31

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Pada penelitian ini, peniliti menggunakan jenis penelitian eksperimental

dengan pendekatan post test only group design.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah

Malang pada bulan Desember 2017 – Januari 2018

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus

norvegicus strain wistar).

4.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan oleh peneliti adalah sebagian dari populasi

Tikus (Rattus norvegicus) jenis kelamin jantan.

4.3.3 Besar sampel

Penentuan besar sampel ditentukan dengan rumus Federer (1999), yaitu

: (n-1) (t-1) ≥ 15. Dengan n = besar sampel, sedangkan t = banyaknya

variabel perlakuan. Karena dalam penelitian ini akan dilakukan 4

variabel perlakuan, maka banyak sampel yang dibutuhkan :

(n-1) (t-1) ≥ 15

(n-1) (4-1) ≥ 15

32

(n-1) 3 ≥ 15

3n – 3 ≥ 15

n ≥ 6

∑ hewan = n x ∑ kelompok perlakuan

= 6 x 4 = 24

E (besar sampel) = ∑ hewan - ∑ kelompok perlakuan

= 24 – 4

= 20

n’ = −

= 6− ,

= 6,9

= 6,66 ≈ 7

Cadangan tiap kelompok = n’-n

= 7-6

= 1

Setelah dimasukkan rumus Federer dan dilanjutkan dengan rumus

Resource Equation Methode didapat 20 ekor tikus yang dibutuhkan

untuk penelitian. Ditambah dengan cadangan sebanyak 10% (f = 0,1)

dari total sampel sehingga didapat 1 ekor tikus untuk cadangan. Jadi,

total sampel tikus yang dibutuhkan beserta cadangan adalah 24 ekor

31

33

tikus dibagi menjadi 4 kelompok yang berarti 1 kelompok terdiri dari 5

ekor tikus dan 1 ekor tikus sebagai cadangan.

4.3.4 Teknik Sampling

Tekhnik pengambilan sampling pada penelitian ini adalah purposive

sampling.

4.3.6 Karakteristik Sampel Penelitian

4.3.6.1 Kriteria inklusi :

1. Umur 2-3 bulan.

2. Jenis kelamin jantan.

3. Berat badan tikus 180-200 gr.

4. Sehat yang ditandai dengan gerakan yang aktif, bulu tebal

dan bulu berwarna putih, serta mata tikus yang jernih.

4.3.6.2 Kriteria Drop Out

1. Tikus yang sakit selama eksperimen

2. Tikus yang mati selama eksperimen

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian dosis ekstrak

mengkudu.

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah gambaran histopatologi

hepar yang ditandai dengan pembengkakan sel.

34

4.5 Definisi Operasional

No Variabel Definisi

Operasional

Variabel

Hasil Ukur

(Indikator)

variabel

Cara Ukur

Variabel

Alat Ukur Skala

Ukur

Variabel

1. Dosis

Ekstrak

Buah

Mengkudu

Ekstrak Buah

Mengkudu didapat

dari UPT Materia

medika Kota Batu

Dosis 1 : 22,4

mg/200grBB/hari.

Dosis 2 : 44,8

mg/200grBB/hari.

Dosis 3 : 89,6

mg/200grBB/hari

(Fitria et al, 2013).

Diberikan

peroral

menggunakan

sonde setiap

hari selama 28

hari

Timbangan

(Miligram

Balance)

Kategori

k

(Ordinal)

2. Jumlah Sel

Hepatosit

yang

mengalami

kerusakan

Jumlah Sel

hepatosit yang

mengalami

kerusakan dilihat

dengan mikroskop

cahaya perbesaran

400x.

Dibandingkan

antara sediaan

preparat tikus

semua perlakuan

Sel hepatosit yang

dihitung hanya sel

yang mengalami

pembengkakkan

(hepatocyte

swelling) dengan

sitoplasma yang

menipis atau jernih

dengan nukleus

tetap di tengah

Penghitungan

dilakukan

secara

manual pada

5 lapang

pandang di

bawah

mikroskop

elektron

dengan

perbesaran

400 x

dilakukan di

bawah

bimbingan

ahli patologi

anatomi

Mikroskop

cahaya

Numerik

(Ratio)

4.6 Alat dan Bahan Penelitian

4.6.1 Alat Penelitian

A. Alat Pembedah Tikus

1. Handscoon

2. Gunting

35

3. Pinset

4. Tempat organ, menggunakan tabung bekas film

B. Alat Perawatan Tikus

1. Kandang tikus

2. Timbangan

3. Botol air

4. Tempat makan tikus

C. Alat pembuatan ekstrak

1. Oven

2. Incubator

3. Rotary evaporator

4. Kertas saring whatman nomor 2

5. Blender

6. Pisau

7. Pengaduk

D. Alat lain

1. Kamera Digital

2. Spektrofotometer

3. Sonde

4. Gelas ukur

4.6.2 Bahan Penelitian

A. Bahan perlakuan tikus :

36

1. Tikus putih jantan galur wistar usia 2-3 bulan dengan berat 180-200

gram

2. Pakan standart BR I dan air untuk minum

3. Aquades

4. Alkohol 50 %

5. Chlorofom

B. Bahan pembuatan ekstrak buah mengkudu :

1. Buah mengkudu masak

2. Etanol 90 %

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Proses adaptasi

Subjek penelitian diadaptasikan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama tujuh hari, agar

tikus menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru. tikus dimasukkan

ke kandang dan diberi makan dan minum (Purnamasari, 2013).

4.7.2 Pengelompokkan hewan coba

Tikus yang digunakan sebanyak 24 ekor yang terbagi menjadi 4 kelompok

yaitu satu kelompok kontrol positif, dan 3 kelompok perlakuan. Setiap

kelompok terdapat 6 ekor tikus.

4.7.3 Pembuatan ekstrak buah mengkudu

Langkah pembuatan ekstrak mengkudu sebagai berikut (Surya, 2009)

37

Pertama, buah mengkudu dihaluskan dengan blender kemudian direndam

dengan etanol 90% perbandingan 1:3 dan dikocok dengan pengocok listrik

(Strer) selama 2 jam, lalu didiamkan selama 24 jam.

Kedua, ektrak disaring dengan ampasnya direndam kembali dengan

alkohol 90% 1:2, kemudian dikocok selama 2 jam dan didiamkan selama

24 jam.

Ketiga, hasil saringan (filtrat) yang dihasilkan kemudian diuapkan

dengan menggunakan mesin penguap listrik (evaporator) sampai

didapatkan ekstrak kental dengan rendemen + 7,65%

4.7.4 Penentuan dosis ekstrak mengkudu

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh (Surya, 2009) tentang ekstrak

mengkudu menyatakan bahwa dengan dosis 22,4 mg/200grBB tikus dapat

menurunkan kadar SGOT/SGPT. Untuk menilai tingkat keefektifan ekstrak

mengkudu dalam percobaan ini dilakukan orientasi tiga dosis yaitu : 22,4

mg/ 200 grBB; 44,8 mg/ 200 grBB; dan 89,6 mg/ 200grBB. Kemudian

untuk menentukan dosis dalam mL (milliliter) maka caranya adalah

sebagai berikut:

𝜌 = 𝑎𝑠𝑠𝑎 , ρ = Massa Jenis

Dimana massa jenis ekstrak buah mengkudu diperoleh dari hasil

pengukuran dengan menggunakan neraca analisis (piknometer) dan massa

diperoleh dari dosis ekstrak dalam milligram, kemudian volume dicari

dengan rumus:

38

𝑉𝑜 𝑢 𝑒 = 𝑎𝑠𝑠𝑎𝜌

4.7.5 Penentuan dosis alkohol

Berdasarkan penelitian Maity (2012) bahwa pemberian alkohol 40% dosis

2 ml/ 200 grBB alkohol pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain

wistar) yang diharapkan terdapat perbaikan sel hepatosit sehingga peneliti

bisa melihat efektifitas dari ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L).

4.7.6 Pemaparan alkohol

Mengambil tikus yang sudah dikelompokkan berdasarkan perlakuan secara

satu persatu. Pengambilan tikus dilakukan dengan hati-hati dan perlahan,

agar tikus tidak takut dan tidak stress. Tikus dipegang dengan cara

memegang badan tikus dan menaruh bagian ekor serta menjepitnya pada

jari antara kelingking dengan jari manis, lalu menyilangkan kaki depan

tikus dan menjepitnya pada jari antara jari telunjuk dengan jari tengah,

sedangkan posisi kepala tikus siap untuk diberi alkohol. Kemudian sonde

dimasukkan melalui sudut mulut agar tikus tidak menggigit sonde,

pemasukan sonde dilakukan ketika tikus melakukan gerakan menelan /

menggerak – gerakkan lidahnya, sehingga sonde tidak melukai bagian

dalam mulut tikus. Setelah sonde masuk sampai esofagus baru larutan

alkohol 40 % dimasukkan.

4.7.7 Pelaksanaan Percobaan dan Terminasi

39

Setelah dilakukan perlakuan, pada hari ke 29 semua tikus akan

diterminasi dan diambil organ hepar, dibuat sediaan histopatologi, guna

dilakukan analisis data secara bertahap, tepat dan amanah

4.7.8 Membuat Sediaan Histopatologi

Pembuatan sediaan histologi dilakukan dengan cara (Pakurar & Bigbee,

2004):

1. Tikus dibius dengan menggunakan kloroform

2. Abdomen tikus dibedah untuk mengambil hati tikus

3. Potongan hati tikus tersebut diletakkan dalam tabung organ dan

difiksasi dengan 10% formalin dalam sehari pada suhu kamar 250C

4. Dilakukan dehidrasi dengan merendam pada alkohol bertingkat yaitu

pada konsentrasi 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, dan 2 kali alkohol

absolut masing-masing selama 30 menit.

5. Dilakukan clearing dengan menggunakan alkohol dan xilol dengan

perbandingan alkohol:xilol = 3:1, dan 2 kali xilol murni masing-

masing selama 60 menit.

6. Dilakukan proses inlfiltrasi dengan xilol dan paraffin dengan

perbandingan xilol:parafin = 3:1, 1:1, 3:1, dan 2 kali xilol murni pada

suhu 460-520°C masing-masing selama 24 jam.

7. Dilakukan blocking dengan parafin keras pada suhu 460-520°C

selama 60 menit.

40

8. Sliding pada rotasi mikrotom 6µm dengan arah potongan coronal

pada hati, kemudian direkatkan pada gelas objek.

9. Panaskan pada suhu 460-520°C dalam inkubator selama 24 jam.

10. Dilakukan deparaffinasi yaitu dengan perendaman xilol dua kali,

alkohol absolut, 95%, 85%, 70%, 50%, 30%, dan H2O masing-

masing selama 3 menit.

11. Dilakukan pewarnaan Hemtoxilin Eosin (HE) dengan cara (Ruegg &

Meinen,2011) :

a. Diberi hematoxilin selama 15 detik

b. Eosin staining selama 15-20 menit

c. Dehidrasi pada alkohol bertingkat 50%, 70%, 85%, 95%, dan 2 kali

alkohol absolut

d. Pemberian xilol selama 5 menit

e. Mounting menggunakan perekatan entelan

f. Panaskan suhu 460-520°C dalam inkubator selama 24 jam

Diamati dengan mikroskop

4.7.9 Pengamatan Hasil

Pengamatan preparat dilakukan dibawah miskroskop, dengan

perbesaran 400x, pada 5 lapang pandang pada hepar yang mengalami

hepatitis alkoholik, lalu dihitung jumlah sel hepatosit yang mengalami

pembengkakan (swelling).

4.7.10 Penanganan hewan coba setelah pembedahan

41

Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba

tidak mengalami recovery. Sebelum mengubur hewan coba, dipastikan

bahwa denyut nadi sudah berhenti. Jika hewan coba mengalami recovery

maka harus dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya dengan

prosedur Cervical Dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak

dan vertebrae. Teknik ini dilakukan dengan memberikan tekanan ke

bagian posterior dasar tulang tengkorak dan vertebrae. Bila vertebrae

terpisah dari otak, reflek kedip menghilang dengan segera, rangsangan

rasa sakit menghilang sehingga hewan tidak merasakan sakit. Selanjutnya

hewan coba yang sudah dipastikan mati, dikumpulkan menjadi satu lalu

dikubur (Alexandru, 2011).

42

31

4.8 Alur penelitian

KP

Kontrol positif

Pakan dan

minuman standar

dan induksi

Alkohol 40%

peroral 2 ml/200

grBB

K I

Pemberian makan

minum standart

Induksi Alkohol

40 % peroral 2

ml/200 grBB +

ekstrak buah

mengkudu dosis

(22,4mg/200grB

B/hari) selama

21 hari secara

peroral.

K II

Pemberian makan

minum standart

Induksi Alkohol

40 % peroral 2

ml/200 grBB +

ekstrak buah

mengkudu dosis

(44,8

mg/200grBB/hari)

selama 21 hari

secara peroral

K III

Pemberian makan

minum standart

Induksi Alkohol 40

% peroral 2 ml/200

grBB + ekstrak

buah mengkudu

dosis (89,6

mg/200grBB/hari)

selama 21 hari

secara peroral

Adaptasi hewan coba selama 7 hari

Analisis data : Menggunakan uji

Normalitas, Homogenitas, One Way Anova,

uji Post- Hoc Bonferroni, dan uji Regresi

Linier

Pengumpulan data

Setiap tikus dianastesi dengan 0,67 ml kloroform pekat secara inhalasi

dan dilakukan terminasi

Pemeriksaan histopatologi hepar

Pembuatan Sediaan Histologi Hepar Hewan Coba dan pewarnaan Hematoxilin Eosin

(HE).

43

30

4.9 Analisa data

Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis dengan uji normalitas

dan homogenitas terlebih dahulu. Selanjutnya apabila didapatkan distribusi data

normal dan homogen berlanjut ke uji One Way Anova, uji Post-Hoc Bonferroni, dan

uji Regresi Linier dengan menggunakan SPSS 21.

a) Uji normalitas yang bertujuan untuk mengetahui sebaran data normal dengan

ketentuan normal jika sig > 0,05. Jika data tidak normal, maka dilakukan

transformasi data. Jika hasil transformasi data normal maka dilanjutkan dengan uji

One way Anova untuk membuktikan adanya perbedaan yang bermakna antara

kontrol dengan perlakuan dan Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui variabel

mana yang memiliki perbedaan signifikan. Jika uji normalitas didapatkan sebaran

data tidak normal akan menggunakan uji non parametric dengan uj Kruskal-Wallis

dan Post-Hoc Mann Whitney.

b) Uji homogenitas untuk mengetahui kehomogenan atau varian data dari carian dari

data yang diperoleh (homogen jika sig > 0,05). Jika varian data sama maka

berlanjut ke uji One way Anova dan Post Hoc Bonferroni. Jika varian beda maka

berlanjut ke uji Post Hoc Games-Howell. Uji homogenitas ini sendiri

menggunakan uji Levene.

c) Uji Regresi Linier digunakan untuk memprediksi dan mengetahui besar pengaruh

dosis ekstrak buah mengkudu terhadap jumlah sel yang mengalami kerusakan.