33

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian dalam penelitian ini menggunakan rancangan

eksperimental dengan Post Test Only Control Group Design. Desain ini

menggunakan 2 kelompok subyek, kelompok satu diberi perlakuan

eksperimental (kelompok eksperimen) dan yang lain tidak diberi perlakuan

(kelompok kontrol). Dari desain ini efek suatu perlakuan terhadap variabel

dependen akan dilakukan pengujian dengan cara membandingkan keadaan

variabel dependen pada kelompok eksperimen dengan kelompok kontrol.

1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada Juni–Desember 2014, bertempat di

Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas

Padjadjaran dalam proses pembuatan ekstrak. Perawatan dan perlakuan

sampel bertempat di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran

Universitas Lampung. Pemeriksaan histopatologis pada sel epitel

lambung tikus putih jantan galur Sprague dawley dilakukan di Balai

Veteriner Bandar lampung.

34

B. Sumber Data

Berdasarkan rancangan penelitian, maka sampel (tikus) dalam penelitian ini

berjumlah 30 ekor dan dibagi dalam lima kelompok yang tidak berpasangan,

yaitu satu kelompok kontrol dan empat kelompok perlakuan. Kelompok

kontrol mendapat pemberian akuades. Kelompok pertama dikenai perlakuan

pemberian ekstrak daun sambung nyawa sebanyak 500 mg/kgBB, kelompok

kedua dikenai perlakuan pemberian ekstrak daun sambung nyawa sebanyak

1000 mg/kgBB, kelompok ke-3 dikenai perlakuan pemberian ekstrak daun

sambung nyawa sebanyak 1500 mg/kgBB dan kelompok ke-4 dikenai

perlakuan pemberian ekstrak daun sambung nyawa sebanyak 2000

mg/kgBB (Gofur et al., 2009).

1. Besar Sampel

Untuk menghitung jumlah sampel yang akan diuji, dapat menggunakan

rumus federer sebagai berikut:

Dari rumus di atas diketahui perhitungan besaran sampel sebagai

berikut: t = 5, maka didapatkan:

(n-1)(t-1) ≥ 15

(n-1)(5-1) ≥ 15

(n-1)4 ≥ 15

(4n-4) ≥ 15

4n ≥ 19

(n-1)(t-1) ≥ 15

35

n ≥ 19/4

n ≥ 4.75

n ≥ 5

Dari hasil perhitungan tersebut diketahui bahwa sampel yang digunakan

pada penelitian ini berjumlah 5 ekor per kelompok. Maka jumlah sampel

yang digunakan unutuk percobaan ini adalah sebanyak 25 ekor tikus.

Untuk menghindari drop out pada sampel ditambahkan sehingga jumlah

sampel menjadi 6 ekor per kelompok. Jadi jumlah sampel seluruhnya

adalah 30 ekor.

2. Kriteria sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih jantan

(Sprague dawley) yang memenuhi kriteria sebagai berikut:

Kriteria inklusi:

a. Tikus putih jantan dewasa (Sprague dawley)

b. Umur 8 minggu

c. Berat badan tikus 180 – 200 gram

d. Kesehatan umum baik

Kriteria ekslusi: Tikus sakit

Kriteria drop out: Tikus mati saat penelitian

C. Identifikasi Variabel

1. Variabel Bebas: Ekstrak daun sambung nyawa 500 mg/kgBB, 1000

mg/kgBB, 1500 mg/kgBB, 2000 mg/kgBB.

36

2. Variabel Tergantung: Gambaran histopatologis lambung tikus putih.

3. Variabel terkendali:

a. Galur tikus: Tikus putih (Sprague dawley)

b. Umur tikus: 8 minggu

c. Jenis kelamin tikus: Jantan

d. Berat badan tikus: 180 - 200 gram

e. Jenis makanan tikus: Pellet broiler-11 dan air

37

D. Definisi Operasional

Tabel 1. Definisi operasional

Variabel Definisi Skala

Dosis ekstrak

etanol 96 %

daun sambung

nyawa

Gambaran

histopatologi

lambung tikus

Dosis efektif tengah ekstrak etanol daun

sambung nyawa adalah 200 mg/KgBB.

Kelompok I (kontrol negatif)=pemberian

aquadest

Kelompok II (perlakuan coba)=pemberian

ekstrak etanol daun sambung nyawa 500

mg/KgBB

Kelompok III (perlakuan coba)=pemberian

ekstrak etanol daun sambung nyawa 1000

mg/KgBB.

Kelompok IV (perlakuan

coba)=pemberian ekstrak etanol daun

sambung nyawa 1500 mg/KgBB

Kelompok V (perlakuan coba)=pemberian

ekstrak etanol daun sambung nyawa 2000

mg/KgBB.

Gambaran kerusakan lambung tikus dilihat

dengan melakukan pengamatan sediaan

histopatologi menggunakan mikroskop cahaya

dengan perbesaran 40x pada 10 lapang

pandang, kerusakan lambung ditandai dengan

adanya deskuamasi, erosi epitel mukosa, dan

ulserasi epitel lambung. Kerusakan tiap

lapangan pandang dinilai berdasarkan skor

Barthel Manja

0. Tidak ada perubahan patologis

1. Kongesti pembuluh darah

2. Inflamasi

3. Degenerasi sel epitel (Astri et al.,

2012).

Ordinal

Numerik

38

E. Bahan dan alat penelitian

1. Bahan – bahan yang diperlukan untuk penelitian ini adalah:

1. Tikus putih jantan galur Sprague dawley

2. Ekstrak daun sambung nyawa (500 mg/kgBB, 1000 mg/kgBB,

1500 mg/kgBB, 2000 mg/kgBB)

3. Pakan standar mencit

4. Aquadest

5. Bahan untuk pembuatan preparat histopatologi

2. Alat – alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:

1. Kandang mencit dan perlengkapannya

2. Sonde lambung

3. Seperangkat alat bedah minor untuk pengambilan organ tikus

4. Alat untuk pembuatan preparat histopatologi

5. Mikroskop

F. Jalannya Penelitian

1. Metode Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sambung nyawa

Daun sambung nyawa dibersihkan dengan air mengalir dan setelahnya

ditiriskan. Kemudian dijemur dengan ditutupi kain berwarna gelap

untuk menghindari kontak langsung dengan matahari. Setelah

didapatkan daun yang kering, kemudian daun dibuat serbuk dan diayak

hingga diperoleh serbuk daun sambung nyawa. Sebanyak 500 gram

39

serbuk diekstrak dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol

96% sebanyak 1,5 L. Pengadukan dilakukan sebanyak dua kali yaitu

pada pagi dan sore hari, setelah 3 x 24 jam dilakukan penyaringan.

Ampas proses tersebut kembali dimaserasi dengan pelarut etanol 96%

sebanyak 1,5 L. Proses maserasi dilakukan sebanyak tiga kali. Filtrat

yang diperoleh dikumpulkan kemudian diendapkan, lalu disaring untuk

selanjutnya diuapkan dengan pengurangan tekanan menggunakan

rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental (Gofur et al., 2009).

2. Prosedur Pemberian Dosis Ekstrak Daun Sambung nyawa.

Penelitian yang telah dilakukan oleh Gofur et al. (2009), yang

menyatakan bahwa dosis 350 dan 700 mg/kgBB telah terbukti efektif

dalam menghambat pertumbuhan sel kanker maka dosis yang akan

digunakan pada penelitian diambil dari pertengahan dosis efektif yaitu

500mg/KgBB. Dosis untuk kelompok perlakuan kedua yang akan

digunakan yaitu 500mg/kgBB kemudian dosis kelompok perlakuan

ketiga hasil pengalian 2x dari dosis kedua, yaitu 1000 mg/kgBB,

sedangkan dosis kelompok perlakuan keempat adalah hasil pengalian

1,5x dari dosis kedua yaitu 1500 mg/kgBB, dan dosis kelompok

perlakuan kelima merupakan hasil pengalian 4x dosis kedua yaitu 2000

mg/kgBB (Gofur et al., 2009).

a. Dosis untuk tiap tikus kelompok II

500 mg/KgBB x 0,2 Kg(berat tikus) = 100 mg

b. Dosis untuk tiap tikus kelompok III

40

1000 mg/KgBB x 0,2 Kg(berat tikus) = 200 mg

c. Dosis untuk tiap tikus kelompok IV

1500 mg/KgBB x 0,2 Kg(berat tikus) = 300 mg

d. Dosis untuk tiap tikus kelompok V

2000 mg/KgBB x 0,2 Kg(berat tikus) = 400 mg

Volume ekstrak etanol daun sambung nyawa diberikan secara peroral

sebanyak 1 ml yang merupakan volume yang boleh diberikan kepada

tikus mengingat bahwa volume maksimum dari lambung tikus adalah 3

sampai 5 ml. Apabila pemberian ekstrak melebihi volume maksimum

lambung tikus maka akan menyebabkan dilatasi lambung tikus akut

yang kemudian akan menyebabkan robeknya saluran cerna (Ngatidjan,

2006). Ekstrak etanol daum sambung nyawa akan disuspensikan dalam

aquades dengan suspensi agent CMC Na 0,5% kedalam mortir (Gofur

et al., 2009).

Larutan aquades yang perlu ditambahkan adalah sebanyak 200 ml,

maka ekstrak yang perlu ditambahkan adalah sebesar:

a. Untuk dosis 100 mg tiap 1 ml pada kelompok II

=

x = 20.000 mg

x = 20 gr

maka ekstrak yang perlu ditambahkan dalam 200 ml aquades

adalah 20 gr

b. Untuk dosis 200 mg tiap 1 ml pada kelompok III

41

=

X= 40.000 mg

X = 40 gr

maka ekstrak yang akan ditambahkan dalam 200 ml aquades

adalah sebanyak 40 gr.

c. Untuk dosis 300 mg tiap 1 ml (kelompok IV)

=

X= 60.000 mg

X = 60 gr

maka ekstrak yang akan ditambahkan dalam 200 ml aquades

adalah 60 gr.

d. Untuk dosis 400 mg tiap 1 ml (kelompok V)

=

X= 80.000 mg

X = 80 gr

maka ekstrak yang akan ditambahkan dalam 200 ml aquades

adalah 80 gr.

3. Pengamatan

Tikus dibagi menjadi 5 kelompok yang terdiri dari 6 ekor setiap

kelompoknya. Kelompok perlakuan pertama hanya diberi aquadest.

Kelompok perlakuan kedua dilakukan pemberian ekstrak daun

sambung nyawa sebanyak 500 mg/kgBB, kelompok perlakuan ketiga

42

dilakukan pemberian ekstrak daun sambung nyawa sebanyak 1000

mg/kgBB, kelompok perlakuan keempat dilakukan pemberian ekstrak

daun sambung nyawa sebanyak 1500 mg/kgBB, dan kelompok

perlakuan kelima diberi ekstrak sambung nyawa 2000 mg/kgBB.

Pemberian ekstrak pada kelompok perlakuan satu sampai dengan

empat adalah 3 kali dalam seminggu. Perlakuan tersebut dilakukan

selama 2 minggu. Pada hari keempat belas, semua hewan percobaan

dieliminasi dengan anastesi menggunakan chloroform. Selanjutnya

diproses dengan metode baku histologi, setelah itu dilakukan

pemeriksaan mikroskopis sesudah dilakukan pembuatan preparat

sesuai prosedur. Setiap mencit dibuat preparat lambung dan tiap

preparat dibaca dalam 5 lapangan pandang yaitu keempat sudut dan

bagian tengah preparat dengan perbesaran 100x dan 400x dengan

batasan jumlah sel 20 sel tiap lapang pandang. Sasaran yang dibaca

adalah perubahan struktur histologis mukosa yang mengalami erosi

pada lambung mencit karena sel epitel lambung peka terhadap

keadaan lingkungan pada lumen lambung.

G. Analisis data

Data yang diperoleh akan dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut

1. Analisis Deskriptif

2. Uji Shapiro-Wilk, uji ini untuk mengetahui apakah data sudah

terdistribusi secara normal atau belum. Uji ini dilakukan apabila jumlah

sampel <50. Apabila data belum terdistribusi secara normal, maka perlu

ditranformasikan terlebih dahulu.

43

3. Uji varians dengan Levene’s test. Uji ini bertujuan untuk menguji

apakah dua atau lebih kelompok data mempunyai varian data yang

sama atau tidak.

4. Uji Efek Perlakuan

Apabila data memenuhi syarat (terdistribusi normal dan varian data

sama) maka, digunakan uji statistik parametrik yaitu One Way Anova.

Jika variabel hasil transformasi tidak berdistribusi normal atau varians

tetap tidak sama, maka alternatifnya dipilih uji Kruskal-Wallis.

Jika pada uji One Way Anova menghasilkan nilai p<0,05, maka dilanjutkan

dengan melakukan analisis Least Significant Difference – test (LSD) Post

Hoc Test untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda secara

bermakna. Apabila menggunakan uji Kruskal-Wallis dan menghasilkan

nilai p <0,05, maka lanjutkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney

Test untuk melihat kelompok yang berbeda secara bermakna.

44

Gambar 7. Rancangan Penelitian.

Populasi

Sampel

Random

Alokasi

Kelompok

I kontrol

6 ekor

tikus putih

Perlakuan

pada

kelompok I

kontrol

diberikan

akuades 1

ml

Selama 2

minggu

kelompok II

perlakuan

6 ekor tikus

putih

Perlakuan

pada

kelompok

II (ekstrak

daun

sambung

nyawa 500

mg/kgBB)

selama 2

minggu

kelompok

III

perlakuan 6

ekor tikus

putih

Perlakuan

pada

kelompok III

(ekstrak

daun

sambung

nyawa 1000

mg/kgBB)

selama 2

minggu

kelompok

IV

perlakuan

6 ekor

tikus putih

Perlakuan

pada

kelompok

IV (ekstrak

daun

sambung

nyawa

1500

mg/kgBB)

selama 2

minggu

kelompok

V perlakuan

6 ekor tikus

putih

Perlakuan

pada

kelompok

V (ekstrak

daun

sambung

nyawa

2000

mg/kgBB)

selama 2

minggu

Fase Adaptasi 4-7 hari

Pada hari ke-14 mencit di terminasi dan kemudian dibuat preparat

histopatologis organ lambung

Analisis hasil

45

H. Etika Penelitian

Penelitian ini telah diajukan ke Komisi Etik Peneletian Kesehatan Fakultas

Kedokteran Universitas Lampung, dengan menerapkan perinsip 3R dalam

protokol, yaitu:

1. Replacement, adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan

sudah diperhitungkan secara seksama, baik dari pengamatan terdahulu

maupun literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak

dapat digantikan oleh mahluk hidup lain seperti sel atau biakan

jaringan.

2. Reduction diartikan sebagai pemanfaatan hewan dalam penelitian

sesedikit mungkin, tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal.

3. Refinement adalah memperlakukan hewan percobaan secara

manusiawi memelihara hewan dengan baik, tidak menyakiti hewan,

serta meminimalisasi perlakuan yang menyakitkan sehingga menjamin

kesejahteraan hewan coba sampai akhir penelitian (Ridwan, 2013).