3.2.2 Modifikasi gen apoptin dengan penambahan 12 histidin dan 8 arginin dengan

metode cut and ligate .

Apoptin merupakan protein yang diisolasi dari Chicken Anemia Virus (CAV). Apotin

terdiri dari 121 asam amino dan tidak memperlihatkan sekuens homolog yang signifikan

dengan protein yang telah diketahui. Protein ini memiliki kemampuan yang menyebabkan

apoptosis (perusakan sel) pada sel kanker. Namun proses pemusnahan sel kanker tersebut

tidak serta merta dapat dilakukan oleh protein ini pada bentuk aslinya (native form). Untuk

itu diperlukan modifikasi pada gen apoptin ini.

Sebelum dilakukan kloning, gen apoptin dimodifikasi dengan menambahkan sekuens 12-

histidin pada C-terminal dan 8-arginin pada N-terminal. Penambahan 12-histidin

dimaksudkan agar mengakibatkan apoptin lebih mudah larut. Kelarutan protein yang lebih

tinggi akan menyebabkan apoptin lebih mudah dipurifikasi atau dimurnikan. Penambahan 8-

arginin dimaksudkan untuk pelindung bagi apoptin untuk melewati kondisi ekstrim, sehingga

dapat dengan lebih mudah masuk (penetrasi) ke dalam sel.

Berikut merupakan sekuens dari DNA template apoptin:

5’ A T G A A C G C T C T C C A A G A A G A T A ....C G C A A G A A G G T G T A T

A A G A C T G T A A 3’

Kodon histidin:

CAT dan CAC

Kodon arginin:

GCG, GCT, GCC, TCT, GCA

Penambahan 12 histidin pada C-terminal dan 8 arginin pada N-terminal apoptin dilakukan

dengan metode potong sambung. Dalam metode potong sambung tersebut tentunya harus

diketahui enzim restriksi yang akan memotong gen apoptin. Sebenarnya, pemilihan enzim

restriksi didasarkan pada situs restriksi yang ada di sekuens gen apoptin. Namun karena gen

apoptin akan dimodifikasi pada bagian masing-masing ujungnya, maka disini akan

ditambahkan situs restriksi pada ujung gen apoptin. Sehingga pemilihan enzim restriksi itu

sendiri berdasarkan pada situs restriksi yang ada pada plasmid. Hal tersebut bertujuan agar

ketika gen disisipkan pada plasmid akan saling berkomplemen atau terhubung melalui situs

restriksi tersebut. Kemudian, selain itu juga dilakukan tahap pemillihan penambahan situs

restriksi pada histidin dan arginin yang situs tersebut sama dengan yang ada di plasmid.

Tujuannya adalah sama dengan penambahan situs restriksi pada apoptin.

Adapun pertimbangan yang kami diskusikan mengenai pemilihan situs restriksi yang

digunakan antara lain, enzim yang memotong situs tersebut mudah diperoleh dan

ketersediannya melimpah di dunia pasar plasmid, memiliki kemampuan high copy sehingga

membantu mempercepat proses ligase dan amplifikasi pada proses perbanyakan sel,

memiliki kemampuan yang dapat menghasilkan cukup besar sekuens DNA yang akan

dikloning. Pemilihan situs restriksi ini akan dijelaskan pada tahapan-tahapan sebagai berikut:

Tahap 1:

Menidentifikasi situs restriksi yang ada pada vektor, dalam hal ini adalah plasmid pET28a.

Identifikasi tersebut dengan melihat map restriksi plasmid. Dipilih pada area MCS (Multiple

Cloning Site)

Tahap 2:

Memilih situs restriksi yang tidak terdapat dalam sekuens apoptin sehinggga gen apoptin

tidak ikut terpotong.

Tahap 3:

Memastikan tidak ada duplikat situs restriksi dimanapun dalam gen apoptin atau pET28a

untuk menghindari penggandaan pemotongan DNA sehingga terjadi data misleading.

Tahap 4:

Lebih memilih enzim restriksi yag memotong dengan ujung lengket (sticky ends) daripada

yang tumpul (blunt ends). Sticky end terjadi ketik enzim memotong DNA rantai ganda

dengan kuat sedangkan blunt end dengan lembut yang mengakibatkan sulit untuk terpasang.

Tahap 5:

Memilih enzim restriksi yang berbeda di tiap ujung apoptin untuk memastikan apoptin

tersisipkan dalam plasmid pada orientasi yang benar dan untuk memastikan plasmid tidak

menyambung dengan sendirinya kembali.

Tahap 6:

Memilih enzim yang berfungsi baik pada sistem buffer dan suhu yang sama. Jika tidak

dimunngkinkan maka harus dilakukan proses pemotongan pada sistem yang terpisah.

Berdasarkan pertimbangan dan tahapan di atas, dipilih situs retriksi Xho1 dan BamH1. Situs

tersebut akan ditambahkan pada gen apoptin dengan Xho1 pada N-terminal dan BamH1 pada

C-terminal.

Xho1 : CTCGAG

BamH1 : GGATC

Sehingga

GGATCC A T G A A C G C T C T C C A A G A A G A T A ....C G C A A G A A G G T G

T A T A A G A C T G T A ACTCGAG

Karena gen apoptin akan digabungkan dengan 12-histidin pada C-terminal dan 8-arginin pada

N-terminal maka, kedua sekuens asam amino tersebut ditambahkan situs restriksi yang ada

pada plasmid pET28a seperti langkah pada penambahan situs restriksi untuk gen apoptin.

Penambahkan situs restriksi pada histidin dan arginin:

Pada ujung histidin ditambahkan situs restriksi. EcoR1 untuk ujung 5’ dan Xho1 untuk ujung

3’

Pada ujung arginin ditambahkan situs restriksi BamH1 pada ujung 5’ dan Sal1 pada ujung 3’

EcoR1: GAATTC

Sal1: GTCGAC

GAATTC CATCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCAC GGATCC

CTCGAG GCGGCTGCCTCTGCATCCGCTGCCGTCGAC

Penambahan situs restriksi dapat dilakukan dengan PCR yang menggunakan desain primer

khusus. Namun pada proses pengkloningan yang kami rancang, telah diperoleh gen apoptin

yang telah memiliki situs restriksi seperti pada sekuens yang telah kami susun. Sehingga,

penggabungan gen apoptin, dengan 12-histidine dan 8-arginin tinggal dilakukan dengan

memanfaatkan enzim T4 DNA ligase. Proses ligasinya dapat memanfaatkan kit yang sesuai

dengan enzim, plasmid dan gen yang digunakan. Bila kit untuk ligasi tersebut belum tersedia

pada perusahaan, maka kita perlu merancangnya sesuai dengan sifat dari bahan-bahan yang

digunakan. Dalam perancangan ini, dianggap dalam perusahaan tersedia buffer untuk proses

restriksi dan ligasi yang kami butuhkan dan tersedia pula protokolnya, yang tidak kami

jelaskan pada makalah ini.