovac

e. Cara kerja

Hari 1






5) Ose disentuhkan pada bagian olesan tadi dan digoreskan

secara zig-zag pada 4 bidang permukaan.


Hari 2

1) Diamati ciri koloni yang terbentuk.





Hari 3



indol.

f. Hasil

1) Ciri koloni Salmonella paratyphosa : tidak berwarna, bulat, kecil,

cembung, jernih.

36

2)Uji biokimia :

Media Hasil

NA +

Gula-gula +/-/+/+/-

SIM +/-/+

TSIA m/k, H2S (+++), gas (-)

SC +

6. Shigella flexneri

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip





c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


37

5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula

3) TSIA

4) SIM

5) SC

6) NA

7) Reagen Kovac

e. Cara kerja

Hari 1









Hari 2






38

Hari 3



indol.

f. Hasil

1) Ciri koloni Shigella flexneri : tidak berwarna, bulat, kecil, cembung,

jernih.

2) Uji biokimia :

Media Hasil

NA +

Gula-gula +/-/+/+(-)/-

SIM -/-/-

TSIA m/k, H2S (-), gas (-)

SC -

7. Shigella dycentriae

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip



39



d. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

e. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula

3) TSIA

4) SIM

5) SC

6) NA

7) Reagen Kovac

f. Cara kerja

Hari 1








40


Hari 2






Hari 3



indol.

g. Hasil

1) Ciri koloni Shigella dycentriae : tidak berwarna, bulat, kecil, jernih,

cembung.

2) Uji biokimia :

Media Hasil

NA +

Gula-gula +(-)/-/-/-/-

SIM -/-/-


SC -

41

8. Shigella sonnei

a. Tujuan


spesimen).



b. Prinsip





c. Alat

1) Ose tumpul

2) Ose jarum

3) Lampu bunsen


5) Inkubator

d. Bahan

1) Media Mac Conkey

2) Media gula-gula

3) TSIA

4) SIM

5) SC

6) NA

7) Reagen Kovac

42

e. Cara kerja

Hari 1


2) Diambil bakteri dengan ose penuh







Hari 2






Hari 3



indol.

f. Hasil

1) Ciri koloni Shigella sonnei : tidak berwarna, tidak beraturan, kecil-

sedang, cembung, jernih.

43

2) Uji biokimia :

Media Hasil

NA +

Gula-gula +/-/+/+/-

SIM -/-/-


SC -

C. Pemeriksaan Bakteri Gram Positif

1. Pengujian bakteri gram positif Staphylococcus

a. Tujuan : mengidentifikasi bakteri gram positif Staphylococcus

b. Prinsip :

menanam spesimen bakteri di media BAP untuk mengisolasi

bakteri dan memperbanyak bakteri agar bakteri membentuk

koloni. Salah satu bakteri yang memisah ditanam di media lain

untuk dilakukan pengecatan gram dan uji enzim.

c. Alat dan bahan :

1) Media BAP, BA dan BB, D-Nase

2) Ose tumpul

3) Lampu spirtus

4) H2O2, plasma

5) Cat gram A, B, C, dan D

d. Cara kerja :

Hari I:

1) Tanam spesimen bakteri di media BAP

44

2) Inkubasi 370C selama 24 jam

Hari II:

1) Pengamatan di media BAP

2) Ditanam di media BA dan BB


Hari III:

1) Pengamatan pada media BA dan BB

2) Melakukan pengecatan gram, spesimen diambil

dari media BA atau BB

3) Melakukan uji katalase, jika positif maka ditanam di

media D-Nase


Hari IV:

1) Pengamatan pada media D-Nase

2) Melakukan pengecatan gram

3) Uji koagulase

4) Diagnosa bakteri gram positif Staphylococcus

e. Pembahasan :

Ciri koloni di media BAP:

Staphylococcus aureus : hemolisa, warna kuning

emas, berukuran sedang.

Staphylococcus epidermidis : anhemolisa, warna putih

seperti susu, berukuran sedang.

Hasil pengujian pada :

Uji katalase : + (keruh)

Uji koagulase : + (terbentuk gelembung)

Media BA :

Staphylococcus aureus : hemolisa

Staphylococcus epidermidis : anhemolisa

45

Media BB :

Staphylococcus aureus : hemolisa

Staphylococcus epidermidis : anhemolisa

Media D-Nase : tumbuh (+)

2. Pengujian bakteri gram positif Streptococcus

a. Tujuan : untuk mengidnetifikasi bakteri gram positif Streptococcus

b. Prinsip :

Menanam spesimen bakteri di media BAP utntuk mengisolasi

bakteri dan memperbanyak bakteri agar bakteri membentuk

koloni. Salah satu bakteri yang memisah ditanam dimedia lain

untuk dilakukan pengecatan gram dan uji enzim.

c. Alat dan Bahan :

1) Media BAP, BA dan BB, Eva Broth

2) Ose tumpul

3) Lampu spirtus

4) H2O2

5) Cat gram A, B, C, dan D

d. Cara kerja :

a) Hari I:

Tanam spesimen bakteri di media BAP

Inkubasi 370C selama 24 jam

b) Hari II:

Pengamatan di media BAP

Ditanam di media BA dan BB


46

c) Hari III:

Pengamatan pada media BA dan BB

Melakukan pengecatan gram, spesimen diambil

dari media BA atau BB

Melakukan uji katalase, jika positif maka ditanam di

media Eva Broth


d) Hari IV:

Pengamatan pada media Eva Broth

Melakukan pengecatan gram

Diagnosa bakteri gram positif Streptococcus

e. Pembahasan :

Ciri koloni di media BAP :

Streptococcus pyogenes : hemolisa, berwarna putih,

berukuran kecil

Sterptococcus faecalis : anhemolisa, berwarna putih,

berukuran kecil

Hasil pengujian pada :

Uji katalase : - (jernih)

Media BA :

Streptococcus pyogenes : hemolisa

Streptococcus faecalis : anhemolisa

Media BB :

Sterptococcus pyogenes : hemolisa

Streptococcus faecalis : anhemolisa

47

Media Eva Broth : tumbuh (+)

D. Pengecatan Gram

1. Pengertian : untuk mengidentifikasi kuman melalui pengecatan gram.

2. Tujuan : Diagnosis

3. Prinsip :

Bakteri gram positif bersifat mengikat pewarna kristal violet (Gram A)

meskipun dilunturkan dengan alcohol. Sedangkan bakteri gram negative

tidak mengikat warna kristal violet, sehingga warna tersebut akan luntur

ketika dituangi alcohol, Bakteri gram negative mengikat warna merah dari

safranin (Gram D).

4. Waktu : Lama pemeriksaan 1 jam.

5. Sampel : Swab, pus, urine, darah, feses, liquor, pleura, ascites,

sputum, cairan tubuh.

6. Prosedur :

a. Mempersiapkan alat-alat yang diperlukan:

1) Ose

2) Lampu spiritus

3) Obyek glass

4) Jembatan pengecatan

5) Mikroskop

b. Mempersiapkan reagen yang diperlukan, yaitu:

1) Larutan Gram A (Carbol Gentian Violet

a) Gentian Violet 1 gr

b) Alkohol 96% 10 ml

48

c) Phenol Kristal 1 gr

d) Aquades 90 ml

2) Larutan Gram B (Lugol)

a) Yodium 1 gr

b) Kalium Iodida 2 gr

c) Aquades 300 ml

3) Larutan Gram C (Alkohol 96%)

4) Larutan Gram D (Solutio fuchsin 1%)

a) Basic fuchsin 1 gr

b) Aquades 100 ml

c. Membuat preparat.

d. Preparat dikeringkan dan difiksasi diatas nyala api lampu

spiritus.

e. Melakukan pengecatan.

1) Preparat diletakkan diatas jembatan.

2) Preparat dituangi dengan larutan Gram A 3 menit.

3) Preparat dicuci dengan air mengalir sebentar lalu

dituangi Gram B selama 45 detik.

4) Preparat dicuci dengan air mengalir lalau dituangi

larutan Gram C selama 1 menit.

5) Preparat dicuci dengan air mengalir sebentar lalau

dituangi dengan larutan Gram D selama 30 detik.

6) Preparat dicuci dengan air mengalir lalu dibiarkan

mengering di udara.

49

f. Diamati preparat menggunakan mikroskop dengan

perbesaran kuat untuk mencari adanya bakteri Gram (+)

atau Gram (-).

Interpretasi :

Gram (+) :ditemukan kuman batang atau kokus

berwarna biru.

Gram (-) : ditemukan kuman batang atau kokus

berwarna merah.

Nilai normal:tidak ditemukan kuman batang atau kokus.

E. Pengecatan BTA dengan Metode Ziehl Neelson

1. Pengertian : Cara mengidentifikasi bakteri tahan asam melalui

pengecatan BTA menurut Ziehl Nielsen.

2. Tujuan : Diagnosis

Prinsip : Dinding sel bakteri tahan asam mempunyai lapisan lemak

yang sukar ditembus cat, Pengaruh phenol dan

pemasasan. Lemak dapat ditembus dengan basic fuchsin.

Setelah BTA mengambill warna basic fuchsin kemudian

dicuci maka lapisan lemak yang terbuka waktu dipanasi

akan merapat kembali karena terjadi pendinginan pada

waktu dicuci. Pada saat dituangi asam sulfat dan alkohol

70% atau HCL alcohol, warna merah basic fuchsin tetap

diikat oleh BTA. Ketika dituangi methilen blue atau ZN C,

BTA tidak mengembil warna biru, tetapi tetap berwarna

merah

Waktu : Lama pemeriksaan 1 jam.

50

Sampel : Swab, pus, urine, darah, feses, liquor, pleura, ascites,

sputum, lesi.

Prosedur :

a. Mempersiapkan alat-alat yang diperlukan:

1) Ose

2) Lampu spiritus

3) Obyek glass

4) Jembatan pengecatan

5) Mikroskop

b. Mempersiapkan reagen yang diperlukan, yaitu:

1) Carbol Fuchsin

a) Basic Fuchsin 3,0 gr

b) Ethanol absolute 100 ml

c) Kristal Phenol 45 gr

d) Aquades 900 ml

2) Larutan dekolorisasi

a) HCL pekat 30 ml

b) Ethanol 95% 970 ml

3) Pewarna kontras

a) Methylen blue khlorida 3,0 gr

b) Aquades 1000 ml

c. Membuat preparat dari bagian spesimen yang

purulen/berdrah pada bagian tngah obyek glass

51

ukuran 2 x 3 cm, menulis no. urut Lab TB 04 di

sebelah tepi obyek glass.

d. Ose dibakar sampai membara setelah setiap

mengerjakan 1 spesimen.

e. Preparat dikeringkan dan difiksasi di atas nyala api

lampu spiritus.

f. Melakukan pengecatan.

1) Preparat diletakkan di atas jembatan pengecatan.

2) Preparat dituangi dengan carbol fuchsin.

3) Dipanaskan dari bawah setiap sediaan dengan

lampu spiritus sampai keluar uap, api harus selalu

digerakkan, dihentikan bila sudah timbul uap.

4) Didiamkan selama 5 menit atau lebih, jangan

sampai berwarna kuning.

5) Dicuci dengan air mengalir, memiringkan setiap

sediaan untuk mengalirkan air berlebih.

6) Dicuci sediaan dengan dekolorisasi sampai tidak

ada pewarna carbol fuchsin, maksimal 3 menit.

7) Dicuci dengan air mengalir.

8) Digenangi setiap sediaan dengan pewarna kontras

30 detik atau lebih.

9) Dicuci lagi sediaan dengan air mengalir,

memiringkan sediaan untuk mengurangi air yang

berlebih kemudian dikeringkan di udara terbuka.

52

10)Diamati preparat menggunakan mikroskop dengan

perbesaran kuat (100 X) untuk mencari adanya

bakteri tahan asam (BTA).

Interpretasi : Bakteri tahan asam (BTA) berwarna merah, berbentuk

batang ramping, dapat soliter, membentuk huruf V atau

berkelompok.

Bakteri tidak tahan asam berwarna biru.

Jumlah BTA yang ditemukan menunjukkan beratnya penyakit.

Tidak ditemukanBTA dalam 100 LP: BTA negatif

1-3 dalam LP: minta spesimen kedua

4-9 dalam 100 LP: positif jarang

10-99 dalam 100 LP: positif 1

1-10 dalam LP, memeriksa min 50 LP: positif 2

>10 dalam 1 LP, memeriksa min 20 LP: positif 3

5) Pemeriksaan Bakteri Anaerob

A. Spesimen

Darah, cairan pleura, cerobo spinal fluid, secret luka, pus, faeces, urine,

makanan, minuman.

B. Alat-alat dan Reagen Khusus

1. Anaerobic jar Oxoid

2. Gas generating kit dan anaerobic indicator

53

3. Katalisator

4. Anaerocult A dan anaerotest

5. Metronidazole disc 5 mcg

C. Cara Pemeriksaan

1. Hari I :

a. Spesimen ditaman pada Thioglycolate broth atau cooked meat

medium, Blood agar plate plus atau Kanamycin agar plate. Untuk

media plate ditempeli disc metronidazole pada persilangan goresan I

dan goresan II, masuk anaerobic jar dibuat anaerob.

b. Masuk inkubator 37oC 24-48 jam.

2. Hari II :

a. Diamati pertumbuhan bakteri pada media :

Thioglycolate broth atau cooked meat medium :

Keruh : ditanam pada blood agar plate plus, Kanamycin agar plate,

masuk anaerobic jar dibuat anaerob.

Jernih : tidak diteruskan

Blood agar plate plus atau kanamyicin agar plate :

Diperhatikan disekitar disc metronidazole, ada zona jernih berarti

anaerob posistif sedangkan apabila tidak ada zone jernih berarti

bakteri anaerob negatif.

b. Jika bakteri anaerob positif, koloni disekitar zone hambatan diambil

dan ditanam pada Thioglycolate broth, BHI broth, cooked meat

medium, blood agar tube, nutrient agar masing-masing 2 tabung. Satu

seri diinkubasi aerob dan satu seri diinkubasi anaerob.

c. Semuanya dimasukkan inkubator 37oC 24 jam.

54

3. Hari III :

a. Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media Thioglycolate broth,

kemudian dicat gram. Hasilnya dibandingkan dengan tabel berikut :

No Anaerob Aerob Gram Diagnosa Tindak Lanjut

1 + + murni microaerophielTidak

diteruskan

2 + + campuran microaerophielTidak

diteruskan

3 + - Murni Anaerob Diteruskan

4 + - Campuran AnaerobUlangi media

plate

5 - + murni Aerob Dibuang

6 - + Campuran Aerob Dibuang

7 - - Murni Steril Dibuang

b. Untuk yang diketemukan bakteri murni dan anaerob, dilanjutkan

penanam pada media identifikasi, sesuai dengan hasil pengecatan

gram, misalnya :

Gram (+) batang : media untuk Clostridia

Gram (-) batang : media untuk Bacteroides, Fusobacterium

Gram (+) streptococcus : media untuk Strepcoccus

Gram (+) staphylococcus : media untuk staphylococcus

4. Hari IV

a. Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media identifikasi, dicocokkan

dengan tabel untuk menentukan diagnosanya.

55

D. Cara Mudah untuk Mendapatkan Suasana Anaerob

1. Media yang sudah ditanami segera dimasukkan ke dalam anaerobic jar

oxoid.

2. Katalisator dijepit pada tutup anaerobic jar sebelah dalam, indikator

anaeron setelah dibuka diletakkan ditempatnya sehingga mudah dilihat

dari luar. Waktu dibuka kertas saring yang ada di dalam sachet tidak

berwarna dan basah. Setelah bersinggungan dengan udara akan berubah

warnanya menjadi merah muda.

3. Gas generating kit dibuka dengan menggunting pojoknya, ditambah air

sebanyak 10 ml, dikocok, masukkan ke dalam anaerobic jar, segera

ditutup rapat-rapat.

4. Kalau sudah terjadi suasana anaerob, indikator yang tadinya berwarna

merah muda akan menjadi tidak berwarna (Putih)

5. Masuk inkubator 37oC 24-48 jam.

6) Pemeriksaan Angka Kuman aerob spora bakteri

A. Dasar teori

Prinsip dari pemeriksaan ini menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada

Plate Count Agar.Hitung angka kuman dilakukan pengenceran bertingkat

bertujuan agar koloni tiap plate dapat dihitung.Tahap akhir, jumlah koloni dari tiap

plate dikali dengan pengenceran dan dicari rata-rata dari semua plate.Nilai yang

didapat adalah Jumlah Angka Kuman dari Sampel yang di Periksa.

B. Alat-Alat:

1. Timbangan

2. Labu erlenmeyer berskala

56

3. Pipet takar

4. Cawan petri

5. Lampu spritus

6. Colony counter

7. Inkubator

C. Media dan reagensia:

1. Plate count agar/Glucose yeast extract agar

2. Quarter Strength Ringer Solution, air garam 0,85%

D. Cara pemeriksaan

1. Pengenceran sampel

a. Pada dasarnya pengenceran dilakukan terhadap sampel yang

diperkirakan jumlah kumannya banyak supaya dapat dihitung jmlah

koloni tiap-tiap platenya.

b. Pengenceran sampel padat:

1) Menimbang labu erlenmeyer steril

2) Mengambil smapel secara aseptis sebanyak 10 gram dan

dimasukkan ke dalam labu tersebut.

3) Ditambahkan pelarut sebanyak 100 ml lalu dihomogenkan

(pengenceran 10X).

4) Diambil 10 ml masuk tabung steril yang sudah berisi 9 ml pelarut

steril lalu dihomogenkan (pengenceran 100X).

5) Diambil 1ml masuk tabung steril yang sudah berisi 9 ml pelarut

steril lalu dihomogenkan (pengenceran 1000X).

57

6) Begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran yang

diperlukan.

c. Pengenceran sampel cair:

1) Sampel diambil dengan pipet takar sebanyak 10 ml masuk labu

erlenmeyer steril.

2) Ditambahkan pelarut sampai 100 ml llu dihomogenkan

(pengenceran 100X).

3) Begitu seterusnya hinggga didapatkan pengenceran yang

diperlukan.

2. Penuangan media Plate Count Agar

a. Masing-masing pengenceran sampel diambil 1ml dan dimasukkan ke

dalam cawan petri steril yang sudah diberi kode pengenceran sampel

dan lain-lain.

b. Dibuat kontrol dengan cawan petri steril yang diisi pelarut sebanyak

1ml.

c. Pada masing-masing cawan petri yang berisi sampel dituangi Plate

Count Agar suhu 450C-500C sebanyak 15-20 ml.

d. Didiamkan di atas meja sampai agar membeku.

e. Dikumpulkan lalu dibalik dan diinkubasi 370C selama 48 jam.

3. Perhitungan koloni

a. Jumlah koloni yang ideal dihitung pada tiap plate adalah antara 30-

300 cfu (colony form unit).

b. Koloni besar, kecil, dan menjalar berasal dari satu bakteri.

c. Perhitunan dapat dilakukan secara manual atau menggunakan

Colony Counter.

58

d. Dengan mengalkan pengencerannya dengan jumlah koloni akan

diperoleh angka/jumlah kuman per 1 gram atau 1 ml sampel yang

diperiksa.

4. Contoh perhitungan dan pelaporan

Perhitungan koloni pada plate, misalnya diperoleh angka

Nomor plate pengenceran Jumlah koloni

Angka kuman/gram-ml

1 1X 456 -2 10X 271 27003 100X 39 38004 1000X 8 -

Kontrol 1X 1 - Pelaporan:

Angka kuman/Total Plate Count (TPC) untuk sampel yang diperiksa:

= (271−1 ) x10+(39−1 ) x 100

2

=2700+3800

2

= 3250/gram-ml

7) Pemeriksaan bakteri coliform dengan metode MPN

Pengertian: tata cara laboratorium untuk memeperkirakan jumlah terdekat

bacteri coliform.

Tujuan : diagnosis

Prinsip: bacteri coliform yaitu bacteri golongan coli diperkirakan jumlahnya

dengan ditandai kemampuan bakteri tersebut menguraikan

lactose menjadi asam dan gas di dalam media Brilliant Green

Lactose Bile Broth bila diinkubasi suhu 370C 48 jam.

Sampel: makanan, air minum, air limbah

59

Prosedur:

a. Mempersiapkan alat dan bahan yang digunakan

1) Alat:

a) tabung Reaksi + rak

b) Pipet Ukur

c) Safety Ball

d) Lampu Bunsen

e) Inkubator

2) Bahan :

a) Media LB single strength

b) Media LB Triple strength

c) Media BGLB

b. Ragam LB yang digunakan

1) Ragam I : 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml

Untuk specimen yang sudah diolah atau yang angka kumannya

diperkirakan rendah.

a) Specimen cair atau yang dilarutkan ditanam didalam :

5 tabung Lactose Broth Triple Strength masing – masing 10 ml

1 tabung Lactose broth Single Strength, 1 ml

1 tabung Lactose Broth Single Strength, 0,1 ml

Dimasukkan dalam incubator pada suhu 370C selama 48 jam.

b) Tiap tiap tabung Lactose Broth (LB) yang menunjukkan positif gas,

ditanam pada Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB). Kemudian


60

c) Dibaca dan dicatat BGLB yang menunjukkan positif gas, masing-

masing ditanam pada media Mac Concay Agar/Endo Agar/Eosin

Methylen Blue Agar/tergitol 7 Agar Plate. Dimasukkan dalam

incubator pada suhu 370C selama 24 jam. Untuk mendapatkan

index MPN Coliform, Digunakan Tabel MPN berdasarkan tabung-

tabung BGLB yang positif gas.

d) Koloni yang tersangka E. Coli ditanam pada SIM/MIO/MIU (untuk

mengetahui produksi indol) dan Simmon Citrat (untuk mengatahui

kemampuan bakteri dengan citrate sebagai sumber karbon) serta

TSI agar. Dimasukkan dalam incubator pada suhu 370C selama 24

jam.

e) Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media TSI, SIM dan SC

untuk memastikan apakah E. Coli atau bukan. Kemudian dicari

pada table MPN untuk menentukan index MPN E. Coli.

2) Ragam II : 5 x 10 ml, 5 x 1 ml, 5 x 0,1 ml.

Untuk specimen yang belum diolah atau yang angka kumannya

diperkirakan tinggi.

Yang biasa diperiksa dengan cara ini ialah sumur, gali, air mata air, air

sungai, air hujan, air kolam renang, dsb.

a) Specimen air tanpa diencerkan ditanam dalam media:

5 tabung Lactose Broth Triple Strength masing – masing 10 ml

5 tabung Lactose broth Single Strength, 1 ml

5 tabung Lactose Broth Single Strength, 0,1 ml


61

b) Lactose Broth (LB) yang menunjukkan positif gas, ditanam pada

Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB) masing-masing 2 tabung.

Satu seri BGLB diinkubasikan pada suhu 370C selama 48 jam dan

satu seri diinkubasikan pada suhu 44-44,50C selama 24 jam.

c) Pada waktunya dibaca dan dicatat berapa tabung BGLB yang (+)

gas dari masing-masing kelompok penanaman. Angka-angka yang

diperoleh dicocokan dengan table MPN untuk memperoleh index

MPN coliform (inkubasi 370C 48 jam) dan index MPN coliform tinja

(inkubasi 44-44,50C 24 jam)

8) Pemeriksaan Sensitivitas

a. Pengertian

Tata cara pemeriksaan untuk menguji kepekaan kuman terhadap

antibiotika dari sampel urine, faeses, darah, pus dan sebagainya

b. Tujuan

Diagnosa

Pemantauan pengobatan

c. Metode

Kirby Bauer cara difusi

d. Sampel

Kuman murni dari pertumbuhan sampel mikrobiologi

e. Evaluasi

1) Suatu jenis kuman dikatakan sensitif terhadap antibiotik tertentu

apabila memiliki zona hambatan antibiotik yang nilainya lebih

62

dari atau sama dengan kriteria pada tabel zona hambatan

standar

2) Suatu jenis kuman dikatakan resisten terhadap antibiotik

tertentu apabila zona hambatan antibiotiknya kurang dari

kriteria pada tabel yang dimaksud

63

f. Alat

1) Ose

2) Lampu spiritus

3) Inkubator 37oC

4) Petri disc

5) Pinset

6) Dispenser disc

7) Lidi kapas

8) Timbangan

9) Erlenmeyer

10) Gelas ukur

11) Tabung reaksi

g. Reagensia

1) BaCl2 0.048 M

2) H2SO4 0.18 M

3) NaCl 0.85%

4) Singel Antibiotic Disc

5) Muller Hinton agar

6) Caso Broth

h. Prosedur

1) Preparasi sampel

a) Menyiapkan Muller Hinton Agar dan antibiotic disc

b) Membuat suspensi kuman setara dengan standar Mac

Farland 106 – 107

c) BaCl2 0,048 M + 99,5 ml H2SO4 0,18 M

64

d) Mengambil 2 – 3 koloni kuman, melarutkan dengan NaCl

0,85% steril dalam tabung, samakan dengan standar Mac

Farland. Jika Kurang tambah koloni, jika lebih tambah NaCl

0,85%

e) Mengambil 2-3 koloni, memasukkan ke dalam media Caso

Broth tabung, menginkubasi 370C selama beberapa jam (2-

4jam), menyamakan dengan standar Mac Farland.

2) Melakukan pemeriksaan

a) Hari I

Inokulasi suspensi kuman pada permukaan Muller

Hinton Agar (diameter 15 cm) 2-3 kali dengan lidi

kapas

Menempeli antibotic disc dengan jarak minimal 2 cm.

Antibiotik disesuaikan dengan jenis kuman seperti

dibawah ini:

Antibiotik untuk jenis kuman Gram (-) :

Erytromicin, Cloxacyllyn, Oxacilin, Sterptomicine,

Methicilin, Vancomycin, Clindamycin, Penisilin G,

Teteacyclin, Cephalotin, Chlorampenicol,

Gentamycin, Amikasin, Cotromoxazole.

Antibiotik untuk jenis kuman Gram (+) : Amikasin,

Gentamycin, Cotrimoxazole, Amphicilin, Amoxilin,

Tetracyclin, Cephalotin, Clhoramphenicol,

Cefuroxime, Tobramycin, Kanamycin, Imipenem,

Fosmicin, Cefamandole, Carbanicillin.

65

Untuk sampel urine ditambah Norfloxasin,

Nitrofurantoin, Nalidic Acid

Menginkubasi 370C 24 jam.

b) Hari II

Baca zone hambatan antibiotik (ukur dengan jangka

sorong)

Cocokkan dengan tabel interpretasi zone

ZONE

HAMBATAN

JENIS ANTIBIOTIK

≥12 Vancomycin, Penicilin Blue

≥13 Baccitrosin

≥14 Metocylin, Ampicylin (untuk bakteri

lain)

≥15 Streptomycin, Gentamycin,

Tobramycin, Flaxacylin, Togozite

≥16 Suffametozazole, Trimethropine,

Meronem, Ofloxazin

≥17 Nitroferantoin, amikosin,

Clindamycin, Cefram, Sulfanilamid

≥18 Kanamicyn, Eritromicyin,

Chloramphenicol, Cefamandole,

Amoxilin, Ampicylin (untuk

Staphilococcus)

≥19 Cefron (jenis Streptococcus)

≥29 Penicilin (bakteri lain)

≥27 Cefron (jenis Streptococcus)

≥22 Penicilin (bakteri lain)

≥21 Cefron (selain Streptococcus)

≥23 Carbemicylin, Cefotoxin (Proteus,

E.Coli)

≥17 Carbemicylin (Pseudomonas)

bab iv. jenis kegiatan (perlu edit)

Documents