JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2017

Ekstraksi Monosodium Glutamat menggunakan MolekulTercetak dalam Polimer (MIP) berbasis Kitosan-Glutaraldehid

dalam sistem Kolom

SKRIPSI

oleh:ABDUL MALIK BAHRUDIN

135090200111001

i

Ekstraksi Monosodium Glutamat menggunakan MolekulTercetak dalam Polimer (MIP) berbasis

Kitosan-Glutaraldehid dalam Sistem Kolom

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelarSarjana Sains dalam bidang Kimia

oleh:ABDUL MALIK BAHRUDIN

135090200111001

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2017

iii

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : ABDUL MALIK BAHRUDINNIM : 135090200111001Jurusan : KimiaPenulis skripsi berjudul :

Ekstraksi Monosodium Glutamat menggunakan Molekul Tercetakdalam Polimer (MIP) berbasis Kitosan-Glutaraldehid dalam sistem

Kolom.

Dengan ini menyatakan bahwa:1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya sendiridan tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yangtermaktub di isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulisterbukti hasil jiplakan, maka saya akan bersedia menanggungsegala resiko yang akan saya terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, 8 Agustus 2017Yang menyatakan,

(ABDUL MALIK BAHRUDIN)NIM. 135090200111001

iv

Ekstraksi Monosodium Glutamat menggunakan MolekulTercetak dalam Polimer (MIP) berbasis Kitosan-Glutaraldehid

dalam sistem Kolom

ABSTRAK

Pada penelitian ini telah dipelajari pengaruh pH fasa gerakterhadap efisiensi ekstraksi MSG dengan menggunakan MIP selektifMSG sebagai fasa padat, pH fasa gerak yang digunakan yaitu 6, 7, 8.Selain itu juga dipelajari pengaruh pembuatan MIP sebagai fasapadat untuk ekstraksi MSG terhadap efisiensi ekstraksi. Molekultercetak dalam polimer dibuat dari polimerisasi kitosan dan MSGdengan glutaraldehid sebagai senyawa pengikat silang. Padapenelitian ini digunakan dua jenis MIP yaitu MIP A dan B.Pembuatan MIP jenis A dilakukan dengan mencetak hasilpolimerisasi kitosan, MSG dengan glutaraldehid pada pelat kaca,setelah kering MIP dihaluskan dan diayak dengan ayakan sebesar 60-90 mesh. MIP jenis B dibuat melalui proses pembuatan granuldengan bantuan pompa syringe. Hasil penelitian ini menunjukkanbahwa pH dan pembuatan MIP mempengaruhi efisiensi ekstraksiMSG. Efisiensi ekstraksi optimum diperoleh pada pH 8 sebesar 90%pada MIP A dan 89% pada MIP B.

Kata kunci: MSG, MIP, pH fasa gerak dan efisiensi ekstraksi..

v

Extraction of Monosodium Glutamate using MolecularlyImprinted Polymers (MIP) based on chitosan-glutaraldehyde

in column system

ABSTRACT

In this study have studied the effect of mobile phase pH onefficiency of MSG extraction used MIP selective MSG as solidphase, pH of stationary phase used 6, 7, 8. Also studied the effect ofmake MIP as solid phase for MSG extraction on the efficiency ofextraction. The molecules imprinted in polymer are prepared fromchitosan polymerization and MSG with glutaraldehyde ascrosslinking compound. In this research used two types of MIP thatwas MIP A and B. Preparation of MIP type A was performed byprinted the results of chitosan polymerization, MSG withglutaraldehyde on the glass plate, after drying the MIP mashed thensieved with sieve of 60-90 mesh. MIP type B is made through theprocess of make granules with syringe pump. The results of thisstudy that pH and MIP manufacture affect the extraction efficiencyof MSG. The optimum extraction efficiency was obtained at pH 8 of90% in MIP A and 89% in MIP B.

Keywords: MSG, MIP, pH of mobile phase, and extractionefficiency.

vi

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuhAlhamdulillahirabbil’alamin, segala puji hanya layak untuk

Allah atas segala berkah, rahmat, serta hidayah-Nya, sehinggapenulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul EkstraksiMonosodium Glutamat menggunakan Molekul Tercetak dalamPolimer (MIP) berbasis Kitosan-Glutaraldehid dalam sistemKolom dengan baik sebagai salah satu syarat kelulusan untukmemperoleh gelar Sarjana Sains dalam bidang Kimia di FakultasMIPA, Universitas Brawijaya.

Dalam penyusunan dan penulisan skripsi ini tidak terlepasdari bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak. Olehkarena itu, penulis menyampaikan terima kasih kepada semua pihakyang telah mendukung. Dari sanalah semua kesuksesan ini berawal,semoga semua ini memberikan sedikit kebahagiaan dan menuntunpada langkah yang lebih baik lagi. Meskipun penulis berharap isidari skripsi ini bebas dari kekurangan dan kesalahan, namun selaluada yang kurang. Karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritikyang sifatnya membangun agar skripsi ini dapat lebih baik lagi dansemoga bermanfaat bagi kita semua.

Malang, Agustus 2017

Penulis

vii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL iHALAMAN PENGESAHAN iiHALAMAN PERNYATAAN iiiABSTRAK ivABSTRACT vKATA PENGANTAR viDAFTAR ISI viiDAFTAR GAMBAR ixDAFTAR TABEL xDAFTAR LAMPIRAN xiBAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang 11.2 Rumusan Masalah 31.3 Batasan Masalah 31.4 Tujuan Penelitian 31.5 Manfaat Penelitian 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Metode Penentuan MSG 42.2 MIP (Molecularly Imprinted Polymer) selektif

MSG 62.3 Ekstraksi MSG dengan MIP selektif MSG 82.4 Kromatografi 9

BAB III METODOLOGI PENELITIAN3.1 Waktu dan Tempat Penelitian 113.2 Alat dan Bahan Penelitian 11

3.2.1 Alat 113.2.2 Bahan 11

3.3 Tahapan Penelitian 123.4 Prosedur Kerja 12

3.4.1 Pembuatan MIP A 123.4.2 Pembuatan MIP B 12

viii

3.4.3 Preparasi Kolom 133.4.4 Pembuatan Kurva Baku MSG 133.4.5 Pengaruh pH 143.4.6 Penentuan efisiensi ekstraksi 14

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Pengaruh pH fasa gerak 164.2 Ekstraksi MSG 18

BAB V PENUTUP5.1 Kesimpulan 215.2 Saran 21

DAFTAR PUSTAKA 22LAMPIRAN 26

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 : Struktur molekul Monosodium Glutamat 4Gambar 2.2 : Struktur Kitosan 6Gambar 2.3 : Reaksi antara kitosan dan glutaraldehid 7Gambar 4.1 : Pengaruh pH fasa gerak terhadap elusi MSG

(mg) pada MIP A 16Gambar 4.2 : Pengaruh pH fasa gerak terhadap elusi MSG

(mg) pada MIP B 17Gambar 4.3 : Diagram efisiensi ekstraksi MSG 150 ppm

terhadap pH pada MIP jenis A dan B 19Gambar B.1 : Kurva Baku MSG pH 6 35Gambar B.2 : Kurva Baku MSG pH 7 36Gambar B.3 : Kurva Baku MSG pH 8 37

x

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 : Kesetimbangan MSG dalam larutanya 5Tabel B.1 : Data pengukuran serapan MSG

pengulangan 1 pada MIP A 32Tabel B.2 : Data pengukuran serapan MSG

pengulangan 1 pada MIP B 33Tabel B.3 : Data pengukuran serapan MSG

pengulangan 2 pada MIP A 34Tabel B.4 : Data pengukuran serapan MSG

pengulangan 2 pada MIP B 35Tabel B.5 : Data pengukuran serapan MSG pada pH

6 dengan buffer fosfat 0,01 M 36Tabel B.6 : Data pengukuran serapan MSG pada pH

7 dengan buffer fosfat 0,01 M 37Tabel B.7 : Data pengukuran serapan MSG pada pH

8 dengan buffer fosfat 0,01 M 38Tabel B.8 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 1 pada MIP A 39Tabel B.9 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 1 pada MIP B 39Tabel B.10 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 2 pada MIP A 40Tabel B.11 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 2 pada MIP B 40Tabel B.12 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 3 pada MIP A 41Tabel B.13 : Data perhitungan efisiensi ekstraksi

MSG ulangan 3 pada MIP B 41

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran A. Pembuatan dan perhitungan Larutan..........................26A.1 Larutan asam asetat 2 % dari asam asetat

glasial (99,7%).................................................. 26A.2 Larutan MSG 0,5 M............................................ 26A.3 Larutan glutaraldehid 0,1% dari glutaraldehid

50%......................................................................26A.4 Larutan MSG 150 ppm....................................... 27A.5 Larutan HCl 0,01 M dari 37 %........................... 27A.6 Larutan NaOH 6 M.............................................. 27A.7 Larutan Buffer......................................................28A.7.1 Larutan Buffer pH 6.......................................28A.7.2 Larutan Buffer pH 7...................................... 29A.7.3 Larutan Buffer pH 8 .................................... 29

A.8 Larutan stok MSG 1000 ppm.............................. 29A.9 Pereaksi Nessler................................................... 30A.10 Larutan baku MSG .................. 30A.10.1 Larutan baku MSG 100 ppm.............. 30A.10.2 Larutan baku MSG 150 ppm.............. 30A.10.3 Larutan baku MSG 200 ppm.............. 30A.10.4 Larutan baku MSG 250 ppm.............. 31A.10.5 Larutan baku MSG 300 ppm.............. 31

Lampiran B. Data Penelitian........................................................... 32B.1 Data perhitungan serapan MSG pengulangan 1 . 32B.2 Data perhitungan serapan MSG pengulangan 2 . 34B.3 Data perhitungan Kurva Baku MSG pH 6............36B.4 Data perhitungan Kurva Baku MSG pH 7............37B.5 Data perhitungan Kurva Baku MSG pH 8............38B.6 Data perhitungan efisiensi ekstraksi MSG 39B.6.1 Data perhitungan efisiensi ekstraksi MSG

ulangan 1 39B.6.2 Data perhitungan efisiensi ekstraksi MSG

ulangan 2 40B.6.3 Data perhitungan efisiensi ekstraksi MSG

ulangan 3 41

1

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salah satu dari sejumlah bentuk garam asam glutamat adalahMonosodium Glutamat (MSG). MSG merupakan asam aminonon-esensial, dan bahan tambahan makanan yang banyak dijual sebagaikristal putih halus seperti garam dan gula. Konsentrasi MSG terbesaruntuk dikonsumsi manusia adalah 60 mg/kg berat badan [1]. KonsumsiMSG yang dibatasi menyebabkan perlunya metode atau alat untukmenentukan kadar MSG dalam sampel makanan.

Penentuan kadar MSG dilakukan secara tidak langsung sebagaiNH4+ melalui destruksi Kjeldahl [2]. Hasil destruksi dianalisamenggunakan pereaksi Nessler secara spektrofotometri sinar tampak.Namun penentuan dengan metode Nessler kurang spesifik karena NH4+

yang terdeteksi berasal dari semua senyawa yang mengandung unsurnitrogen. Oleh karena itu diperlukan preparasi yang selektif untukmemisahkan MSG dari sumber amonia lain.

Ekstraksi fasa padat adalah metode preparasi sampel dengankonsentrasi rendah. Ekstraksi fasa padat terdiri dari fasa cair dan fasapadat. Ekstraksi asam glutamat yang sudah dikembangkan antara lainkromatografi penukar ion. Prinsip kromatografi penukar ion berdasarkanpI dari masing- masing asam amino. Asam amino akan terpisah denganpH larutan buffer yang sesuai dengan asam amino yang akan dipisah.Namun metode ini kurang selektif karena asam glutamat dan asamaspartat memiliki pI berdekatan yaitu 3,25 dan 2,77, sehingga sulitdipisahkan [3]. Selain kromatografi penukar ion asam glutamat dapatekstraksi menggunakan emulsi membran cair. Prinsip ekstraksi emulsimembran cair didasarkan pada difusi asam glutamat melalui membrancair (kerosen, tri-etanol amin sebagai pengemulsi dan asam oleatsebagai molekul pembawa) ke dalam fasa eksternal (air). Pemisahanterjadi pada pH 4 (air) dan pH 7,8 (larutan asam amino). Namun metode

2

emulsi membran cair ini belum efektif karena persen perolehan kembali(recovery) yang diperoleh sebesar 66% [4]. Untuk mengatasikekurangan tersebut asam glutamat dapat diekstrak secara selektifmenggunakan Moleculary Imprinted Polymer (MIP).

MIP adalah fasa padat yang dikembangakan untuk memisahkandan mengukur kandungan zat kimia, termasuk obat dan molekul bioaktifdalam matriks kompleks [5]. MIP merupakan polimer sintesis hasil daripolimerisasi monomer fungsional dan molekul cetakan dengan bantuanmolekul pengikat silang [6]. Menurut Monier [7] molekul MSG yangtercetak dalam pembuatan MIP menggunakan polimer kitosan yangdiikat silang dengan glutaraldehid akan menjadi faktor pemisah yangselektif. Bentuk MSG dalam larutan dipengaruhi oleh pH, sehinggadibutuhkan kondisi konstan agar MSG dalam bentuk asam glutamatdapat berinteraksi secara maksimal dengan fasa padat yang digunakan.Prinsip ekstraksi fasa padat adalah perpindahan analit dari fasa cair kedalam fasa padat dan diperoleh kembali kedalam fasa cair denganmencuci kolom menggunakan fasa cair. Ekstraksi dalam kolommemiliki keunggulan dapat digunakan sebagai aplikasi preparatif, lebihpraktis, dan memiliki kondisi proses lebih konstan, sehingga padapenelitian ini MIP dikembangkan dalam sistem kolom.

Berdasarkan teori ekstraksi, ekstraksi yang baik adalah ekstraksiyang menghasilkan efisiensi ekstraksi yang besar. pH fasa gerak sangatmempengaruhi bentuk MSG pada proses ekstraksi. MSG memiliki tigapKa yaitu 2,11; 4,25 dan 9,67 serta pKa kitosan sebesar 6,5 [8]. Pada pH<6 MIP akan mengalami pembengkakan (swelling) dan pada pH >6MSG memiliki bentuk seperti tabel 2.1 nomor 3 dan 4, sehinggaekstraksi dilakukan pada pH 6- 8. Selain pH, pembuatan MIP jugaberpengaruh terhadap efisiensi ekstraksi MSG. Oleh karena itu dalampenelitian ini akan dipelajari pengaruh pH fasa gerak dan pembuatanMIP, sehingga didapatkan efisiensi ekstraksi yang baik. Pada penelitianini MIP selektif MSG dalam sistem kolom, diharapkan dapatmengekstrak MSG dengan efisiensi ekstraksi 100%.

3

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana pengaruh pH fasa gerak terhadap efisiensi ekstraksiMSG?

2. Bagaimana pengaruh pembuatan MIP selektif MSG jenis Adan B terhadap efisiensi ekstraksi MSG ?

1.3 Batasan Masalah

1. Digunakan fasa diam berdasarkan pembuatan MIP A dan MIP B2. Diameter kolom yang digunakan 0,83 cm3. Laju alir yang digunakan 0,5 mL/menit

1.4 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui pengaruh pH fasa gerak terhadap efisiensi ekstraksiMSG.

2. Mengetahui pengaruh pembuatan MIP A dan B terhadap efisiensiekstraksi MSG.

1.5 Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian dapat digunakan sebagai referensi dalampengembangan metode pemisahan biomolekul menggunakan MIPkitosan/glutaraldehid.

4

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Metode penentuan MSG

Monosodium glutamat (MSG) adalah garam sodium asamL-glutamat yang digunakan sebagai bahan penyedap makanan untukmerangsang selera. MSG adalah hasil dari pemurnian glutamat ataugabungan dari beberapa asam amino dengan sejumlah kecil peptidayang dihasilkan dari proses hirolisa protein. Asam glutamat digolongkanpada asam amino non essensial karena tubuh manusia sendiri dapatmenghasilkan asam glutamat. Asam Glutamat merupakan unsur pokokdari protein yang terdapat pada bermacam-macam sayuran, daging, ikandan air susu ibu. Dosis maksimal MSG yang dapat dikonsumsi perharioleh manusia sebesar 60 mg/kg berat badan [1]. MSG memiliki rumuskimia C5H8NO4Na dengan massa molekul 169,1 g mol-1. MSGmempunyai struktur seperti gambar 2.1 [9] dan kesetimbangan dalamlarutan seperti Tabel 2.1 [10].

Gambar 2.1 Struktur molekul Monosodium Glutamat

Berdasarkan tabel 2.1 dapat diketahui bahwa pH sangatmempengaruhi struktur MSG dalam larutannya. Pada pH < 2,2 MSGbermuatan positif (+1) pada gugus amina. Pada pH > 2,2 struktur MSGmulai berubah menjadi tidak bermuatan karena terbentuknya anion padagugus -OH karboksil, sehingga pada pH 3,22 struktur MSG bermuatannol. Peristiwa tersebut dinamakan zwitter ion karena jumlah kation dananion sama dalam satu senyawa. Pada pH > 4,25 MSG bermuatannegatif (-1) akibat gugus karboksil pada rantai samping melepas ion H+

dan pH > 9,67 mengubah stuktur MSG menjadi bermuatan negatif (-2)akibat deprotonasi gugus amina [10]. Perbedaan struktur MSG pada pH

5

tertentu memudahkan proses ekstraksi dan penentuan MSG.

Tabel 2.1 Kesetimbangan MSG dalam larutannya [10].

No pH Muatan Struktur

1. 0 - 2,2 + 1

2. 2,2 - 4,25 0

3. 4,25 - 9,67 - 1

4. 9,67 - 14 - 2

Metode Nessler merupakan metode baku dalam penentuankadar amonia. Kadar MSG dapat ditentukan secara tidak langsungsebagai NH4+ melalui destruksi Kjeldahl dengan penambahan H2SO4

sebagai pendestruksi, menjadi amonium sulfat ((NH4)2SO4). Tahapanpembentukan amonium sulfat ((NH4)2SO4) dapat dilihat pada persamaan2.1 [11].

NH4+ + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2O + CO2 (2.1)

2[HgI4]2- (aq) + NH4++ 4OH- NH2OHg2I(aq) + 7I-(aq) + 3H2O (2.2)

Amonium dianalisis secara spektrofotometri sinar tampakdengan metode Nessler. Prinsip dari metode Nessler adalah mereaksikanamonium dengan larutan basa kalium tetraiodomerkurat (II) seperti padapersamaan 2.2, sehingga didapatkan larutan yang berwarna kuninghingga merah bata pada panjang gelombang 425 nm [12]. Namun

6

metode tersebut masih membutuhkan preparasi sampel untukmemisahkan MSG dari unsur nitrogen yang lain. Untuk memisahkannyadapat menggunakan MIP (Molecularly Imprinted Polymer) sebagaimetode preparatif terbaru dan selektif.

2.2 MIP (Molecularly Imprinted Polymer) selektif MSG

MIP adalah adsorben yang dikembangakan untuk memisahkandan mengukur kandungan zat kimia, termasuk obat dan molekul bioaktifdalam matriks kompleks [5]. MIP merupakan polimer sintesis dari hasilpolimerisasi monomer fungsional dan molekul cetakan dengan molekulpengikat silang [6]. Molekul yang dicetak pada polimer akan dilepaskankembali sehingga menghasilkan polimer dengan cetakan yang secarabentuk, ukuran, dan susunan kimia mirip dengan molekul cetakan.Cetakan yang terbentuk dalam MIP dapat menjadi pemisah selektifuntuk memisahkan MSG dengan sumber nitrogen yang lain [8]. Selainterbentuknya cetakan terdapat interaksi intermolekuler antara analit danfasa padat seperti ikatan hidrogen, dipol - dipol dan ikatan ionik [13].

Gambar 2.2 Stuktur kitosan

Salah satu bahan yang berpotensi sebagai monomer fungsionaladalah kitosan karena memiliki gugus hidroksil dan amina. Kitosanbersifat biodegredable, tidak beracun dan keberadaannya yangmelimpah [9]. Kitosan larut dalam asam asetat dan asam formiat encerdan memiliki pKa 6,5 [14]. Kitosan dapat dengan mudah berinteraksidengan zat organik seperti protein dan memiliki struktur seperti padagambar 2.2. Kitosan memiliki kelemahan mudah membengkak (swelling)

7

pada pH < 6,5 akibat protonasi pada gugus amino yang membentuk-NH3+. Namun hal tersebut dapat diatasi dengan mengikat silang kitosandengan glutraldehid, genipin, gyloxal dan dextran sulfat [15]. Fungsidari ikat silang dengan beberapa senyawa pengikat silang tersebutadalah untuk meningkatkan sifat mekanik dari kitosan [16].

Glutaraldehid dipilih sebagai senyawa pengikat silang karenamempunyai dua gugus aldehid yang reaktif terhadap gugus amina padakitosan sehingga apabila direaksikan, glutaraldehid akanmenghubungkan antar polimer kitosan. Glutaraldehid memiliki rumusmolekul C5H8O2 atau CH2(CH2CHO)2. Reaksi yang terbentuk antarakitosan dan glutaraldehid seperti pada gambar 2.3 [17].

Gambar 2.3 Reaksi ikat silang antara kitosan dan glutaraldehid (a)kitosan; (b) glutaraldehid; (c) Hasil ikat silang antarakitosan dengan glutaraldehid [17].

(a)

(b)

(c)

8

2.3 Ekstraksi MSG dengan MIP selektif MSG

Ekstraksi merupakan proses pemisahan satu atau lebih komponendari suatu campuran homogen. Ekstraksi fasa padat (EFP) adalahmetode preparasi sampel yang efektif untuk berbagai sampel dengankonsentrasi yang rendah. Ekstraksi fasa padat terdiri fasa cair dan fasapadat [18]. Pada penelitian ini MIP selektif MSG digunakan sebagaifasa padat karena mempunyai cetakan selektif, sehingga ketika MSGdalam larutannya yang mempunyai bentuk sesuai dengan cetakandilewatkan kedalam kolom akan tertahan pada fasa padat.

Prinsip ekstraksi fasa padat adalah perpindahan analit dari fasacair ke dalam sisi aktif fasa padat yang disebut retensi. Retensidipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain ukuran analit, fasa gerak,dan fasa padat [19]. Kemampuan fasa padat dalam mengadsorpsi danmenahan analit dipengaruhi oleh laju alir, ukuran partikel dankonsentrasi sampel [20]. Untuk memperoleh kembali analit yangteradsorpsi pada fasa padat dilakukan proses pencucian kolom denganmengalirkan fasa cair ke dalam kolom sehingga terjadi perpindahananalit dari fasa padat menuju fasa cair atau disebut dengan proses elusi[21].

Ekstraksi asam glutamat yang sudah dikembangkan antara lainkromatografi penukar ion. Prinsip kromatografi penukar ion berdasarkanpI dari masing- masing asam amino. Asam amino akan terpisah denganpH larutan buffer yang sesuai dengan asam amino yang akan dipisah [3].Namun metode ini kurang selektif karena asam glutamat dan asamaspartat memiliki pI berdekatan yaitu 3,25 dan 2,77 [22]. Selainkromatografi penukar ion asam glutamat dapat ekstraksi menggunakanemulsi membran cair. Prinsip ekstraksi emulsi membran cair didasarkanpada difusi asam glutamat melalui membran cair (kerosen, tri-etanolamin sebagai pengemulsi dan asam oleat sebagai molekul pembawa) kedalam fasa eksternal (air). Pemisahan terjadi pada pH 4 (air) dan pH 7,8(larutan asam amino). Namun metode emulsi membran cair ini belumefektif karena persen perolehan kembali (recovery) sebesar 66% [4].Untuk mengatasi hal tersebut pada penelitian ini menggunakan MIP

9

selektif MSG sebagai aplikasi preparatif yang dikembangkan dalamsistem kolom.

Ektraksi dalam kolom memiliki keunggulan dapat digunakansebagai aplikasi preparatif, lebih praktis, dan memiliki kondisi proseslebih konstan. Faktor yang mempengaruhi ekstraksi menggunakankolom adalah bentuk molekul asam glutamat, pH fasa gerak danpembuatan fasa padat (MIP). Bentuk molekul asam glutamat danketahanan MIP dipengaruhi oleh pH. Pada pH <6 MIP membengkak(swelling) dan pada pH >6 MSG memiliki bentuk seperti pada tabel 2.1nomor 3, sehingga pemisahan dilakukan pada pH 6-8. Penggunaankolom dalam EFP memiliki prinsip yang sama dengan metodekromatografi.

2.4 Kromatografi

Kromatografi dibagi menjadi tiga berdasarkan jenis fasa diamyaitu, kromatografi padat, penukar ion, dan gel. Berdasarkan fasa gerakyang digunakan pada kromatografi padat dibagi menjadi dua yaitu gasdan cair. Aplikasi untuk fasa diam berupa padatan dan fasa gerak berupacairan, dilakukan kedalam sistem kolom. Faktor yang mempengaruhiefektifitas metode kromatografi antara lain waktu retensi (tR), faktorkapasitas (k’), dan efisiensi kolom (H). Waktu retensi (tR) adalahperiode waktu yang dilalui mulai sampel dimasukkan ke dalam kolomhingga diperoleh sinyal maksimum sehingga membentuk puncakkromatogram. Faktor kapasitas (k’) menunjukkan kekuatan retensi fasadiam terhadap analit yang tidak dipengaruhi oleh laju alir dan panjangkolom. Faktor kapasitas dapat diperoleh dengan membagi waktu retensibersih (t’R) dengan waktu hampa (t0) [23, 18].

k ' =t 'RtM

=tR− tMtM

Efisiensi kolom adalah ukuran tingkat penyebaran puncak dalamkolom yang ditunjukkan berdasarkan bentuk kromatogram. Efisiensikolom berhubungan dengan jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang

(2.3)

10

kolom (L) yang ditunjukkan pada persamaan dan [24].

N=16(t Rw )2

H = LN

Pemisahan semakin baik jika nilai N semakin tinggi, untukkromatografi cair jumlah lempeng teoritis untuk terjadinya retensiadalah 100. Kolom dengan efisiensi yang baik menghasilkan bentukkromatogram dengan lebar puncak (w) sempit [24]. Hasil pemisahanmenggunakan metode kromatografi dapat dilihat berdasarkan puncakyang terbentuk pada kromatogram. Bentuk kromatogram yang sempurnamemiliki nilai faktor tailing dan asimetri sebesar 1, jika lebih besar ataukurang dari 1 maka puncak yang terbentuk tidak simetris [24].

(2.4)

(2.5)

11

BAB IIIMETODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia AnalitikJurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam(FMIPA) Universitas Brawijaya Malang. Penelitian ini dilaksanakanpada bulan Maret 2017 hingga Juni 2017.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 AlatAlat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah

Spektrofotometer Sinar tampak / UVmini-1240 (Shimadzu), pHuniversal (Merck), neraca analitik (Ohhaus), mortar, ayakan 60 dan 90mesh, kolom (syringe OneMed 10 mL d= 0,83 cm), oven (Memmert),pompa syringe (Shimadzu), serta peralatan gelas yang umum digunakandalam laboratorium kimia.

3.2.2 Bahan

Bahan - bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kitosanteknis, larutan glutaraldehid 1% (v/v) (dari glutaraldehid 50%Sigma-Aldrich), akuades, larutan H2SO4 p.a 97% bj 1,84 g/cm3, larutanHCl 37% (b/v), MSG, larutan CH3COOH 99,7%, KI (Merck), padatanNaOH p.a (Merck), HgCl2 (Merck), padatan K2HPO4 (Merck) danKH2PO4 (Merck).

12

3.3 Tahapan Penelitian

Tahapan penelitian ini adalah:1. Pembuatan MIP A2. Pembuatan MIP B3. Preparasi kolom4. Pembuatan kurva baku MSG5. Pengaruh pH fasa gerak6. Penentuan efisiensi ekstraksi

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Pembuatan MIP A

MIP jenis A dibuat dengan cara: 10g kitosan dilarutkan dalam500 mL asam asetat 2% pada temperatur 60o C. Setelah kitosan larutditambahkan 50 mL larutan MSG 0,5 M. Campuran diaduk selama 2jam, kemudian ditambahkan 25 mL larutan glutaraldehid 1% dan diaduklagi selama 1 jam. Akhir dari proses ini terbentuk gel setelah 2 harididiamkan, selanjutnya agar agar dicuci dengan HCl 0,01 M dandikeringkan diatas cetakan kaca dalam oven 600C selama 24 jam.Kemudian setiap 3 gram MIP dicuci menggunakan 1000 mL HCl 0,1 Mselama 24 jam, proses pencucian dilakukan tiga kali. Pada setiap kalipencucian MIP disaring dan dicuci dengan akuades hingga pH hasilcucian sama dengan pH akuades. Setelah MIP dikeringkan dalam ovendengan temperatur 60oC selama 24 jam. MIP yang kering dihaluskanmenggunakan blender dan mortar, kemudian diayak dengan ayakan 60dan 90 mesh.

3.4.2 Pembuatan MIP B

MIP jenis B dibuat dengan cara: 5 g kitosan dilarutkan dalam 250

13

mL asam asetat 2% pada temperatur 60o C. Setelah kitosan larutditambahkan 25 ml larutan MSG 0,5 M. Campuran diaduk selama 2 jam,kemudian ditambahkan 5,0 ml larutan glutaraldehid 1% dan diaduk lagiselama 1 jam. Larutan tersebut dimasukkan kedalam syringe 20 mLdengan jarum ukuran 24 diteteskan kedalam larutan NaOH 1 Mmenggunakan pompa syringe. Butiran MIP yang terbentuk dicucidengan akuades, kemudian direndam kedalam larutan glutraldehid0,02 % selama 24 jam dan di kocok dengan shaker pada kecepatan 125rpm. MIP dicuci dengan HCl 0,1 M selama 8 jam, kemudian dicucidengan akuades hingga pH hasil cucian sama dengan pH akuades. MIPdikeringkan ke dalam oven selama 30 menit dengan temperatur 60oC.

3.4.3 Preparasi kolom

Kolom dibersihkan menggunakan akuades lalu dikeringkan.Kolom diisi akuades sebanyak 4 mL dan glass wool dimasukkan padaujung kolom. Fasa padat MIP yang telah direndam dengan akuadesdimasukkan kedalam kolom. Glass wool dimasukkan pada kolom untukmelindungi permukaan MIP. Sisa akuades dalam kolom dikeluarkanhingga permukaan glass wool (atas). Kolom dirangkai dan laju alirdiatur sebesar 0,5 mL/menit.

3.4.4 Pembuatan Kurva Baku MSG

Larutan monosodium glutamat 1000 ppm diambil sebanyak 2,5mL, 3,75 mL, 5 mL, 6,75 mL dan 7,5 mL. Masing-masing larutan MSGdiencerkan ke dalam labu ukur 25 mL dengan larutan buffer fosfat 0,01M pH 6, sehingga didapatkan larutan MSG dengan konsentrasi 100 ppm,150 ppm, 200 ppm, 250 ppm dan 300 ppm. Masing - masing larutandimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 ml dan dilakukan destruksi denganmenambahkan 0,5 mL larutan H2SO4 97% dan dipanaskan pada suhu200oC selama 30 menit. Larutan hasil destruksi diencerkan denganbuffer fosfat 0,01 M pH 6 dalam labu ukur 25 mL dan diambil 2 mL.

14

Kemudian 2,0 mL larutan hasil pengenceran ditambahkan 3,0 mLlarutan NaOH 6 M dan 1,0 mL pereaksi Nessler. Larutan campurandidiamkan selama 10 menit dan diukur absorbansinya menggunakanspektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 425 nm. Datayang diperoleh dibuat kurva hubungan antara konsentrasi terhadapabsorbansi. Perlakuan yang sama digunakan untuk membuat kurva bakupada pH 7 dan 8.

3.4.5 Pengaruh pH fasa gerak

Larutan MSG 150 ppm dalam buffer fosfat 0,01M pH 6 sebanyak2 mL dialirkan kedalam kolom yang berisi MIP dan fasa gerak larutanbuffer fosfat 0,01 M pH 6. MSG dielusi dengan larutan buffer fosfat0,01 M pH 6 sebanyak 22 mL dialirkan kedalam kolom. Kedua krandibuka dengan kecepatan alir sama (0,5 mL/menit). Eluat yang keluardari kolom ditampung setiap 2 mL dan didestruksi dengan 0,5 mLH2SO4 97% pada temperatur 200oC selama 30 menit. Larutan hasildestruksi diencerkan dengan larutan buffer pH 6 hingga 5 mL,kemudian ditambahkan 3,0 ml NaOH 6 M dan 1,0 mL pereaksi Nessler.Larutan dikocok dan didiamkan 10 menit lalu diukur absorbansinyamenggunakan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang425 nm. Perlakuan yang sama dilakukan untuk fasa gerak pH 7 dan 8.

3.4.6 Penentuan efisiensi ekstraksi

Penentuan efisiensi ekstraksi dilakukan pada pH 6, 7 dan 8menggunakan buffer fosfat 0,01 M. Tahapan yang dilakukan samadengan tahapan pada 3.4.3, namun fraksi yang ditampung mulai darifraksi ke 2-6,5 untuk MIP A sedangkan MIP B, pada fraksi ke 2-5.Fraksi tersebut didestruksi dengan menambahkan 0,5 mL H2SO4 97%dan dipanaskan pada temperatur 200oC selama 30 menit. Hasil destruksidiencerkan hingga 10,0 mL, kemudian diambil 2,0 mL. 2,0 mL larutan

15

hasil destruksi ditambahkan 3,0 mL NaOH 6 M dan 1,0 mL pereaksiNessler. Larutan dikocok dan didiamkan selama 10 menit lalu diukurabsorbansi larutan menggunakan spektrofotometer sinar tampak padapanjang gelombang 425 nm.

Rumus menghitung efisiensi ekstraksi MSG :

Efisiensi Ekstraksi = massaMSG yang terelusimassa MSG awal

×100%

16

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengaruh pH fasa gerak

Pada penelitian ini digunakan MIP dengan 2 prosedur yangberbeda seperti pada 3.4.1 dan 3.4.2. Gambar 4.1 dan 4.2 menyajikankromatogram MIP A dan B pada pH 6, 7 dan 8.

Gambar 4.1 Pengaruh pH fasa gerak terhadap elusi MSG (mg)pada MIP A.

Berdasarkan gambar 4.1 terdapat dua puncak yang terbentukpada pH 6 dan 7. Puncak pertama merupakan MSG yang memilikimuatan total -1 dengan bentuk seperti pada tabel 2.1 nomor 3. Puncakkedua merupakan puncak bias yang terbentuk pada salah satu hasilpengulangan pengukuran dan puncak tersebut dianggap tidak ada.Meningkatnya kurva berbanding lurus dengan jumlah MSG yangterelusi. Jika ditinjau dari bentuk kromatogram pada masing- masing pH,pada pH 6 terbentuk lebar puncak yang lebih sempit. Lebar puncak yangsempit akibat dari jumlah cetakan MSG yang lebih sedikit, sehingga

17

proses elusi lebih cepat. Jumlah gugus amina yang tidak terikat silangpada MIP juga mempengaruhi proses elusi dan jumlah MSG yangterelusi. Jumlah MSG yang terelusi pada pH 6 jika dilihat darikromatogram paling sedikit jika dibandingkan dengan pH 7 dan 8.

Semakin besar pH berbanding terbalik dengan jumlah gugus-NH3+ yang terbentuk akibat proses protonasi (MSG yang tertahandalam kolom) dan berbanding lurus dengan jumlah MSG yang tertahan.Lebar puncak pada kromatogram pH 7 lebih besar akibat jumlah cetakanMSG yang terdapat pada MIP lebih banyak, sehingga membutuhkanwaktu lebih banyak bagi MSG untuk keluar dari kolom. Begitu puladengan pH 8, terbentuk puncak yang lebih lebar dibanding pH 6 dan 7.Semakin lebar puncak menandakan semakin lama MSG tertahandidalam kolom akibat meningkatnya jumlah cetakan MSG. JumlahMSG yang terelusi pada setiap pH relatif meningkat dari pH 6- 8 dengannilai 39,2, 41,1 dan 41,3 mg, karena efisiensi ekstraksi berbanding lurusdengan meningkatnya jumlah MSG yang terelusi maka ekstraksi MSGpada MIP A terjadi baik pada pH 8.

Gambar 4.2 Pengaruh pH fasa gerak terhadap elusi MSG (mg)pada MIP B.

18

Berdasarkan gambar 4.2, puncak yang terbentuk kemungkinanadalah MSG yang memiliki muatan total -1 dengan bentuk seperti padatabel 2.1 nomor 3. Jika dilihat dari lebar puncak, pH 8 memiliki lebarpuncak paling sempit apabila dibandingkan dengan kromatogram padapH 6 dan 7. Lebar puncak yang sempit disebabkan karena adanyainteraksi MSG dengan HPO42- dari buffer fosfat pH 8, sehingga tertahanlebih sebentar pada cetakan MSG dan MSG yang tidak berinteraksitertahan lebih lama sehingga menghasilkan kurva mendatar.

Luas permukaan pada MIP juga berpengaruh terhadap proseselusi karena meningkatnya luas permukaan berbanding lurus denganjumlah cetakan MSG. Luas permukaan MIP A > MIP B. Semakinsedikit cetakan MSG maka kecenderungan MSG untuk tertahan tanpamelewati cetakan MSG semakin besar dan puncak yang terbentuksemakin sempit. Semakin menurun pH berbanding lurus dengan jumlahgugus -NH2 pada MIP yang terprotonasi sehingga meningkatkaninteraksi antara MSG, MIP, dan buffer dalam kolom. Jika ditinjau dariefisiensi ekstraksi, efisiensi ekstraksi berbanding lurus dengan jumlahMSG yang terelusi. Pada pH 6- 8 MSG yang terelusi relatif meningkatdari 40, 43 dan 46 mg (berdasarkan kromatogram), sehingga pHoptimum untuk ekstraksi MSG menggunakan fasa diam MIP B adalahpH 8.

4.2 Ekstraksi MSG

Ekstraksi MSG dilakukan pada pH 6, 7 dan 8 pada MIP A dan B.Ekstraksi pada MIP A dilakukan dengan mengambil fraksi ke 2-6,5 danMIP B pada fraksi ke 2-5. Pengambilan fraksi tersebut berdasarkanpuncak yang terbentuk pada gambar 4.1 dan 4.2. Berdasarkan gambar4.3 terjadi peningkatan efisiensi ekstraksi dari pH 6 hingga 8. Haltersebut terjadi karena adanya interaksi molekul yang terjadi didalamkolom. Pada pH <6,5 gugus amina yang tidak terikat glutaraldehid pada

19

kitosan terprotonasi membentuk -NH3+ dan pada pH 4,25 - 9,67 MSGberbentuk seperti pada tabel 2.1 nomor 3. Pada pH > 6,5 kitosan mulaiberubah menjadi tidak bermuatan akibat deprotonasi gugus -NH3+

menjadi -NH2. Jumlah gugus amina yang terprotonasi (tidak terikatsilang) semakin menurun dengan bertambahnya pH, sehingga semakinkecil kemungkinan terjadi interaksi antara MSG dengan MIP pada pH 8.Selain itu fasa gerak yang digunakan tidak mampu mengelusi MSGyang berinteraksi dengan -NH3+ pada MIP karena memiliki kepolaranyang sama, sehingga MSG masih tertahan didalam kolom.

Gambar 4.3 Diagram efisiensi ekstraksi MSG 150 ppm terhadap pHpada MIP A dan B.

Pada pH 6, 7, dan 8 terdapat selisih efisiensi ekstraksi antara MIPA dan B yang disebabkan karena perbedaan jumlah gugus amina kitosanyang tidak terikat silang oleh glutaraldehid. Gugus -NH2 yang tidakterikat silang oleh glutaraldehid pada MIP B lebih banyak dibandingkanMIP A, hal tersebut terlihat jelas pada grafik pH 6. Pada pH 7 terjadipeningkatan nilai efisiensi ekstraksi karena berkurangnya gugus -NH3+

akibat deprotonasi, sehingga mengurangi jumlah MSG yang tertahandalam kolom. Sedangkan pada pH 8 efisiensi ekstraksi yang didapattidak mencapai 100% karena kemungkinan masih terdapat MSG yang

20

tertahan didalam kolom akibat interaksi dengan MIP. Penggunaan eluendengan kepolaran yang sama, tidak mengubah kondisi dari MIP atauMSG, sehingga MSG tidak terelusi. Efisiensi ekstraksi pada MIP A danB terbesar diperoleh pada pH 8 yaitu 90% dan 89%. Berdasarkanefisiensi ekstraksi MIP A memiliki kemampuan ekstraksi lebih besardaripada MIP B. Ekstraksi MSG dapat dilakukan menggunakan MIPjenis A dengan fasa gerak buffer fosfat 0,01 M pada pH 8.

21

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pH6- 8 pada fasa gerak berpengaruh terhadap efisiensi ekstraksi MSGdan diperoleh efisiensi ekstraksi MSG optimum pada pH 8.Pembuatan MIP berpengaruh terhadap efisiensi ektraksi, pada pH 8efisiensi ekstraksi MIP A 90% dan MIP B dengan efisiensi ekstraksi89%.

5.2 Saran

Untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi, perlu dipelajarimengenai pengaruh konsentrasi glutaraldehid yang ditambahkan padapembuatan MIP dan sifat kitosan yang digunakan.

22

DAFTAR PUSTAKA

[1] Alnokkari A., Mounir Ataie & Zaid Alasaf, Chin J., 2013,Colorimetric Determination of Monosodium Glutamate inFood Samples Using L-glutamate Oxidase, Environ Biol, 19(6), 1069-1072.

[2] Expotech USA, 1998, A Guide to Kjeldahl NitrogenDetermination Methods and Apparatus, An industry ServicePublication, LabConco.

[3] Csapo, J., Albert, Cs., Loki, K. dan Csapo-Kiss, Zs, 2008,Separation And Determination Of The Amino Acids by IonExchange Column Chromatography Applying PostcolumnDerivatization, Acta Univ. Sapientiae, Vol.1, 5-29.

[4] Bhuvaneswari, S., Begum, K. M. M. S., dan Shivashanmugam,2003, Separation of L- Glutamic Acid by Emulsion LiquidMembrane Extraction, Journal of Scientific & IndustrialResearch, Vol. 62, 329-333.

[5] Cunliffe, D., Kirby, A. and Alexander, C., 2005, Molecularlyimprinted drug delivery systems, Advanced Drug DeliveryReviews, Vol. 57, 1836-1853.

[6] Cormark, Peter & Mehamod, Faizatul Shimal, 2013,Molecularly Imprinted Polymer Syntesis Using RAFTPolymerisation, Vol. 42 No.2, 529-535.

[7] Monier M., A.M.A. El-Sokkary, 2010, Preparation ofmoleculalrly imprinted cross-linked chitosan/glutaraldehyde

23

resin for enantioselective separation of L-glutamic acid,Biological Macromolecules, Vol. 47, 207-213.

[8] Cho Y-W, Jang J, Park CR, and Ko S-W., 2000, Preparationand solubility in acid and water of partially deacetylatedchitins, Biomacromolecules ,Vol.1, 609.

[9] Sukawan, 2008, Efek Toksik Monosodium Glutamat (MSG)pada Binatang Percobaan, Universitas Indonesia, FakultasKedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

[10] Borissova, A., Penchev R., Y. Jammoal, K. H. Javed, X. Lai, T.Mahmud, K. J. Roberts, asnd W. Wood, 2005, Modeling thePrecipitation of L-Glutamic Acid via Acidification ofMonosodium Glutamate, Crystal Growth & Design, 5 (3),845-854.

[11] Parmer, C., 2008, Kjeldahl Method for Determining Nitrogen,http://www.coleparmer/tech-article/kjeldahl-method-for-determining-nitrogen.com, diakses pada tanggal 28 Februari 2017.

[12] Basset, Denney, R.C., Jeffery, G.H., dan Mendham, J., 1991,Vogel Textbook of Quantitative Inorganic Analysis InclidingElementary Instrumenal Analysis 4th ed, Longman Group UKlimited, London.

[13] Vasapollo G., Roberta D. S., Lucia M., Maria R. L., Anna S.,Sonia S. and Ciuseppe M, 2011, Molecularly ImprintedPolymers: Present and Future Prospective, InternationalJournal of Molecular Sciences, ISSN 1422-0067.

24

[14] Widodo. A., Mardiah, Prasetyo, A., 2005, Potensi Kitosan dariSisa Udang Sebagai Koagulan Logam Berat Limbah CairIndustri Tekstil, Teknik Kimia, ITS, Surabaya.

[15] Anitha A., N. Sanoj Rejinold, Joel D. Bumgardner, Shanti V.Nair, and Rangasamy J., 2012, Approaches for FunctionalModification or Cross-linking of Chitosan, Amrita Center forNanosciences and Molecular Medicine, Department ofBiomedical Engineering, University of Memphis, USA.

[16] Gnus M., Dudek G., Turczyn R., Strzelewicz A., Krasowska M.,2014, Pervaporation with chitosan membranes containingiron oxide nanoparticles, Sep. Purif. Techn. 133, 8-15.

[17] Baroni, P., Vieira, R S., Meghetti, E., Silva, M G C., Beppu, MM., 2008, Evaluation of batch adsorption of chromium ionson natural and crosslinked chitosan membranes, Journal ofHazardous Materials, 152, 1155–1163.

[18] Harvey, David, 2000, Modern Analytical Chemistry, Mc GrawHill Co. Inc., USA.

[19] Zougagh, M., Rediogolo H., Rios A., dan Valcarel M., 2004,Screening and Confirmation of PAHs in Vegetable OilSamples by Use of Supercritical Fluid Extraction inConjunction with Liquid Chromatography and FlourometricDetection, Analytica Chimica Acta, 525, 265-271.

[20] Camel, V, 2003, Solid Phase Extraction of Trace Elements,Spectrochimica Acta Part B, 58, 117-1233.

25

[21] Zwir-Ferenc, A., dan M. Biziuk, 2006, Solid Phase ExtractionTechnique-Trends, Opportunities and Applications, PolishHournal of Environmental Study, 15 (5), 677-690.

[22] Kuchel, 1988, P. W., Gregory B. R., Simon B. E. S., AudreyM.Bersten, Theory and Problems or Biochemistry SecondEdition, McGraw Hill, New York.

[23] Kazakevich, Y. And L. LoBrutto, 2007, HPLC forPharmaceutical Scientists, JohnWiley & Sons, inc., New York,52, 250.

[24] Cazes, J., 2005, Encyclopedia of Chromatography 2nd edition,Marcel Pekker, New York.