bab 3 metodologi penelitian 3.1 tempat dan waktu...

20

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di laboratorium Bioteknologi Industri,

laboratorium Biokimia Pangan, laboratorium Rekayasa dan Pengolahan Pangan

Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Universitas Brawijaya Malang, penelitian di

mulai dari bulan Desember 2013 - Juni 2014.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Peralatan yang digunakan untuk ekstraksi enzim protease dari mengkudu

dan susu ini antara lain timbangan digital (Adventure Pro AV412/, blender

(Signora),gelas ukur (Pyrex), sentrifuse dingin (Thermo Scientifis/ SL40),

pengaduk besi, kain saring,wadah plastik.Alat-alat yang digunakan untuk

purifikasi dan karakterisasi enzim protease dari daun kelor antara lain timbangan

analitik (Pioneer), magnetic stirrer (Big Squid), pH meter (Cyberscan 510),

beaker glass (Pyrex), sentrifuse dingin (Thermo Scientifis/ SL40), inkubator

(Barnstead/101),gelas ukur, baskom plastik,dan tabung reaksi.

Sedangkan peralatan yang digunakan untuk analisa antara lain

timbangan analitik (Pioneer), glass ware (Iwaki Pyrex), inkubator

(Barnstead/101), tabung Eppendorf, sentrifuse dingin (Thermo Scientifisl SL40),

seperangkat alat titrasi, desikator, stop watch, pH meter (Cyberscan 510), oven

listrik (Memmert), spektrofotometer (Jenwey), elektroforesis, mikropipet

(Socorex), blue tip, yellow tip, white tip, vortex (VM-2000), magnetic stirrer (Big

Squid), bola hisap, hot plate, dan refrigerator.

3.2.2 Bahan

1. Bahan baku utama yang digunakan adalah

Mengkudu yang didapatkan dari desa sekitar, kota Malang.

Susu segar dari daerah di Pujon, Malang

K2HPO4, EDTA, asam askorbat, akuades, BaCl, ammonium sulfat, HCL

didapatkan dari toko bahan kimia Makmur Sejati, Malang.

21

Kantong selofan didapatkan dari laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang.

2. Bahan untuk analisa adalah

K2HPO4, Na2CO3, buffer asetat, Tris, SDS, HCL, NaOH, bis-akrilamid,

akrilamid, bromofenol blue, 2-mercaptoetanol, Coomasie brilliant

blue,etanol 95 %,akuades, reagen folin-ciaceulteu, Na-K-Tartarat, dan

CuSO4 yang didapatkan dari toko bahan kimia Makmur Sejati, Malang.

Asam Trikloroasetat (TCA) dan kasein yang didapatkan dari toko bahan

kimia Krida Tama Persada, malang. Tirosin didapatkan dari laboratorium

Biokimia Jurusan Kimia Universitas Brawijaya, Malang. Bovine Serum

Albumine (BSA) didapatkan dari laboratorium mikrobiologi Jurusan

Biologi Universitas Islam Negeri Al-Maliki, Malang.

3.3 Metode peneltian

Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif kuantitatif dengan 9

perlakuan dan dilakukan 3 kali ulangan. Faktor yang digunakan yaitu

penambahan stabilisator berupa asam askorbat, EDTA dan kombinasi keduanya,

yaitu :

Kontrol : Tanpa Penambahan Stabilisator

A1 : Penambahan Asam Askorbat 0,1%

A2 :Penambahan Asam Askorbat 0,2%


E1 :Penambahan EDTA 5mM

E2 : Penambahan EDTA 10Mm

E3 : Penambahan EDTA 15mM

A1E1 :Penambahan Asam Askorbat 0,1 % dan EDTA 5mM

A2E2: Penambahan Asam Askorbat 0,2 % dan EDTA 10mM

A3E3 : Penambahan Asam Askorbat 0,3 % dan EDTA 15mM

3.4 Pelaksanaan Peneltian

3.4.1 Ekstrasi Mengkudu yang Mengandung Ekstrak Kasar Enzim

Protease (Nafi’ et al., 2013)

Proses ekstraksi ekstrak kasar enzim protease dari mengkudu ini yaitu,

mengkudu dipisahkan dengan tangkainya dan dicuci.

22

Mengkudu ditimbang 100 gram dan dihomogenisasi menggunakan blender

yang ditambah dengan 200 ml buffer kalium fosfat 100 mM pH 7,0 yang

mengandung stabilisator (asam askorbat dan EDTA), dan didapatkan

homogenat.

Homogenat disaring melalui sepotong kain saring tipis dan didapatkan filtrat.

Filtrat kemudian disentrifuse pada 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 30

menit. Kemudian diambil supernatannya dan diukur aktivitas proteolitiknya.

3.4.2 Pemurnian Enzim Protease

3.4.2.1 Pemurnian dengan Menggunakan Amonium Sulfat (Aulanni’am,

2005)

Sebelum dilakukan proses karakterisasi perlu dilakukan pemurnian

parsial enzim dengan tujuan memisahkan enzim dari komponen pengotor lain.

Dilakukan penambahan 60% ammonium sulfat ke dalam 500 ml ekstrak

kasar protease. Penambahan tersebut disertai dengan pengadukan pada

suhu rendah (4oC) agar enzim terhindar dari kerusakan. Suhu campuran

dipertahankan 4oC dengan menambahkan es di sekeliling wadah.

Campuran tersebut didiamkan semalam dalam lemari pendingin agar

pengendapan protein enzim lebih maksimal.

Campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu

4oC selama 10 menit. Supernatannya dibuang dan endapan merupakan

enzim setengah murni.

Penambahan 16 ml buffer fosfat 0,05 M pH 7 dilakukan agar enzim tetap

stabil dan terhindar dari kerusakan.

3.4.2.2 Dialisis (Aulanni’am, 2005)

Fraksi endapan yang diperoleh disuspensikan dengan larutan buffer fosfat

0,05 M pH 7 sampai mencapai volume 16 ml, kemudian dimasukkan dalam

kantong selofan.

Selanjutnya suspense yang ada di dalam kantong selofan direndam dalam

400ml larutan buffer fosfat 0,025 M pH 7 dalam beaker glass 500 ml sambil

menggunakan magnetic stirrer pada suhu 4oC.

Dialisis dilakukan selama semalam. Setelah 6 jam pertama larutan buffer

perendam diganti dengan larutan buffer fosfat 0,025 M pH 7. Dialisis

dilakukan sampai semua garam terpisah.

23

Untuk mengetahui bahwa dialisis sudah selesai, diuji dengan cara diambil 5

ml buffer perendam dan dimasukkan dalam tabung reaksi ditambah 1 ml

larutan HCl 0,1 M dan ditambah 3 tetes larutan BaCl2 0,1 M. Apabila masih

terbentuk endapan, dialisis dibiarkan berjalan semalam. Apabila tidak

terbentuk endapan dialisis dihentikan.

Enzim hasil dialisis diuji aktivitas, kadar protein, aktivitas spesifik dan karakter

berat molekul.

3.4.3 Pembuatan Keju

Pengujian bubuk kering enzim protease pada keju. Pengujian ini

menggunakan 300 ml susu segar dalam gelas beker yang dipanaskan di atas

kompor listrik, kemudian setelah suhu larutan mencapapai suhu tertentu

ditambahkan bubuk kering enzim protease dari buah mengkudu yang telah

diekstrak dengan perlakuan masing-masing seperti di atas. Pemanasan

dilanjutkan sampai suhu 100ºC, larutan diaduk-aduk hingga terbentuk

gumpalan. Pemanasan dan pengadukan dilakukan hingga terbentuk endapan

sempurna, kemudian dipisahkan

3.4.4 Uji Organoleptik

Uji organoleptik dilakukan terhadap sampel berdasarkan metode hedonik

yaitu membandingkan tingkat kesukaan panelis terhadap setiap perlakuan.

Uji organoleptik dilakukan terhadap aroma dan rasa dari keju. Penilaian uji

organoleptik dinyatakan dengan angka, mulai dari angka 1 (sangat tidak

menyukai), 2 (tidak menyukai), 3(agak tidak menyukai), 4 (agak menyukai),

5 (menyukai), 6 (sangat menyukai).

3.5 Analisa Data

Analisa data hasil isolasi dan karakterisasi serta hasil pemurnian enzim

berupa pembahasan secara deskriptif dan eksploratif dengan membandingkan

berdasarkan literature yang mendukung.

24

3.6 Diagram Alir Penelitian

3.6.1 Ekstraksi Protease Mengkudu

Dipisahkan dari tangkainya

Dicuci

Ditimbang 100 gram

Dihomogenisasi

Disaring dengan kain saring tipis

Disentrifugasi pada 10.000 rpm pada suhu 4OC selama 30 menit

Diukur aktivitas proteolitiknya dan dibandingkan dengan kontrol

Gambar 3.1 Diagram Alir Ekstraksi Ekstrak Kasar Enzim Protease dari

Mengkudu (Nafi’ et al, 2013)

Keterangan :

Kontrol : Tanpa Penambahan Stabilisator


A2 :Penambahan Asam Askorbat 0,2%


E1 :Penambahan EDTA 5mM

Mengkudu

Buffer Kalium Fosfat 200ml 0,1 M pH 7,0 dengan perlakuan :

1. Kontrol 2. A1 3. A2 4. A3 5. E1 6. E2 7. E3 8. A1E1 9. A2E2 10. A3E3

Supernatan

Filtrat

Hasil

25

E2 : Penambahan EDTA 10Mm

E3 : Penambahan EDTA 15mM

A1E1 :Penambahan Asam Askorbat 0,1 % dan EDTA 5mM

A2E2: Penambahan Asam Askorbat 0,2 % dan EDTA 10mM

A3E3 : Penambahan Asam Askorbat 0,3 % dan EDTA 15mM

26

3.6.2 Pemurnian Enzim Protease

500 ml ekstrak kasar protease

Didiamkan semalam pada suhu 4oC

Disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm

pada suhu 4oC selama 10 menit

Dimasukkan dalam kantong selofan

Direndam dan diaduk dengan

magnetic stirrer pada suhu 4oC

diambil 5 ml buffer perendam

dialysis dihentikan jika tidak ada endapan

Gambar 3.2 Diagram Alir Pemurnian Enzim Protease

(Aulanni’am, 2005)

50% Ammonium Sulfat

Endapan Enzim

Supernatan

1 ml HCL 0,1 M 3 tetes BaCl2 0,1 M

Enzim protease setengah murni

Uji : 1. Aktivitas Enzim 2. Kadar Protein

Buffer fosfat 0,05 M pH 7


Buffer fosfat 0,025 M pH 7


27

3.6.2 Pembuatan Keju Cottage

- Dilarutkan dalam 500 ml aquades

- Dipasteurisasi pada suhu 63°C selama 10 menit

- Ditambah 10% (v/v) starter campuran

- Disimpan dalam incubator pada suhu 30ºC

- Setelah terjadi penurunan pH, larutan dipindahkan dalam 5 wadah

(masing-masing 100 ml)

- Masing-masing ditambahkan enzim protease kecuali wadah K

- Diinkubasi pada suhu 30ºC sampai pH 4,6

- Masing-masing dipanaskan secara bertahap dalam waterbath pada

suhu 38ºC sampai 48ºC

- Dadih disaring sambil dibilas dengan aquades

- Massa dadih ditimbang

- Masing-masing ditambahkan garam NaCl 4% (w/w) dari massa

dadih

Keterangan:

M1 = Penambahan enzim protease dari buah Mengkudu hasil pengendapan

(konsentrasi 0,02%)

Susu Segar

M1 M2 M3 K

Dadih dan Whey M1

Dadih dan Whey M2

Dadih dan Whey M3

Dadih dan Whey K

Dadih M1 Dadih M2 Dadih M3 Dadih K

Keju Cottage M1 Keju Cottage M2 Keju Cottage M3 Keju Cottage K

28


(konsentrasi 0,04%)


(konsentrasi 0,06%)

K = Kontrol positif dengan penambahan rennet (0,02%)

Gambar 3.3 Diagram Alir Pembuatan Keju Cottage Pada Bebagai Jenis Variasi

Dan Konsentrasi Enzim Protease Dari Mengkudu (Putri, 2012)

bab 3 metodologi penelitian 3.1 tempat dan waktu...

Documents