Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB I

PENDAHULUAN

Dasar Teori

BAKTERI

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroorganisme:

1. Bakteri

2. Archaea

3. Jamur mikroskopis

4. Virus

5. Protozoa

6. Mikro algae

KLASIFIKASI MAKHLUK HIDUP

A. Metode Lama

1. Superkingdom Prokariota

a. Kingdom Monera (Eubacteria dan Archaeabacteria)

2. Kingdom Eukariota

b. Kingdom Protista : eukariota bersel tunggal terdiri dari 3 bagian

- Protophyta

- Protomycota

- Protozoa

c. Kingdom Fungi

1

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

d. Kingdom Plantae

e. Kingdom Animalia

B. Metode baru

1. Kingdom Prokariota

a. Domain Bacteria

b. Domain Archaea

2. Kingdom Eukariota

3. Domain Protista : protozoa, krisofita, slime molds (termasuk

Chromista) :diatomae, haptofita

4. Domain Fungi : fungi (kapang + khamir), lichenes

5. Domain Plantae : tumbuhan, algae, bryophytes,

6. Domain Animalia : (metazoa) hewan

Eubacteria

Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leeuwenhoek pada 1674

dengan menggunakan mikroskop buatannya sendiri. Istilah bacterium

diperkenalkan di kemudian hari oleh Ehrenberg pada tahun 1828, diambil dari

kata Yunani βακτηριον yang memiliki arti "small stick".Memiliki ciri, yaitu:

- Prokariotik Uniseluler

- Tidak ada intron pada genom

- Mempunyai peptidoglikan pada dinding sel

- Didasarkan pada cocci, bacilli, spirilla

- Membutuhkan nutrient dan melakukan respirasi

2

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Bereproduksi dengan membelah, konjugasi, transformasi, dan transduksi.

Prokariota tidak mempunyai membran inti ~ materi genetik terletak dalam

sitoplasma/nukleoid.

Archaebacteria

Memiliki ciri:

- Tidak mempunyai peptidoglikan pada dinding sel

- Membran sel mengandung lemak yang komplek dan tidak ditemukan pada

organisme lainnya.

- Gen-gen diinterupsikan melalui intron-intron

Klasifikasi dalam 3 kelompok :

1. Methanogens—gas beracun pada oksigen

2. Thermaphiles—hidup pada temperature yang tinggi atau extreme

3. Halophiles—hidup pada larutan saline

MORFOLOGI SEL BAKTERI

- Ukuran sel bakteri 0,2 –10 mm

- Antar jenis bakteri dapat dibedakan berdasarkan: bentuk, komposisi kimia,

kebutuhan nutrisi dan aktivitas biokimia.

- Secara umum bentuk sel bakteri dapat diamati dengan mikroskop cahaya

- Bentuk dasar sel bakteri terdiri atas 3 macam, yaitu ; coccus, bacil, dan spiral.

- Bakteri berkembang dengan pembelahan biner, sejumlah sel anak bergabung

membentuk kelompok = koloni

Berdasarkan berntuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:

a) Kokus (Coccus) dalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan

mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal

3

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua

o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar

o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus

o Staphylococcus, jika bergerombol

o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

b) Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder,

dan mempunyai variasi sebagai berikut:

o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua

o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

c) Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai

variasi sebagai berikut:

o Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran

o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran

Bentuk tubuh/morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan,

medium dan usia. Oleh karena itu untuk membandingkan bentuk serta ukuran

bakteri, kondisinya harus sama. Pada umumnya bakteri yang usianya lebih muda

ukurannya relatif lebih besar daripada yang sudah tua.

STRUKTUR SEL BAKTERI

1. Flagel

Flagel adalah bagian sel yang berbentuk seperti benang Ø 12-30 nm, umumnya

terdiri dari protein (flagelin) berfungsi sebagai: alat gerak bakteri. Flagel mudah

lepas, namun dapat tumbuh kembali dalam waktu 3-6 menit.

Monotrikh : flagel tunggal, terdapat pada ujung sel. Contoh: Vibrio

Lofotrikh : flagela lebih dari 1 disalah satu ujung sel. Contoh: Pseudomonas

4

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Amfitrikh : flagel satu atau lebih di kedua ujung sel. Contoh: B. cereus

Peritrikh : flagel terdapat di sekeliling sel. Contoh: Proteus

2. Filamen aksial

Memiliki struktur sama dengan flagel berfungsi sebagai alat gerak pada

Spirochaeta

3. Pili (Fimbria) diluar di dinding sel

Adalah rambut pendek, yang terdapat di seluruh badan sel biasanya

terdapat pada bakteri gram negative, berfungsi: - untuk adhesi bakteri dengan sel

tubuh hospes, faktor virulens konjugasi antar 2 bakteri, transfer plasmid dari sel

donor ke sel resifien.

4. Kapsul

Beberapa bakteri mensintesis polisakarida yang berkondensasi dan

membentuk lapisan disekeliling sel, pada medium agar, koloni bakteri berkapsul

akan terlihat berlendir. Bakteri berkapsul tahan terhadap efek fagositosis dan

faktor virulen.

5. Dinding sel

Komposisi senyawa kimia dinding sel :

Bakteri Gram positif :

Asam teikoat

Peptidoglikan lebih tebal (asam amino, N-asetilglukosamin, Asam

N-asetilmuramat)

Membran sitoplasma

5

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Bakteri Gram negatif :

Lipopolisakarida

Fosfolipid

Lipoprotein

Peptidoglikan lebih tipis

Membran sitoplasma

6. Membran sitoplasma

Membran sitoplasma berfungsi untuk mengatur keluar masuk zat kedalam dan

keluar sel

7. Nukleoid

Nukleoid tidak mempunyai membran inti dan nukleoid materi genetik: kromosom

tunggal

8. Ribosom

9. Mesosom dalam dinding sel

Mesosom terbentuk dari invaginasi membran plasma kearah dalam berperan

dalam pembelahan sel. Kromosom bakteri (DNA) melekat pada septal mesosom.

10. Spora

Spora dalam bentuk istirahat, bila keadaan lingkungan tidak menguntungkan:

kering, panas dan zat kimiawi. Bila lingkungan membaik bergerminasi kembali

membentuk sel vegetatif. Letak spora spora:terminal, subterminal dan sentral.

Peranan Bakteri

A. Bakteri yang menguntungkan:

Bakteri pengurai

6

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Bakteri saprofit menguraikan tumbuhan atau hewan yang mati, serta sisa-

sisa atau kotoran organisme. Bakteri tersebut menguraikan protein,

karbohidrat dan senyawa organik lain menjadi CO2, gas amoniak, dan

senyawa-senyawa lain yang lebih sederhana. Oleh karena itu keberadaan

bakteri ini sangat berperan dalam mineralisasi di alam dan dengan cara ini

bakteri membersihkan dunia dari sampah-sampah organik.

Bakteri nitrogen

Bakteri nitrogen adalah bakteri yang mampu mengikat nitrogen bebas dari

udara dan mengubahnya menjadi suatu senyawa yang dapat diserap oleh

tumbuhan. Karena kemampuannya mengikat nitrogen di udara, bakteri-bakteri

tersebut berpengaruh terhadap nilai ekonomi tanah pertanian. Kelompok

bakteri ini ada yang hidup bebas maupun simbiosis. Bakteri nitrogen yang

hidup bebas yaitu Azotobacter chroococcum, Clostridium pasteurianum, dan

Rhodospirillum rubrum. Bakteri nitrogen yang hidup bersimbiosis dengan

tanaman polong-polongan yaitu Rhizobium leguminosarum, yang hidup dalam

akar membentuk nodul atau bintil-bintil akar. Tumbuhan yang bersimbiosis

dengan Rhizobium banyak digunakan sebagai pupuk hijau seperti Crotalaria,

Tephrosia, dan Indigofera. Akar tanaman polong-polongan tersebut

menyediakan karbohidrat dan senyawa lain bagi bakteri melalui

kemampuannya mengikat nitrogen bagi akar. Jika bakteri dipisahkan dari

inangnya (akar), maka tidak dapat mengikat nitrogen sama sekali atau hanya

dapat mengikat nitrogen sedikit sekali. Bintil-bintil akar melepaskan senyawa

nitrogen organik ke dalam tanah tempat tanaman polong hidup. Dengan

demikian terjadi penambahan nitrogen yang dapat menambah kesuburan

tanah.

Bakteri usus

Bakteri Entamoeba coli hidup di kolon (usus besar) manusia, berfungsi

membantu membusukkan sisa pencernaan juga menghasilkan vitamin B12,

dan vitamin K yang penting dalam proses pembekuan darah. Dalam organ

7

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

pencernaan berbagai hewan ternak dan kuda, bakteri anaerobik membantu

mencernakan selusosa rumput menjadi zat yang lebih sederhana sehingga

dapat diserap oleh dinding usus.

1. Bakteri fermentasi

Beberapa makanan hasil fermentasi dan mikroorganisme yang berperan:

No.Nama produk atau

makanan

Bahan

bakuBakteri yang berperan

1. Yoghurt susuLactobacillus bulgaricus dan

Streptococcus thermophilus

2. Mentega Susu Streptococcus lactis

3. Terasi Ikan Lactobacillus sp.

4. Asinan buah-buahanbuah-

buahanLactobacillus sp.

5. Sosis daging Pediococcus cerevisiae

6. Kefin SusuLactobacillus bulgaricus dan

Srteptococcus lactis

2. Bakteri penghasil antibiotik

Antibiotik merupakan zat yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan

mempunyai daya hambat terhadap kegiatan mikroorganisme lain. Beberapa

bakteri yang menghasilkan antibiotik adalah :

8

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Bacillus brevis , menghasilkan terotrisin

Bacillus subtilis , menghasilkan basitrasin

Bacillus polymyxa , menghasilkan polimixin

B. Bakteri Merugikan

Bakteri perusak makanan

Beberapa spesies pengurai tumbuh di dalam makanan. Mereka mengubah

makanan dan mengeluarkan hasil metabolisme yang berupa toksin (racun).

Racun tersebut berbahaya bagi kesehatan manusia. Contohnya :

Clostridium botulinum , menghasilkan racun botulinin, seringkali terdapat

pada makanan kalengan (botox)

Pseudomonas cocovenenans , menghasilkan asam bongkrek, terdapat pada

tempe bongkrek

Leuconostoc mesenteroides , penyebab pelendiran makanan

Bakteri patogen

Merupakan kelompok bakteri parasit yang menimbulkan penyakit pada

manusia, hewan dan tumbuhan. Bakteri penyebab penyakit pada manusia:

No. Nama bakteri Penyakit yang ditimbulkan

1. Salmonella typhosa Tifus

2. Shigella dysenteriae Disentri basiler

3. Vibrio comma Kolera

9

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

4. Haemophilus influenza Influensa

5. Diplococcus pneumoniae Pneumonia (radang paru-paru)

6. Mycobacterium tuberculosis TBC paru-paru

7. Clostridium tetani Tetanus

8. Neiseria meningitis Meningitis (radang selaput otak)

9. Neiseria gonorrhoeae Gonorrhaeae (kencing nanah)

10. Treponema pallidum Sifilis atau Lues atau raja singa

11. Mycobacterium leprae Lepra (kusta)

12. Treponema pertenue Puru atau patek

Dekomposisi

Bakteri bekerja secara terstruktur dalam proses degradasi organisme

atau proses pembusukan mayat. Proses pembusukan berawal dari

mikroorganisme, misalnya bakteri-bakteri yang hidup di dalam usus besar

manusia. Bakteri tersebut mulai mendegradasi protein yang terdapat dalam

tubuh. Jika seluruh jenis ikatan protein sudah terputus, beberapa jaringan

tubuh menjadi tidak berfungsi. Proses ini disempurnakan bakteri yang datang

dari luar tubuh mayat, bisa berasal dari udara, tanah, ataupun air. Seluruh jenis

bakteri ini menyerang hampir seluruh sel di tubuh dengan cara menyerang

sistem pertahanan tubuh yang tidak lagi aktif, menghancurkan jaringan otot,

atau menghasilkan enzim penghancur sel yang disebut protease. Kemudian

dengan berbagai jenis metabolisme, mikroorganisme mulai memakan jaringan

10

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

mati dan mencernanya. Tak jarang kerja proses ini dibantu reaksi kimia alami

yang terjadi dalam organisme mati.

Bakteri heterotrof

Tidak semua mikroorganisme mampu mendegradasi mayat.

Kebanyakan mereka berasal dari jenis bakteri heterotrof. Bakteri ini

membutuhkan molekul-molekul organik dari organisme lain sebagai nutrisi

agar ia dapat bertahan hidup dan berkembang biak. Berbeda dengan bakteri

autotrof yang mampu menghasilkan makanan sendiri dengan CO2 sebagai

nutrisi makro serta bantuan dari cahaya matahari atau sumber energi kimia

lainnya.

Jenis bakteri heterotrof biasanya hidup dan berkembang biak pada

organisme mati. Mereka mendapatkan energi dengan menguraikan senyawa

organik pada organisme mati. Molekul-molekul besar seperti protein,

karbohidrat, lemak, atau senyawa organik lain didekomposisi metabolisme

tubuh bakteri tersebut menjadi molekul-molekul tunggal seperti asam amino,

metana, gas CO2, serta molekul-molekul lain yang mengandung enam nutrisi

utama bakteri, yaitu senyawa-senyawa karbon (C), hidrogen (H), nitrogen (N),

oksigen (O), fosfor (P), serta sulfur (S).

Gram-negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara

bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal

(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri

gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan

perbedaan struktur dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti

mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan

11

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan

lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

Media Pertumbuhan Mikroorganisme

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi,

memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah

mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan

menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media.

Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam

mikrobiologi.

Lactose Broth

Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran

koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-

enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi

laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan

nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber

karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan

dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose

broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5%

laktosa.

EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung

laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan

laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang

memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap

dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya

tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam

perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap

awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella

12

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk

mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.

Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk

menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung.

EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator

memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan

yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri

koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui

jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal

dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan

terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri

coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

Nutrient Agar

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA

juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak

selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media

sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan

salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti

uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk

pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam

kultur murni. Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton

10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan

komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit.

Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Nutrient Broth

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk

cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara

sebagai berikut.

1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air destilasi/aquadest.

13

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah

pertama.

3. Atur pH sampai 7,0.

4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

5. Sterilisasi dengan autoklaf.

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan

Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis

Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat,

asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak

sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS

agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis

Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:

1. Protein dari kasein 10 g/L

2. Ekstrak daging 8,0 g/L

3. Ekstrak ragi 4,0 g/L

4. D (+) glukosa 20 g/L

5. Magnesium sulfat 0,2 g/L

6. Agar-agar 14 g/L

7. dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L

8. Tween 80 1,0 g/L

9. Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L

10. Natrium asetat 5 g/L

14

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

11. Mangan sulfat 0,04 g/L

Plate Count Agar (PCA)

PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi

di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein

enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk

suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu

121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis

mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic

hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek

lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

Pewarnaan

Bakteri merupakan organisme yang sanggat kecil yaitu rata2 berukuran

lebar 0,5 – 1 mikron dengan panjang hingga 10 mikron. Akibatnya pada

mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian bagiannnya. Untuk

melihat bakteri dengan jelas perlu dilakukan proses pewarnaan (Koes

Irianto ,2006)

Pewarnaan secara sederhana berarti mewarnai suatu mikroorganisme

dengan suatu zat warna yang memperjelas suatu struktur tertentu. Sebelum suatu

mikroorganisme dapat diwarnai, mikroorganisme tersebut harus difiksasi terlebih

dahulu pada object glass. Proses fiksasi ini secara langgsung mematikan

mikroorganisme tersebut dan melekatkannya pada object glass. Proses ini

dilakukan dengan mengoleskan spesimen yang akan difiksasi pada object glass

kemudian dibiarkan kering diudara. Dapat juga dilakukan dengan melewatkan

object glass tersebut pada api beberapa kali (olesan menghadap ke atas) atau

dengan menutupi olesan tersebut dengan metil alkohol selama 1 menit. Tanpa

adanya fiksasi ini, zat warna akan melenturkan olesan mikroba dari object glass.

(Tortora , Funke & case , 2007)

Zat warna merupakan garam yang terdiri dari ion positif dan ion negatif

dimana salah satu komponen tersebut berwarna dan disebut kromofor. Terdapat

15

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

dua macam zat warna berdasarkan komponen warnanya. (Tortora , Funke & case ,

2007)

Zat warna alkali yaitu bila komponen warnanya adalah ion positif

misalnya kristal violet, biru.

Zat warna asam yaitu bila komponen warnanya adalah ion negatif

misalnya eosin, fuchsin asam, dan nigrosin.

Pada PH 7, bakteri bermuatan negatif sehingga komponen warna positif

pada zat warna alkali terserap oleh dinding sel bakteri yang bermuatan

negatif. Zat warna asam tidak terserap pada dinding sel bakteri sebab

mempunyai muatan yang sama sehingga kompleks warna unggu kristal

pada waktu pembiasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh

pewarna tandingan (sel – sel tampak merah muda).

Diklasifikasikan sebagai gram negatif (Hardioetomo , 1985)

Sifat Bakteri gram positif Bakteri gram negtif

Lapisan peptidoglikan Lebih tebal Lebih tipis

Kadar lipid 2 – 4 % 15 – 20 %

Resistensi terhadap alkali Tidak larut Larut

Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

Sifat tahan asam Ada yang tahan

asam

Tidak ada yang tahan

asam

Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka

Kepekaan terhadap

streptomisn

Kurang peka Lebih peka

Digesti oleh enzim preteolitik Lebih tahan Kurang tahan

Kebutuhan nutrisi Lebih kompleks Lebih sederhana

Berbagai macam penyelidikan telah dilakukan dalam usaha menerangkan

mekanisme pengecatan gram, namun sampai saat ini mekanismenya belum dapat

dimengerti sepenuhnya. Terdapat tiga macam teori yang telah diusulkan untuk

16

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

menjelaskan mekanisme ini. Perbedaan permeabilitas terdapat kelarutan kompleks

zat warna iodin diusulkan oleh benians; perbedaan terhadap titik isoelektrik pada

komposisi sel antara bakteri gram positif dan gram negatif diusulkan oleh stearn

dan stearn dengan asumsi bahwa titik isoelektrik pada bakteri gram positif

menghasilkan komplekls yang lebih stabil dengan pewarna primer dan kemudian

diusulkan oleh churchman bahwa reaksi gram terjadi pada lapisan luar atau

korteks dari sel sedangkan materi internal adalah gram negatif pada tiap bakteri.

(Burrows, 1959)

Reaksi gram bukanlah merupakan suatu ketentuan yang mutlak. Reaksi ini

dapat berubah menurut umur biakan, PH, dan sebab – sebab lain. Menurut

Bartholomew dan Mittwer (1952 ), sinar ultraviolet dari 2537 Angstrom

menyebabkan organisme gram negatif, maka besar kemungkinan sinar – sinar

ultraviolet itu mempunyai pengaruh destruktif terhadap sel – sel mikroorganisme

tersebut. (Koes Irianto , 2006)

Faktor – faktor yang juga dapat menimbulkan keragaman dalam reaksi Gram

ialah (Hadioetomo , 1985)

Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan

Kerapatan sel pada olesan

Konsentrasi dan umur reagen – reagen yang digunakan untuk pewarnaan

gram

Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucatan yang dipakai dan

Sejarah biakan

Sejarah biakan yang dimaksud di atas meliputi umur biakan secara

keasaman atau alkalinitas (pH) kemudian tempat bakteri yang bersangkutan

ditumbuhkan. Biakan organisme gram positif yang lebih tua (terutama bila

memperhatikan autolitas) dan yang ditumbuhkan dalam medium asam

seringkali tampak gram negatif atau gram variabel (artinya biakan yang sama

menampakan sel–sel baik gram positif maupun gram negatif). Hal ini

berkaitan dengan permeabilitas dinding sel pada biakan tua yang

17

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

menyebabkan hilangnya sifat gram positif. Tetapi organisme gram negatif

tidak menjadi gram positif terlepas dari umur atau medium yang

dipergunakan. (Hadiotomo , 1985)

Pewarnaan tahan asam ( Acid Fast Staining )

Salah satu metode pewarnaan diferensial lain yang penting adalah

pewarnaan tahan asam yang hanya berikatan kuat pada bakteri yang memiliki

lapisan lilin pada dinding selnya. Mikrobiologis menggunakan pewarnaan ini

untuk mengidentifikasi genus Mycrobacterium termasuk Mycrobacterium

tubercolosis, penyebab tuberkolosis dan Mycobacterium leprae, penyebab lepra.

Pewarnaan ini juga digunakan untuk mengidentifikasi patogen dari genus

Nocardia. (Tortora, Funke & Case, 2007)

Teknik pewarnaan ini mula–mula dikembangkan oleh Paul Ehrlicl pada

tahun 1882 ketika meneliti M. Tuberculosis. Prosedur pewarnaan yang umum

digunakan pada masa kini merupakan hasil perbaikan teknik Ehrlich yang asli ,

yaitu pewarnaan Ziebl – Neelsen, dinamakan menurut kedua orang peneliti yang

mengembangkannya pada akhir 1880-an. Prosedur ini menggunakan pewarnaan

utama dengan pemanasan dan biru metilena Loeffler sebagai pewarna tandingan.

Pada modifikasi teknik ini yang dikembangkan kemudian, perlakuan panas diganti

dengan pembasah (suatu detergen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak)

untuk menjamin penetrasi, pewarna yang mengandung bahan pembasah ini

disebut pewarna Kinyoun. (Hadioetomo , 1985)

Pada prosedur pewarnaan tahan asam, oleskan bakteri yang telah difiksasi

diberi pewarna merah carbolfuchsin dan dipanaskan selama beberapa menit

(pemanasan meningkatkan penetrasi dan retensi zat warna). Kemudian olesan

tersebut dicuci dengan air lalu didekolorisasi dengan alkohol asam yang akan

melunturkan warna merah dari bakteri yang tidak tahan asam. Bakteri tahan asam

18

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

mempertahankan warna merah dari carbolfuchsin karena carbolfuchsin lebih

mudah larut dalam lemak dinding sel daripada alkohol asam. Pada bakteri tidak

tahan asam yang memiliki kandungan lipid yang sedikit, carbolfuchsin dengan

cepat hilang pada proses dekolorisasi dan membuat bakteri tersebut tidak

berwarna sampai diberi warna tandingan biru pada akhir prosedur. (Tortora ,

Funke & Case , 2007)

Pewarnaan khusus

Pewarnaan khusus digunakan untuk mewarnai dan mengisolasi bagian

spesifik dari suatu mikroorganisme, misalnya endospora dan flagela atau untuk

menunjukan adanya kapsul. (Tortora , Funke & Case , 2007)

Macam – macam pewarnaan khusus antara lain :

1. Pewarnaan Granula Metakromatik

Di antara bakteri bentuk batang gram positif, ada yang dalam sel

nya ditemukan granulasi polifosfat yang disebut yang granula

metakromatik atau volutin bodies. Granula ini bersifat kromofil dan

metakromatik yang berarti memiliki aktivasi kuat terhadap zat –zat warna

dan seringkali tampak berwarna lain dari zat yang diberikan misalnya pada

Corynebacterium diphteriae. (Koes Irianto, 2006)

Pewarnaan Neisser

Pewarnaan ini menggunakan tiga macam zat warna yaitu Neisser A

(biru metilen), Neisser B (kristal violet), dan Neisser C (Krisoidin atau

Bismarck brown) hasil dari pewarnaan adalah warna biru hitam pada

granula dan warna kuning (Krisoidin) atau tengguli (Bismarck brown)

pada sitoplasma .

Pewarnaan Albert

Prosedur dilakukan dengan mewarnai preparat menggunakan zat

warna Albert selama 3-5 menit kemudian dicuci dengan air dan diberi

larutan iodium selama 1 menit. Hasil pewarnaan ini warna biru–hitam

pada granul dan warna hijau pada sitoplasma .

19

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

2. Pewarnaan Negatif Kapsul

Pewarnaan kapsul lebih sulit dilakukan dibanding pewarnaan

lainya sebab materi penyusun kapsul larut dalam air dan dapat hilang pada

penyucian. Untuk menunjukan adanya kapsul, mikrobiologis mencampur

bakteri dalam suatu suspensi zat warna (biasanya tinta india atau nigrosin)

untuk membuat latar yang gelap kemudian bakteri tersebut diwarnai

dengan pewarnaan sederhana misalnya safranin. Karena susunan

kimianya, kapsul tidak menyerap zat warna sehingga tampak sebagai

daerah kosong di sekitar sel bakteri yang berwarna. (Tortora, Funke &

Case , 2007)

3. Pewarnaan Flagela

Flagela bakteri merupakan alat pergerakan bakteri yang sangat

kecil untuk dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan.

Prosedur pewarnaanya menggunakan pemantek (mordant) dan zat warna

carbolfuchsin. Mikrobiologis menggunakan jumlah dan susunan flagela

sebagai bantuan diagnosa. (Tortora, Funke & Case , 2007)

4. Pewarnaan spora

Jenis-jenis bakteri tertentu yang tergolong ke dalam genus Bacillus

dan Clostridium, membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempat –

tempat yang khas, disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup

dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas dan unsur –

unsur fisik lainya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta

terhadap bahan–bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang

dapat membentuk spora. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya

selubung spora yang tebal dan keras. (Hadioetomo, 1985)

Endospora tidak dapat diwarnai dengan cara biasa misalnya dengan

pewarnaan sederhana gram sebab zat warna tidak dapat menembus dinding

endospora tersebut. Cara yang umum digunakan dalam mewarnai

endospora adalah metode Schaeffer – Fulton. Pada pewarnaan ini,

pewarna utama, Malachite green diberi pada olesan bakteri yang telah

difiksasi dan dipanaskan selama sekitar 5 menit. Pemanasan ini membantu

20

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

penetrasi zat warna pada dinding endospora. Kemudian olesan tersebut

dicuci dengan air yang akan melunturkan malachite green dari semua

bagian sel kecuali endospora lalu diberi pewarna tandingan yaitu safranin

yang akan mewarnai bagian sel tersebut. Saat dilihat dengan mikroskop

cahaya, endospora tampak berwarna hijau dalam sel vegetatif yang

berwarna merah muda. (Tortora, Funke & Case , 2007)

Dari pengamatan ini dapat juga diketahui letak dari endospora

tersebut misalnya di bagian di bagian tengah sel (center), di ujung sel

(terminal), atau berada diantara bagian tengah dan ujung dari sel

(subterminal). (Burrows, 1959)

Bakteri lebih sering di amati dalam olesan terwarnai dari pada

dalam keadaan hidup. Yang dimaksud bakteri terwarnai adalah organisme

yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah lihat dan

dipelajari. Pada umumnya olesan bakteri terwarnai mengungkapkan

ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan

21

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

butiran. Zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat baik kapsul atau

flagella, maupun hal–hal terinci dalam sel. Zat warna yang

mengungkapkan perbedaan kimia pada struktur bakteri dapat dipakai juga.

Zat ini dinamakan zat pewarna diferensial.

Tipe pewarnaan pada mikroba dibagi dalam dua keleompok besar,

yaitu pewarnaan tunggal dan pewarnaan bertingkat. Pewarnaan tunggal

yaitu pewarnaan yang hanya menggunakan satu jenis pewarnaan saja,

missal dengan metilen biru, gentian violet, fuhsin basa, safranin dan

sebagainya. Sedang yang dimaksud dengan pewarnaan bertingkat yaitu

cara pewarnaan beberapa jenis pewarna secara bertahap. Ini mengingat

bentuk dan sifat sel mikroba yang berbeda penerimaannya terhadap

pewarna. Sehingga pada akhirnya cara pewarnaan bertingkat ini dapat pula

dipergunakan sebagai salah satu cara untuk mebedakan kelompok

mikroba.

Untuk menyiapkan bakteri agar dapat diwarnai, sedikit biakan

disebarkan dalam setetes air pada gelas preparat.inilah yang dinamakan

olesan. Olesan ini dikeringkan pada suhu kamar dan bakteri dapat

dilekatkan erat ( difiksasi ) dengan jalan melewatkan gelas preparat

( olesan di permukaan atas) 2 atau 3 kali dengan cepat pada nyala api

pembakaran bunsen. Jika sudah dingin, olesan sudah siap diwarnai. Secara

altenatif, banyak labortorium memakai metanol untuk melekatkan bakteri

pada gelas preparat, sebab panas mungkin dapat menyebabkan distorsi

pada penampilan bakteri yang terwarnai. Cara ini yang dilakukan dengan

meletakkan beberapa tetes metanol pada olesan kering di udara dan

kemudian membiarkan olesan itu kering di udara lagi.

Reaksi Pewarnaan

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan negatif, salah

satu diantaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna itu berada

22

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

pada positif ( yaitu, zat pewarna = Cl- ), sedangkan pada zat pewarna asam itu

pada ion negatif ( yaitu, Na+ dan zat berwarna -).

Hubungan bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan

terutama adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi,

jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi

dengan ion positif zat pewarna basa. Lembayung kristal, safranin, dan biru

metilen adlah beberapa zat pewarna basa yang lazim dipakai.

Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri

menyeluruh. Jadi, mewarnai olesan bakteri dengan zat pewarna asam

menghasilkan hanya pewarna an pada daerah latar belakang saja. Karena sel

bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna, teknik ini sangat

berguna untukmengamati bentuk keseluruhan sel yang sangat kecil. Proses

pewarnaan ini disebut pewarnaan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai

olesan bakteri dengan zat pewarna asma menghasilkan hanya pewarnaan pada

daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang

yang berwarna, teknik ini sangat berguna untuk mengamati bentuk keseluruhan

sel yang sangat kecil. Proses pewarnaan ini disebut pewarnaan negatif.

PEWARNAAN GRAM

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan

yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.

Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan

berikut: zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan

pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air

fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans

Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884

untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu

bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan

mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna

23

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat

pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat

pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan

tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam

struktur kimiawi dinding selnya.

Kegunaan dari metode pewarnaan gram adalah: untuk melihat/mengamati

bentuk-bentuk sel-sel bakteri dan untuk mengetahui sifat reaksi pewarnaan

bakteri, apakah negatif-gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru).

Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling

banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan

penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau

tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak

pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi

menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki

dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif

mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram

Kelebihan :

1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi

antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes

kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan

negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.

2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna

diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci

intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive

diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.

Kekurangan :

24

Steril secara aseptis dengan jarum ose: Pijarkan jarum ose sampai pada bagian batang ose, dinginkan

Ambil larutan/biakan dengan ose yang telah dipijarkan sebelumnya.

Letakkan lagi mulut tabung larutan/biakan di api

Tutup kembali dengan kapas penutupnya.

Pijarkan jarum ose di api

Jepit kapas penutup tabung/wadah larutan/biakan di sela-sela jari tangan kanan

Steril secara aseptis dengan jarum ose: Pijarkan jarum ose sampai pada bagian batang ose, dinginkan

Jepit kapas penutup tabung/wadah larutan/biakan di sela-sela jari tangan kanan

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih

dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya

cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk

mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge)

kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

BAB II

METODE KERJA

Teknik Aseptik

25

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Pengamatan Mikroskopik dan Motilitas Bakteri

1. Preparat ragi hidup dari biakan miring pada Saccharomyces cerevisiae

26

Jepit kapas penutup tabung/wadah larutan NaCl 0,9 % di sela-sela jari tangan kanan

Lewatkan mulut tabung di api sebentar

Ambil larutan NaCl 0,9 % beberapa kali dengan ose yang telah dipijarkan sebelumnya

Letakkan di tengah-tengah kaca obyek hingga kurang lebih satu tetes

Tutup kembali dengan kapas penutupnya

Pijarkan jarum ose di api

Ambil setetes air atau NaCl 0,9 % steril secara aseptis dengan pipet tetes atau jarum ose

Lewatkan lagi mulut tabung larutan NaCl 0,9 % di api

Lewatkan lagi mulut tabung di api sebentar

Kemudian tutup dengan kapas penutupnya

.

Suspensikan sel-sel yang terdapat pada ujung-ujung jarum ose tersebut ke dalam larutan NaCl 0,9 %

Pijarkan kembali jarum ose di api

Siapkan kaca penutup yang tepi-tepinya telah diolesi vaselin

Tutupkan pada suspensi sel ragi tersebut (bagian yang bervaselin menghadap ke kaca obyek)

Amati preparat di mikroskop pada perbesaran 100 X, 400 X, 1000 X. Gambar sel-sel ragi yang

anda amati pada perbesaran 1000 X

Jepit kapas penutup tabung biakan miring Saccharomyces cerevisiae.

Dengan menggunakan jarum ose, ambil biakan ragi secara aseptis seperti cara di atas pijarkan jarum ose

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

27

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

2. Preparat bakteri hidup dari biakan cair pada Echerichia coli

28

Siapkan kaca penutup yang tepi-tepinya telah di olesi vaselin

Tutupkan kaca penutup menghadap ke kaca obyek

Ambil preparat di mikroskop pada perbesaran 100 X, 400 X, dan 1000 X. Gambar sel-sel yang

ada diamati pada perbesaran 1000 X

.

Amati sifat pergerakan atau motilitas bakteri

Ambil setetes (4-5 ose) biakan secara aseptis menggunakan jarum ose

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

3. Pembuatan preparat bakteri hidup pada biakan padat Staphylococcus aureus

29

Ambil 1 ose biakan padat dan disusupensikan (tanpa peralatan) pada obyek gelas

Siapkan kaca penutup yang tepi-tepinya telah

diolesi vaselin

Tutupkan kaca penutup menghadap ke kaca obyek

Amati preparat di mikroskop pada perbesaran 100 X, 400 X, dan 1000 X

Gambar sel-sel yang ana amati pada perbesaran 1000 X

Amati sifat pergerakan atau motilitas

Ambil 4-5 ose NaCl 0,9 % pada obyek gelas secara aseptis

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Pewarnaan Gram Sel Bakteri (Gram Positif dan Gram Negatif)

1. Pembuatan peparat olesan bakteri untuk pewarnaan gram Echerichia coli

30

Ambil 4-5 ose suspensi sel Bacillus subtilis (dari kultur cair) secara aseptis

Dengan jarum osesebarkan suspensi bakteri tersebut secara merata dari tengah-tengah kaca

obyek kearah lurus (posisi jarum ose horizontal)

Bila biakan berasal dari biakan padat atau bukan kultur cair maka suspensikan dahulu sel-sel bakteri ke dalam larutan NaCl 0,85 %

Biarkan olesan bakteri kering di udara. Jangan dikeringkan dengan pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, lewatkn preparat di atas api spiritus pada ketinggian kurang lebih 33 cm diatas api spiritus

Siapkan kaca obyek bebas lemak

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

2. Pewarnaan Gram Staphylococcus aureus

31

Lakukan fiksasi untuk melewatkan olesan bakteri pada kaca obyek diatas api spiritus

Tetesi preparat dengan larutan lugol (Gram II) beberapa tetes. Biarkan selama 1 menit.

Bilas dengan air.

Cuci dengan larutan Gram III (alcohol 96 %) dengan memiringkan preparat lalu tetesi perlahan-lahan dengan Gram III hingga tidak ada pewarnaan yang terlunturkan.

Bilas Preparat secara hati-hati dengan air

Tetesi preparat dengan larutan fuchsin (Gram IV) beberapa tetes.

Diamkan selama 2 menit

Tetesi preparat olesan bakteri yang telah difiksasi dengan beberapa larutan karbolgentian violet (Gram I) biarkan selama 3 menit. Bilas air

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB III

HASIL PRAKTIKUM

Pengamatan Mikroskopik dan Motilitas Bakteri

a. Preparat ragi hidup dari Saccharomyces cerevisiae

Gambar sel-sel Saccharomyces cerevisiae (1000x)

Keterangan : Motilitas negative (diam)

b. Preparat bakteri hidup dari biakan cair pada Echerichia coli

Gambar sel-sel Echerichia coli (1000x)

32

Bilas preparat dengan air. Kemudian keringkan di udara atau dengan cara menyerap kelebihan air dengan tissue

Ambil preparat di mikroskop dengan cara yang sama. Gambar sel-sel dan reaksi gram yang terlihat pada mikroskop perbesaran 1000 X.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Keterangan : Motilitas positif (bergerak)

c. Preparat bakteri hidup dari biakan padat Staphylococcus aureus

Gambar sel-sel Staphylococcus aureus (1000x)

Keterangan : Motilitas negative (diam)

Pewarnaan Gram

a. Gambar sel-sel Echerichia coli (1000x)

Keterangan : termasuk Gram (-) , Single cell, Batang pendek

Warna sel : merah

33

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

b. Gambar sel-sel Staphylococcus aureus (1000x)

Keterangan : termasuk Gram (+), sel bergerombol, bulat-bulat

Warna sel : ungu

c. Gambar sel-sel Bacillus subtilis (1000x)

Keterangan : termasuk Gram (+), Single cell, batang panjang, bergandengan

Warna sel : ungu

34

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB IV

PEMBAHASAN

A. Pengamatan Mikroskopik Yeast dan Sediaan Hidup Bakteri

Hal pertama yang dilakukan dalam praktikum ini adalah pengambilan air

steril secara aseptis menggunakan jarum ose. Dengan cara menjepit kapas

penutup tabung di sela–sela jari tangan, dilewatkan mulut tabung di api

kemudian diambil air steril 4-5 ose dan diletakkan di tengah–tengah kaca

obyek. Setelah itu, mulut tabung dilewatkan lagi di api dan tutp kembali

dengan kapas penutupnya, jarum ose juga dipijarkan di api. Pada praktikum

ini penambahan air steril bertujuan untuk mengencerkan/mensuspensikan

biakan bakteri atau jamur, dengan menggunakan ose.

Pada setiap proses pewarnaan perlu dilakukan proses fiksasi terlebih

dahulu untuk memperdsiapkan preparat, yang dimaksud dengan fiksasi ialah

melekatkan bakteri pada kaca objek dilakukan setelah preparat kering.

35

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Selanjutnya diambil biakan menggunakan jarum ose secara aseptis seperti

pada pengambilan air steril. Perlakuan secara aseptis dan steril ini bertujuan

untuk membunuh dan melenyapkan semua mikroorganisme hidup yang terdapat

di alat atau medium sehingga tidak ditumbuhi mikroba pencemar. Motilitas dapat

diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang sudah lama

akan dapat menjadi penuh sesak dengan makhluk hidup yang giat dan banyak

bakteri yang sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang

motil, selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat

menyebabkan hilangnya motilitas sel bakteri pada biakan. Pengambilan ose pada

biakan tidak boleh saat panas karena akan mematikan mikroorganisme sehingga

tidak dapat mengamati pergerakan mikroba tersebut. Setelah biakan diletakkan

pada obyek tepat pada letak air steril, obyek ditutup dengan kaca penutup (cover)

yang sebelumnya pada ujung telah diolesi vaselin. Dimana olesan vaselin pada

cover berfungsi untuk mencegah penguapan.

Dengan demikian dapat diamati motilitas atau gerak bakteri melalui

mikroskop. Bakteri tersebut bergerak secara positif (bakteri bergerak tidak

beraturan baik atas–bawah maupun kanan–kiri) atau gerak negatif (bakteri tidak

bergerak atau bergetar saja). Dan dari hasil praktikum kami yang menunjukkan

gerak positif adalah pada bakteri Eschercia coli yang berbentuk cocobasil

sedangkan pada gerak negatif adalah pada bakteri Staphyloccocus aureus yang

berbentuk cocus dan jamur Saccharomyces cerevisiae.

Pergerakan positif dari bakteri tersebut diakibatkan adanya flagella.

Flagella pada bakteri berfungsi untuk bergerak. Flagella berbentuk panjang,

ramping dan memiliki panjang sekitar 12 sampai 30 nm. Flagella dapat dilihat

pada mikroskop cahaya jika ditambah dengan substansi khusus yaitu mordan yang

merupakan substansi yang dapat mempertajam pengamatan yang berfungsi untuk

membesarkan garis lengan flagella. Flagela tersusun atas tiga bagian, yaitu:

pangkal (basal) adalah bagian yang berhubungan dengan membran plasma, Hook

merupakan bagian dari flagella yang pendek dan filamen yang bentuknya seperti

36

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

benang, panjangnya sampai beberapa kali melebihi panjang tubuhnya. Flagela

yang ada pada bakteri selalu berliuk, apalagi jika bakteri sedang bergerak.

 Pergerakan bakteri yang diamati berbeda dengan gerak pada bakteri yang

bersifat immotil/tidak bergerak. Pergerakan pada bakteri yang bersifat motil

menunjukkan pergerakan yang lebih kompleks, menuju ke arah tertentu

sedangkan gerak pada bakteri yang bersifat tidak motil adalah gerak statis atau

bergetar saja dan terjadi karena adanya tumbukan antara molekul air/pelarut

dengan molekul koloid. Tumbukan yang terjadi adalah lenting sempurna, artinya

tenaga kinetik molekul pelarut dan partikel koloid sama tetapi karena partikel

koloid lebih besar maka gerakannya lebih lambat jika dibandingkan dengan

molekul pelarut.

B. Pewarnaan Gram

Pada proses pewarnaan gram, digunakan empat macam zat yang memiliki

fungsi tersendiri dalam pewarnaan tersebut. Tujuan masing–masing pewarnaan

pada proses pewarnaan Gram antara lain :

a. Gram I yaitu larutan karbolgentian violet merupakan pewarna utama yang

berfungsi untuk memberi warna ungu pada dinding sel bakteri .

b. Gram II yaitu larutan lugol berfungsi untuk menambah intensitas warna

dari pewarnaan gram I.

c. Gram III yaitu larutan alkohol 96% berfungsi sebagai peluntur atau

decolorizer yang akan menghilangkan warna ungu dari pewarnaan gram I.

d. Gram IV yaitu larutan fuchsin berfungsi memberi warna merah sebagai

warna tandingan.

Pada pewarnaan dengan pewarnaan gram didapatkan hasil bahwa Eschericia

coli berwarna merah. Hal ini berarti Eschericia coli termasuk bakteri gram

37

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

negative, sedangkan Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis termasuk bakteri

gram positif karena pada pengamatan didapatkan warna ungu.

Penyebab perbedaan warna ini antara lain:

a) Perbedaan struktur pada dinding sel Eschercia coli (gram negatif) dan

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis (gram positif) yang

mempengaruhi retensi atau keluarnya kompleks kristal–iodin. Bakteri

gram positif memiliki kandungan peptidoglikan (disacarida dan asam

amino) yang lebih tebal pada dinding selnya dibandingkan pada dinding

sel bakteri gram positif. Sebagai tambahan, bakteri gram negatif juga

memiliki lapisan lipopolisakarida (lipid dan polisakarida) pada dinding

selnya. Saat ditambahkan pada bakteri gram positif dan gram negatif,

molekul kristal violet dan iodine memasuki sel dan membentuk kompleks

kristal violet–iodine yang berukuran lebih besar dan oleh sebab itu tidak

dapat dilunturkan melalui lapisan peptidoglikan dari sel gram positif.

Sebagai akibatnya, sel gram positif mempertahankan warna dari zat warna

kristal violet. Sedangkan pada bakteri gram negatif, alkohol merusak

lapisan peptidoglikan dari dinding sel dan kompleks tersebut terlunturkan

melalui lapisan tipis peptidoglikan. Akibatnya bakteri gram negatif tidak

berwarna sampai diberi pewarna tandingan fuchsin. (Tortora , Funke &

Case , 2007)

b) Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut oleh

perlakukan alkohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori–pori

dinding sel menutup sehingga memecah larutnya kompleks kristal violet–

iodine pada proses pelunturan. Di pihak lain, sel–sel gram negatif

mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding sel nya dan

lipid umumnya larut dalam alkohol. Larutnya lipid ini memperbesar

pori–pori dinding sel sehingga proses pelunturan pada bakteri gram negatif

berlangsung lebih cepat dan warna unggu menjadi hilang. (Hadioetomo ,

1985)

c) Adanya kompleks protein–magnesium ribonukleat pada dinding sel

bakteri gram positif yang tidak dijumpai pada dinding sel bakteri gram

38

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

negatif kompleks tersebut mengikat kuat pewarna unggu pada dinding sel

sehingga pada saat pelunturan dengan alkohol, dinding sel tetap menggikat

pewarna ungu dan tidak dapat mengikat pewarna fuchsin. K o m pleks ini

dapat dihilangkan dan membuat bakteri gram positif menjadi gram negatif

dan apabila kompleks ini dikembalikan, bakteri tersebut ini akan kembali

menjadi gram positif. Bakteri gram positif juga dapat dibuat menjadi gram

negatif bila diberi perlakuan dengan ribonukleuse. (Burrows , 1959)

BAB V

KESIMPULAN

a. Saccharomyces cerevisiae dan Staphylococcus aureus memiliki

motilitas negative (tidak bergerak).

b. Echerichia coli memiliki motilitas positif (bergerak ke segala arah).

c. Echerichia coli termasuk gram negatif dengan warna sel merah.

d. Staphyllococcus aureus dan Bacillus subtilis termasuk gram positif

dengan warna sel ungu.

39

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB I

PENDAHULUAN

PEWARNAAN ZN

Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan pewarnaan gram. Zat warna Ziehl

Neelsen disebut juga zat pewarna tahan asam (acid fast stain). Pewarnaan ini

digunakan untuk mengidentifikasi orgaisme bermarga Mycobacterium. Marga ini

mempunyai banyak organisme baik yang tidak menimbulkan penyakit maupun

beberapa pathogen virulen. Dua pathogen tersebut yang terpenting adalah

Mycobacterium tuberc olosis dan Mycobacterium leprae .

Suatu Mycobacteria dikatakan tahan asam karena apabila diwarnai dengan

zat pewarna merah (karbolfuksin). Sifat kimianya yang unik mampu menahan zat

40

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

warna walaupun olesan yang terwarnai telah dicuci dengan alkohol asam.

Perlakuan ini menghilangkan zat pewarna dari organisme lain dalam olesan. Suatu

perkecualian pada bakteri pathogen yaitu marga Nocardia. Bakteri ini tidak

setahan asam seperti Mycobacteria. Dengan pencucian yang terus menerus

menyebabkan Nocardia kehilangan zat warna.

Mycobacterium memiliki lapisan lilin yang mengandung asam mikolat

disebelah luar dinding sel sehingga zat warna tidak dapat masuk ke dalam.

Mycobacterium memiliki kandungan lipida yang tinggi dan mempunyai lapisan

lilin di luar sel yang bersifat impermeable. Supaya zat warna dapat menembus ke

dalam sel diperlukan pemanasan dan penambahan bahan kimia khusus. Untuk

membantu perasukan dari zat warna, ditambahkan karbol fuksin yang

mengandung fenol 5 %.

Jika warna telah masuk ke dalam sel maka Mycobacterium akan tetap

berwarna merah meski ditambahkan asam alkohol sebagai pemucat. Larutan

pemucat dalam pewarnaan ZN lebih kuat karena mengandung HCl 3 %. Lamanya

pemucatan tidak akan mempengaruhi reaksi pewarnaan ZN.

Untuk dapat mewarnai Mycobacterium, Paul Ehrlich mewarnai

Mycobacterium dengan menggunakan larutan pemucat yang mengandung asam.

Pewaranaan ZN digunakan saat ini merupakan penyempurnaan metode Ehrlich.

Pada pewarnaan ini digunakan zat warna :

Karbol fuksin

Asam alkohol sebagai larutan pemucat

Biru metil sebagai zat warna pembeda

PEWARNAAN SPORA

Tidak semua bakteri dapat membentuk spora. Sifat dari endospora adalah

tahan tehadap pemanasan. Pada bakteri spora berfungsi dalam mempertahankan

diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang

sama seperti kista amoeba karena bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam

41

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

bentuk kista berada dalam fase yang sama. Dimana kedua mikroorganisme ini

berubah bentuk dalam usaha melindungi diri dari keadaan tidak menguntungkan.

Hanya golongan basil yang membentuk spora, namun tidak semua

golongan basil dapat mebentuk spora. Endospora lebih tahan terhadap pengaruh

luar dibandingkan bakteri biasa yaitu dalam bakteri bentuk vegetatif.

Bentuk-bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang, hal ini

bergantung kepada spesiesnya. Endospora ada yang lebih kecil dan ada pula yang

besar dari pada diameter sel induk. Sel yang mengandung endospora itu kemudian

disebut sporangium atau kotak spora. Pembentukkan spora disebut dengan

sporulasi, pada umumnya sporulasi mudah terjadi, apabila keadaan medium

memburuk, zat-zat yang timbul sebagai tempat pertukaran zat menumpuk dan

faktor merugikan. Beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuan nya

untuk dapat membentuk spora.

Adanya spora dapat diketahui dengan pengamatan secara morfologi dan

secara fisiologi. Bentuk spora dapat dilihat dengan mikroskop biasa, apalagi kalau

spora itu diwarnai. Pewarnaan spora memerlukan pemanasan.

Biasanya pewarnaan spora dipakai untuk menyebut alat pembiakkan yang

terdapat pada jamur, ganggang, lumut, paku - pakuan.

Istilah spora pada bakteri mempunyai arti yang lain. Spora bakteri yang

sedang dalam usaha mengamankan diri terdapat pengaruh buruk dari luar. Spora

bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam

bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase, dimana kedua

mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor – faktor

luar yang tidak menguntungkan. Setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka

pecahlah bungkus spora atau dinding kista, dan tumbuhlah bakteri atau amoeba

sebagaimana biasanya.

42

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan beberapa spesies Clostridium

yang anaerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora, ialah

karena spora itu dibentuk didalam sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap

pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasnya, yaitu bakteri dalam bentuk

vegetatif.

Menurut knaysi terjadinya spora atau sporulasi itu dapat dibagi atas 4

tahap :

1) Tahap permulaan, di mana koloni menunjukkan pertumbuhan yang sangat

lambat.

2) Selama beberapa jam kelihatan adanya bahan-bahan lipo protein yang

mengumpul kesalah satu ujung sel, sehingga ujung itu sangat padat.

3) Maka timbullah bungkus yang menyelubungi calon spora. Selubung terdiri

atas 2 lapis, yaitu kulit luar (eksin) dan kulit dalm (intin). Pada beberapa

spesies inti itu menjadi dinding sel, apabila spora melanjutkan

pertumbuhannya menjadi bakteri biasa. Dinding spora melanjutkan

pertumbuhannya menjadi bakteri biasa. Dinding spora itu imermeabel bagi

zat–zat yang dapat mengganggu kehidupan bakteri.

4) Pada tahap yang terakhir maka spora tampak berubah bentuk dan berubah

volume.

Endospora dapat tetap tinggal disalah satu ujung atau di tengah-tengah sel.

Sel dapat pecah karena perkembangan endospora. Pecahan itu kemudian

luluh menjadi satu dengan medium.

Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang lebih kecil dan ada pula yang

lebih besar dari pada diameter sel induk. Sel yang mengandung endospora itu

kemudian disebut sporangium atau kotak spora. Biasanya satu sporangium berisi

satu endospora, akan tetapi ada kalanya satu sporangium berisi dua spora, hal ini

disebabkan karena pembelahan sel yang lambat.

Bakteri dalam bentuk spora lebih tahan terhadap disenfektan, sinar, dan

terutama terhadap kekeringan, panas, dan kedinginan. Hal ini disebabkan

43

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

karena dinding spora sedikit banyak impermeabel, sedang banyaknya asam

ribonukleat di dalam protoplasma dapat menawar pengaruh buruk dari sinar,

lebih–lebih dari sinar ultra violet. Berhubung spora itu mengandung sangat sedikit

air, maka keadaan ini menyebabkan spora tidak mudah megalami perubahan

temperatur.

Jika keadaan luar menguntungkan, maka spora dapat tumbuh lagi menjadi

bakteri biasa. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora

mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi

pada salah satu ujung, tetapi dapat juga pada tengah-tengah spora, hal ini

merupakan salah satu ciri khas pada Bacillus. Jika kulit spora pecah di tengah-

tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua

ujung bakteri.

Adanya spora dapat diketahui dengan pengamatan secara morfologi dan

secara fisiologi. Bentuk spora dapat dilihat dengan mikroskop biasa, apalagi kalau

spora itu diwarnai. Pewarnaan spora memerlukan pemanasan lebih dulu. Spora

yang tidak meresap zat warna nampak berlainan dari pada sporangiumnya. Jika

spora tidak diwarnai, ia nampak sebagai benda yang agak suram di samping

protoplasma yang tembus cahaya.

Penyelidikan spora secara fisiologi dilakukan sebagai berikut: suatu koloni

dipanasi barang 10-15⁰C di atas temperature maksimumnya. Dengan demikian

maka sel-sel vegetatif akan mati, akan tetapi spora-sporanya mungkin belum. Hal

ini akan terbukti, jika kita mengadakan pemindaan piaraan ke medium baru yang

disimpan dalam temperatur biasa. Jika tumbuh koloni-koloni baru, maka ini

merupakan satu bukti ,bahwa bakteri yang kita selidiki itu mempunyai spora.

Spora-spora tersebut bertahan, dapat mengatasi pemanasan ekstra.

44

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB II

METODE KERJA

Pewarnaan ZN pada Sel Bakteri (Bakteri ZN positif dan ZN Negatif)

45

Tetesi dengan beberapa tetes larutan carbol-fuchsin (ZN I).

Sisihkan dari api hingga uap hilang.

Siapkan preparat olesan bakteri Staphylococcus aureus yang telah difiksasi.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Pewarnaan Spora pada Sel Bakteri

46

Lalu panaskan lagi hingga timbul uap lagi dan lakukan lagi seperti sebelumnya sebanyak 2-3 kali (selama 4-5 menit).

Jaga jangan sampai larutan pewarna mendidih atau mongering, tambahkan lagi larutan ZN I bila pewarna mulai berkurang / mengering.

rutan / biakan di api

Dinginkan preparat. Bilas air, tetesi dengan larutan ZN II (larutan alcohol-HCl) hingga tidak

ada pewarna yang terlunturkan.

Bilas secara hati-hati dengan air.

Bilas dengan air. Lalu keringkan-udarakan atau dikeringkan dengan cara menyerap kelebihan air dengan kertas saring atau tissue.

Ambil preparat di mikroskop dengan cara yang sama. Gambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan

tahan asam yang terlihat pada mikroskop perbesaran 400 X dan 1000 X.

Tetesi dengan eberapa tetes larutan malachite-green (SF I).

Panaskan di atas api spiritus hingga timbul uap.

Siapkan preparat olesan Bacillus subtilis yang telah difiksasi.

Warnai dengan pewarna tandingan (ZN III), yaitu larutan biru metilen selama 30 detik.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

47

Warnai dengan pewarna tandingan (ZN III), yaitu larutan biru metilen selama 30 detik.

Sisihkan dari api hingga uap hilang.

Lalu panaskan lagi hingga timbul uap lagi dan lakukan lagi seperti di atas sebanyak 2-3 kali (4-5 menit).

Jaga jangan sampai larutan pewana mendidih atau mongering, tambahkan lagi larutan SF I selama

pemanasan untuk mencegah pengeringan

Dinginkan preparat. Bilas dengan air hingga tidak ada pewarna terlunturkan.

Tetesi denga larutan fuchsin basa selama 1 menit

Bilas dengan air. Lalu kering-udarakn atau dikeringkan dengan cara menyerap kelebihan air

dengan kertas saring atau tissue

Ambil preparat di mikroskop dengan cara yang sama. Gambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan

tahan asam yang terlihat pada mikroskop perbesaran 400 X dan 1000 X.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB III

HASIL PRAKTIKUM

Pewarnaan ZN pada Sel Bakteri (Bakteri ZN Positif dan ZN Negatif)

Preparat olesan bakteri Staphyllococcus aureus

Gambar sel – sel Staphyllococcus aureus

48

Lakukan pengamatan juga pada preparat Echerichia coli yang telah disiapkan petugas.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Keterangan :

Warna sel : biru keunguan

Sel termasuk ZN : negative

Preparat olesan bakteri Mycobacterium tuberculosis

Gambar sel- sel Mycobacterium tuberculosis

Keterangan :

Warna sel : merah

Sel termasuk ZN : positif

Pewarnaan Spora pada Sel Bakteri

a. Preparat olesan Bacillus substilis

Gambar sel-sel Bacillus substilis (1000x)

49

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Keterangan :

Bentuk sel vegetative : batang atau basil yang panjang

Warna sel : merah muda

Warna spora : hijau

Letak spora : central

b. Preparat olesan Echerichia coli

Gambar Echerichia coli (1000x)

Keterangan :

Bentuk sel vegetative : cocobasil (tidak bulat dan tidak batang)

Warna sel : merah

50

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Spora : tidak ada

BAB IV

PEMBAHASAN

A. Pewarnaan ZN

51

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan didapat bahwa,

Staphylococcus aureus yang diberi pewarna ZN berwarna ungu. Hal ini

membuktikan bahwa Staphylococcus aureus termasuk bakteri ZN negatif atau

dapat dikatakan bahwa Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang tidak

tahan asam.

Karena dinding sel dari Staphylococcus aureus bersifat tidak tahan asam

sehingga akan melepas pewarna pertama (merah) setelah pelunturan dan dengan

pemberian metilen blue akan memberikan warna ungu atau biru. Pada pewarnaan

ZN dilakukan proses pemanasan untuk mebantu penetrasi pewarna ke dalam

lapisan lilin tebal yang menyelubungi dinding sel bakteri gram ZN positif.

Pada bakteri Mycobacterium tuberculosis yang bersifat ZN positif, dinding

selnya bersifat tahan asam karena adanya kandungan asam mikolat yang tinggi

pada lipid penyusun dinding selnya, yaitu sekitar 60%. Bakteri ZN positif pada

saat diwarnai dengan pewarna merah akan mengikat warna tersebut. Selanjutnya

pada proses pelunturan dengan alkohol asam dinding selnya tetap

mempertahankan pewarna merah karena lipid (asam mikolat) bersifat tidak

terlunturkan oleh alkohol asam. Jadi pada saat pemberian warna ketiga (ungu),

dinding selnya tidak dapat mengikat pewarna ungu tersebut dan tetap bewarna

merah.

Bakteri ZN negatif tidak mempunyai asam mikolat pada dinding selnya

sehingga lipid pada dinding selnya akan larut oleh pemberian alkohol asam dan

melepaskan pewarna merah. Selanjutnya sel akan tewarnai dengan pewarna ke

tiga (ungu). Hal ini membuktikan bahwa dinding sel Staphylococcus aureus tidak

mengandung asam mikolat sehingga bakteri ini termasuk bakteri yang bersifat ZN

negatif.

B. Pewarnaan Spora

Spora bakteri berfungsi sebagai mekanisme pertahanan dari lingkungan

yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk spora berasal dari bakteri Gram

Positif, seperti dari genus Bacillus, Clostridium.

52

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Macam-macam letak endospora :

Sentral : di bentuk di tengah-tengah sel

Terminal : dibentuk di ujung

Subterminal : dibentuk dekat ujung

Lokasi spora membantu identifikasi berbagai spesies bakteri

Spora tahan terhadap proses pewarnaan biasa, tetapi beberapa pewarna

basa dapat dipaksa masuk ke dalam spora dengan cara pemanasan (pori-pori spora

membesar sehingga zat warna dapat masuk). Sekali spora menyerap zat warna

maka spora tidak mudah di dekolorisasi (dilunturkan warnanya). Sedangkan zat

warna dapat dengan mudah dicuci dari sel vegetatif. Karena itu, saat olesan dicuci

dan diberi pewarna tandingan dengan zat warna kedua, spora akan tetap

mempertahankan pewarna pertama dan sel vegetatif akan menunjukkan warna

dari pewarna kedua.

Dalam praktikum pewarnaan spora pada bakteri Bacillus subtilis setelah

diberi warna safarin I (larutan melachite green) dilakukan pemanasan 2-3 menit

yang ditujukan untuk membantu masuknya pewarna menembus kulit spora yang

tebal, dengan adanya pemanasan pori-pori membesar, spora meregang dan zat

warna dapat masuk dengan mudah. Pewarna pertama untuk spora belum tentu

malachite green, bisa juga menggunakan pewarna lain, misal karbol fuchsin yang

berwarna merah, tapi proses tetap diikuti dengan pemanasan. Pada pewarnaan

karbon fuchsin, spora berwarna merah. Malachite green segera masuk ke dalam

spora dan spora yang telah terpisah dari sel vegetatif akhirnya terlihat berwarna

hijau pada perbesaran dengan mikroskop. Selanjutnya karena spora telah terpisah

dari sel vegetatif dan berwarna oleh safranin I, maka sel vegetatif terakhir terlihat

berwarna merah karena warna yang terserap adalah warna merah dari safranin II

yang terakhir diberikan dan dibiarkan 1 menit, dibilas dan dikeringkan.

53

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB V

KESIMPULAN

a. Staphylococcus aureus termasuk bakteri yang tidak tahan asam karena

dalam pewarnaannya ZN negatif.

54

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

b. Mycobacterium tuberculosis termasuk bakteri yang tahan asam karena

dalam pewarnaannya ZN positif.

c. Bacillus substilis memiliki spora berwarna hijau dan letaknya dominan

sentral. Dengan bentuk sel vegetative batang atau basil yang panjang dan

warna sel merah.

d. Echerichia coli tidak memiliki spora, memiliki bentuk sel vegetative

coccobasil dan warna sel merah.

BAB I

PENDAHULUAN

JAMUR

55

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Latar belakang teori

Fungi merupakan sebuah kingdom, atau kerajaan dalam susunan

taksonomi makhluk hidup. Kedudukannya sejajar dengan hewan and tumbuhan.

Sebagai kingdom fungi memiliki filum–filum dibawahnya. Sampai saat ini telah

dibentuk tujuh filum, yaitu Chytridiomycota, Neocallimastogomycota,

Blastoclamycota, Microsporidia, Glomeromycota, Ascomycota, dan

Basidiomycota.

Jamur adalah tumbuhan yang berinti, berspora, tidak berklorifil, berupa sel

atau benang bercabang–cabang, dengan dinding dari selulosa atau dari kitin, atau

dari keduanya, dan pada umumnya secara aseksual dan seksual.

Perkembangbiakan jamur

Perkembangbiakan jamur secara aseksual dapat berlangsung dengan

berbagai cara :

1. Jamur bersel satu berbiak dengan membelah diri, atau dengan bertunas.

2. Sepotong miselium atau sepotong hifa dapat memulai (melanjutkan)

keehidupan koloni.

3. Banyak jamur menghasilkan konidia, yaitu ujung hifa–hifa tertentu yang

membagi–bagi diri menjadi bentuk–bentuk yang bulat, atau yang serupa

telur, atau yang serupa empat persegi panjang.

4. Ujung hifa pada beberapa jamur dapat menggelembung merupakan suatu

wadah, sedangkan protoplastnya membagi–bagi diri menjadi suatu spora.

Pembiakan secara seksual memerlukan dua jenis jamur yang cocok,

artinya yang dapat kawin. Untuk kecocokan ini kita berikan istilah

kompatibel. Dua jenis yang kompatibel kita tandai dengan (+) dan (-) atau

dengan A dan a, atau dengan kode lain.

KLAS ASCOMYCETES

Sifat – sifat umum Ascomycetes:

56

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

1. Hifa bersekat–sekat, tiap sel lazimnya berinti lebih dari satu.

2. Ascomycetes tidak menghasilkan spora kembar.

3. Ascomycetes mempunyai alat pembentukan spora yang disebut askus.

KLAS ZYGOMYCETES

Jamur–jamur dari kelas ini tidak mempunyai spora kembar, karena itu ada ahli

yang menamakannya Aplanatae. Ciri utama dari klas ini adalah :

1. Pembiakan seksual dengan gametangiogami yang menghasilkan zigospora.

2. Pembiakan aseksual dengan spora tak berflagel (aplanospora), dan spora ini

berupa sporangiospora atau berupa konidia.

Saccharomyces cerevisiae

Termasuk golongan Ascomycetes yang tidak memiliki hifa dan

tubuh buah. Memiliki fulting body yang mengandung kantung yang

disebut askus dan didalam askus terdapat askospora.

Perkembangbiakan Saccharomyces cerevisiae dengan dua cara :

- Sel vegetative dengan tunas

- Konjugasi antara 2 sel yang berlawanan sifat.

Candida albicans

Termasuk golongan Ascomycetes, mempunyai hifa bersepta.

Reproduksi melalui aseksual yaitu konidio (chlamydospora), sedangkan

seksual dengan akospora. Chlamydospora adalah spora yang berdinding

tebal dan mempunyai fase istirahat (banyak ditemukan pada hifa tua).

Penicillium sp

Termasuk golongan Ascomycetes dan disebut juga fungi

beraskus/berkantung, sebab dalam setiap askus terdapat 8 askospora juga

punya hifa yang bersepta dengan sel nukleat. Habitat alaminya adalah

tanah, tumbuhan/hewan. Reproduksi secara aseksula dengan konidio

57

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

(phralospora) berbentuk seperti vas bunga, sedangkan secara seksual

dalam askus.

Rhizopus sp

Termasuk golongan zygomycetes, pembentukan

zoospore/sporangia pada waktu reproduksi aseksual. Zygospora

berdinding tebal yang berasal dari gamptogia (ujung hifa yang

membengkak).

Sporangiospora adalah spora yang terjadi karena protoplasma

dalam suatu sel tertentu berkelompok–kelompok kecil dan masing–masing

mempunyai membrane serta ini sendiri. Hifa tidak bersepta/bersifat

coenocytic.

Aspergillus sp

Termasuk golongan ascomycetes, hifa bersepta. Spora

konidiospora adalah spora yang terjadi karena ujung satu hifa membelah

seperti tasbih, dalam hal ini tidak ada sporangium, tiap spora disebut

konidiofora.

Reproduksi secara aseksual dengan konidio (sporulasi diikuti

germinasi spora), secara seksula dalam askus.

BAB II

METODE KERJA

58

Ambil setetes larutan lactophenol cotton-blue atau air steril secara aseptis menggunakan jarum ose,

letakkan ditengah-tengah kaca obyek

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

BAB III

HASIL PRAKTIKUM

Pengamatan jamur

59

Ambil biakan jamur sedikit secara aseptis menggunakan jarum ose/ent masukkan ke dalam

larutan lactophenol cotton-blueI/air di atas

Tutup campuran di atas dengan kaca penutup

Ambil preparat di mikroskop dengan cara yang sama. Gambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan

tahan asam yang terlihat pada mikroskop perbesaran 400 X dan 1000 X.

Lakukan percobaan pada biakan jamur

Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans,

Rhizopus sp, Penicillium sp, Aspergillus sp

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

a. Gambar Saccharomyces cerevisiae

Keterangan :

- tidak mempunyai hifa

- bertunas untuk berkembang biak

- memiliki isi sel

b. Gambar Candida albicans

Keterangan :

- memiliki pseudohifa (rantai dari sel – sel)

c. Gambar Rhizopus sp

60

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Keterangan :

- hifanya tidak bersekat

- sporanya terletak disuatu kantong yang dinamakan sporangium

d. Gambar Penicillium sp

Keterangan :

- hifanya bersekat

- konidia membentuk rantai karena muncul satu persatu dari sterigma

e. Gambar Aspergillus sp

61

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Keterangan :

- hifanya bersekat

- terdapat ruang kosong atau fesikel pada ujung konidiafor

- miseliumnya bercabang

BAB IV

62

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

PEMBAHASAN

A. Pengamatan Jamur

Pada pengamatan mikroskopik jamur dilakukan pembuatan sediaan

hidupnya, dengan mengambil beberapa air steril dengan ose secara aseptis pada

sebuah obyect glass, kemudian mengambil biakan jamur secara aseptis pula

(diusahakan mengambil sampai akar dengan tidak merusak agar) kemudian

campur hingga homogen dan ditutup dengan cover glass dan diamati dengan

mikroskop perbesaran 100X, 400X dan 1000X.

Untuk jenis kapang atau mold sudah dapat diamati pada perbesaran

400X, sedangkan yeast atau khamir pada perbesaran 1000X. Karena kapang

memiliki ukuran diameter hifa 5-10µm, sedangkan yeast 1-5µm x 5-30µm.

Adapula cara pemeriksaan jamur dengan pemeriksaan langsung menggunakan

Lactophenol cotton-blue dan pembiakan pada kaca obyek menurut Riddel yang

bertujuan untuk melihat struktur khusus dari fungi.

a. Saccharomyces cerevisiae

Tergolong jamur uniseluler yang bereproduksi secara vegetatif atau

aseksual dengan cara pertunasan sel. Pada Saccharomyces cerevisiae terdapat

tunas atau bud yang muncul disekitar ujung sel. Pertunasan tersebut merupakan

cara reproduksi yang dilakukan oleh khamir. Tunas akan terus tumbuh dan

membentuk dinding sel baru dan jika ukuran tunas sudah hampir sama dengan

inangnya maka tunas akan terlepas dan terbentuk dinding penyekat.

b. Candida albicans

Tergolong jamur uniseluler, memiliki tipe spora konidia (konidiaspora).

Reproduksi aseksual Candida albicans dikelompokkan melalui spora yang

dihasilkan, yaitu :

Klamidiospora :

a. Spora berdinding tebal

63

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

b. Banyak ditemukan pada hifa yang tua

c. Berbentuk bulat danterletak pada ujung

Blastospora :

a. Spora berdinding tipis

b. Merupakan spora yang dihasilkan untuk pertunasan dan pemisahan

sel induk

Pseudohifa :

Tunas yang tidak dapat terpisah dari induknya dan membentuk rantai

Pada habitat normal pada membran mukosal manusia dan pada darah beberapa

organisme ini akan membentuk seperti yeast dan dapat menyebabkan kerugian

pada saat terjadi pengaruh kondisi dibawah psikologis seperti temperature, pH dan

adanya serum, maka Candida albicans akan membentuk hifa semu yang disebut

pseudohifa. Dan bersifat patogenik seperti candidosis, vaginitis, sariawan,

gangguan saluran pencernaan dan pernafasan.

c. Rhizopus sp

Tergolong kapang tak bersepta. Memilki spora askesual berupa

sporangiospora, yaitu spora yang terjadi karena protoplasma dalam suatu sel

tertentu berkelompok-kelompok kecil dan masing-masing memiliki membran dan

inti sendiri. Sel tempat terbentuknya spora disebut sporangium, sedangkan tempat

atau tangkai terdapatnya sporangiosporayaitu, sporangiofor. Untuk perkembangan

seksual memiliki zigospora yaitu, spora besar dan berdinding tebal yang terbentuk

apabila ujung-ujung hifa yang secara seksual serasi.

Rhizopus sp sering disebut kapang roti karena sering tumbuh dan

menyebabkan kerusakan pada roti. Tetapi selain itu dapat juga digunakan untuk

pembuatan makanan fermentasi secara konvensional seperti Rhizopus oryzae.

d. Penicillium sp

64

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

Tergolong kapang yang merupakan fungi anamorphik, yaitu fungi yang

memproduksi spora secara aseksual yang disebut konidiospora. Sedangkan spora

seksual berupa askospora. Penicilium sp jarang melakukan pembentukan spora

seksual dibanding dengan Aspergillus. Penicillium sp dapat menyebabkan

kerusakan pada bahan sayuran dan buah-buahan tetapi juga penting dalam industri

obat sebagai produksi antibiotik Penicilin.

e. Aspergillus sp

Tergolong kapang bersepta. Kapang ini mampu tumbuh dengan baik pada

substrat dengan konsentrasi gula dan garam yang tinggi. Memilki spora seksual

berupa askospora, yaitu spora bersel satu yang terbentuk didalam kantung yang

disebut askus. Dan spora aseksual berupa konidiospora yang terjadi karena pada

ujung satu hifa terbelah-belah seperti tasbih, sedangkan tangkai terdapatnya

konidia disebut konidiofor.

BAB V

65

Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2012

KESIMPULAN

a. Saccharomyces cerevisie tergolong kelas Ascomycetes dengan ciri–ciri:

1. Tergolong yeast karena bentuknya uniseluler

2. Reproduksi seksual askospora

3. Reproduksi aseksual pertunasan

4. Cirri khusus pada sel terdapat tonjolan yang disebut budding cell

b. Candida albicans tergolong kelas Deuteromycetes dengan ciri–ciri:

1. Tergolong yeast atau khamir

2. Reproduksi seksual termasuk inperfect fungi yang tidak jelas

3. Reproduksi aseksual spora konidia

4. Memiliki pseudohifa

c. Rhizopus sp tergolong kelas Zygomycetes dengan ciri–ciri:

1. Tergolong kapang atau mold

2. Reproduksi seksual berupa rhizoid

3. Reproduksi aseksual berupa spora miospora

4. Memiliki hifa tanpa sekat

d. Penicillium sp tergolong kelas Ascomycetes dengan ciri–ciri:

1. Tergolong kapang

2. Reproduksi seksual berupa askospora

3. Reproduksi aseksual berupa konidiospora

4. Ciri khususnya adalah konidia membentuk rantai karena muncul

satu persatu dari sterigmanya

e. Aspergillus sp tergolong kelas Ascomycetes dengan ciri–ciri:

1. Tergolong kapang

2. Reproduksi seksual berupa askospora

3. Reproduks aseksual berupa konidiospora

4. Ciri khususnya adalah terdapat ruang kosong pada ujung

konidiofor dan miseliumnya bercabang

66