REVIEW MATERI

ANALISA MUTU PANGAN DAN HASIL PERTANIAN

Analisis Protein

Oleh

Dina Mustika Rini(111710101002)

TEKNOLOGI HASIL PERTANIANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS JEMBER2012

ANALISIS PROTEIN

Kandungan protein dalam bahan pangan bervariasi dalam jumlah maupun jenisnya.

Bahan pangan mengandung protein tinggi:

- Hewani (telur, daging, susu dan ikan)

- Leguminosa (kacang-kacangan)

- Serealia ( beras, gandum, jagung)

Protein merupakan sumber gizi utama yaiyu sumber asam amino.terdapat 8 dari 20

jenis asam amino penyusun protein yang merupakan zat nutrisi esensial yang diperlukan

tubuh yaitu lisin, triptofan, fenilalanin, metionin, treunin, leusin, isoleusin, dan valin.

Protein juga memberikan sifat fungsional yang penting dalam membentuk

karakteristik produk pangan.

Kandungan protein dari beberapa bahan pangan.

Bahan Pangan

Hewani

Kandungan

Protein (% basis

basah)

Bahan Pangan

Nabati

Kandungan

Protein (% basis

basah)

Daging sapi 18,5 Beras 7,9

Daging ayam 23,1 Tepung gandum 13,7

Telur 12,5 Tepung maizena 6,9

Ikan Tuna 26,5 Pati jagung 0,3

Susu Segar 3,3 Apel 0,2

Susu skim

(kering)

36,2 Kentang 2,0

Keju cheddar 24,9 Kacang kedelai 36,5

Yoghurt 5,3 Tahu 15,8

Protein merupakan molekul polipetida berukuran besar yang disusun oleh lebih dari

100 buah asam amino yang berikatan satu sama lain secara kovalen dan dalam urutan yang

khas yang disebut ikatan peptida. Umumnya terdapat 20 jenis asam amino yang menyusun

struktur protein. Yang membedakan antara satu protein dengan protein lainnya adalah urutan

dan jumlah asam amino yang menyusun protein.

Ciri khas asam amino yang menyusun protein adalah gugus karboksil (-COOH) yang

bersifat asam dan gugus amino (-NH3) yang bersifat basa yang diikat pada atom karbon yang

sama. Gugus karboksil ini dapat bermuatan negatif, gugus amino dapat bermuatan positif

tergantung pada pH medium.

Perbedaan asam amino yang satu dengan yang lainnya adalah gugus R yang bervariasi

dalam struktur, ukuran, muatan listrik dan kelarutan dalam air. Asam amino ini dibagi

menjadi 4 golongan berdasarkan gugus R-nya, antara lain sebagai berikut:

1. Golongan dengan gugus R non polardan hidrofobik

2. Golongan dengan gugus R polar tidak bermuatan

3. Golongan dengan gugus R polar bermuatan negatif (asam)

4. Golongan dengan gugus R polar ermuatan positif (basa)

Penggolongan asam amino berdasarkan polaritas kandungan gugus R (pada pH 7)

Gugus R Asam Amino

Non polar Alanin, isoleusin, leusin, metionin, valin,

glisin

Polar tapi tidak bermuatan Asparagin, sistein, glutamin, serin,

treonin, prolin

Bermuatan negatif Asam aspartat, asam glutamat

Bermuatan positif Arginin, histidin, lisin

Berikut adalah salah satu gambar struktur asam amino.

Kadar protein pada bahan dan produk pangan dan hasil pertanian dapat ditentukan

dengan berbagai jenis metode analisis. Metode analisis protein yang sering digunakan akan

dijelaskan sebagai berikut.

1. Analisis Protein Kasar (Metode Kjeldahl)

Metode Kjeldahl merupakan metode penetapan kadar prtein kasar (crude protein).

Untuk menentukan kandungan protein dalam bahan pangan (analisis proksimat). Metode

ini didasarkan pada pengukuran kadar nitrogen total dalam contoh/sampel. Kandungan

protein dapat dihitung dengan mengasumsikan rasio tertentu antara protein terhadap

nitrogen untuk contoh yang dianalisis.

Penentuan protein pada metode Kjeldahl didasarkan pada asumsi bahwa kandungan

nitrogen dalam protein sekitar 16% karena unsur nitrogen bukan hanya berasal dari

protein. Nitrogen yang dijumpai pada komponen non protei seperti asam amino bebas,

peptida berukuran kecil, asam nukleat, fosfolipid, gula amin, porfirin, beberapa vitamin,

alkaloid, asam urat, urea, ion amonium. Unsur nitrogen yang terukur pada analisis protein

metode Kjeldahl tidak hanya pada protein pada bahan, sebagian kecil dari komponen-

komponen non protein yang mengandung nitrogen. Untuk mengubah dari kadar nitrogen

ke dalam kadar protein digunakan angka faktor konversi 100/16 atau 6,25. Sedangkan

beberapa jenis bahan pangan faktor konversi yang digunakan berbeda.

Berikut adalah tabel faktor konversi dari beberapa jenis bahan pangan.

Jenis Pangan X (%N dalam protein) Faktor konversi/F (100/X)

Campuran 16,00 6,25

Daging 16,00 6,25

Maizena 16,00 6,25

Roti, gandum, makaroni,

bakmi

16,00 6,25

Susu dan produk susu 15,66 6,38

Tepung 17,54 6,70

Telur 14,97 6,68

Gelatin 18,02 5,55

Kedelai 17,51 5,71

Beras 16,81 5,95

Kacang tanah 18,32 5,46

Metode Kjeldahl dapat digunakan untuk analisis protein semua jenis bahan pangan.

Prosedur penetapan tidak membutuhkan biaya mahal dan hasilnya cukup akurat. Metode

resmi yang diakui AOAC (The Association of Official Analytical Chemists) international.

Kelemahan metode ini adalah metode ini mengukur bukan hanya nitrogen pada protein,

tetapi juga nitrogen dari non protein.

N (contoh) + H2SO4 (NH4)2SO4

Pemanasan

Katalis

Penetapan kadar protein kasar dengan metode Kjeldahl dibagi tiga tahap, diantaranya

adalah sebagai berikut:

a. Tahap penghancuran (Digestion)

Pada tahap ini dilakukan dengan menambahkan asam kuat (asam sulfat) dan

dilakukan proses pemanasan. Tahap penghancuran ini membebaskan nitrogen dari

contoh. Pada tahap ini ditambahkan katalis untuk mempercepat proses penghancuran

hingga sempurna. Katalis tersebut dapat berupa merkuri oksida (HgO) atau campuran

tembaga (Cu) dan titanium (Ti) dioksida. Selain itu ditambahkan pula pottasium sulfat

untuk meningkatkan titik didih asam sulfat agar proses digesti lebih cepat.

Pada proses penghancuran ini nitrogen bereaksi dengan asam sulfat

membentuk amonium sulfat. Reaksi yang terjadi selama proses penghancuran ini

adalah:

b. Tahap Netralisasi dan Distilasi

Setelah proses penghancuran selanjutnya adalah tahap neutralisasi. Larutan

yang mengandung amonium sulfat diperlakukan dengan penamahan alkali (NaOH)

pekat untuk menetralkan asam sulfat. Adanya larutan NaOH pekat mengakibatkan

amonium sulfat dipecah menjadi gas amoniak.

Pada proses distilasi, gas amoniak diuapkan dan ditangkap oleh asam borat

(H3BO3) membentuk NH4H2BO3. Berikut adalah persamaan reaksinya.

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O + 2NH3

2NH3 + 2H3BO3 2NH4H2BO3

c. Tahap Titrasi

Senyawa NH4H2BO3 dititrasi menggunakan asam klorida (HCl) encer (0,02 N)

sehingga asam borat terlepas kembali dan terbentuk amonium klorida. Reaksi yang

terjadi selama proses titrasi adalah sebagai berikut.

2 NH4H2BO3 + 2HCl 2NH4Cl + 2H3BO3

Jumlah asam klorida yang digunakan untuk titrasi setara dengan jumlah gas

NH3 yang dibebaskan dari proses distilasi. Pinsip stoikiometri diperoleh kesetaraan:

1 mol HCl = 1 mol N = 14 gram N

Prosedur kerja yang dilakukan dalam analisis protein metode Kjeldahl ini adalah

sebagai berikut.

a. Tahap penghancuran (Digestion)

1) Timbang sejumlah contoh (100-200 mg) ke dalam labu Kjeldahl.

2) Tambahkan1,0 ± 0,1 gram K2SO4, 40 ± 10 mg HgO, dan 2 ± 0,1 ml H2SO4.

3) Tambahkan 2-3 butir batu didih. Didihkan contoh selama 1-1,5 jam dengan

kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan jernih, lalu dinginkan.

b. Tahap Distilasi

1) Tambahkan sejumlah kecil air distilata secara perlahan lewat dinding labu dan

goyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali.

2) Pindahkan isi labu ke dalam alat distilasi dan bilas labu 5-6 kali dengan 1-2 ml air

distilata.

3) Pindahkan air cucian ke labu distilata dan tambahkan 8-10 ml larutan 60% NaOH

– 5% Na2SO3.

4) Letakkan erlenmeyer 250 ml yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2-4 tetes

indikator metilen red-metilen blue di bawah kondensor. Ujung ndensor harus

terendam di bawah larutan H3BO3.

5) Lakukan distilasi sehingga diperoleh sekitar 15 ml distilat.

c. Tahap Titrasi

i. Standardisasi Larutan HCl 0,02 N

1) Pipet 25 ml larutan HCl 0,02 N ke dalam erlenmeyer 250 ml, lalu tambahkan

2-3 tetes indikator phenoftalein 1%.

2) Titrasi larutan HCl 0,02 N dengan NaOH 0,02 N yang telah distandardisasi.

3) Catat volume NaOH yang diperlukan untuk titrasi hingga warna larutan

berubah menjadi merah muda.

4) Hitung normalitas larutan HCl dengan rumus sebagai berikut:

N HCl = (ml NaOH ) ×(N NaOH )

ml HCl

ii. Titrasi distilat dengan HCl 0,02 N standar

1) Encerkan distilat dalam erlenmeyer hingga kira-kira 50 ml.

2) Titrasi dengan HCl 0,02 N terstandar sampai terjadi perubahan warna menjad

abu-abu.

3) Catat volume HCl N terstandar yang diperlukan untuk titrasi.

d. Penetapan Blanko

1) Dengan prosedur yang sama dengan contoh, lakukan analisis untuk blanki (tanpa

contoh).

2) Catat volume HCl 0,02 N standar yang digunakan untuk titrasi blanko.

e. Perhitungan

%N = (ml HCl contoh−ml HCl blanko ) × N HCl× 14,007

mg contoh× 100

Kadar protein (g/100g bb) = %N x Faktor konversi

Kadar protein (g/100g bk) = kadar protein(bb)

(100−kadar air ( bb ))×100

2. Metode Biuret

Metode ini merupakan analisis protein terlarut. Metode ini didasarkan pada prinsip

bahwa senyawa yang mengandung ikatan peptida (-CO-NH-) dapat membentuk

kompleks berwarna biru ungu dengan garam Cu dalam larutan alkali (dalam suasana

basa). Seluruh protein mengandung ikatan peptida. Oleh karena itu metode biuret

merupakan salah satu metode terbaik untuk menentukan kandungan larutan protein.

Metode ini sangat sederhana, cepat, dan murah. Namun dalam menentukan protein

secara kuantitatif dan memerlukan jumlah protein relatif besar kisaran 1-20 mg.

Prinsip penetapan protein metode ini, ikatan peptida dari protein akan bereaksi dengan

ion Cu2+ membentuk komplek berwarna ungu. Intensitas warna ungu berbanding

langsung dengan konsentrasi protein. Semakin meningkat intensitas warnanya

konsentrasi protein semakin besar. Intensitas warna ungu diukur absorbansnya dengan

spektofotometer pada λ = 540 nm). Nilai absorbans tidak tergantung pada jenis protein

karena seluruh protein mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama per satuan berat.

Sedikit senyawa yang menganggu reaksi misalnya urea yang mengandung gugus –CO-

NH- dan gula pereduksi sedikit akan bereaksi dengan ion Cu2+.

Analisis protein menggunakan metode biuret (AOAC 935.11 yang dimodifikasi)

adalah sebagai berikut.

a. Pereaksi

1) Pereaksi buret: mengandung CuCO4.5H2O, Na-K-tartarat, NaOH, KI.

2) Larutan protein standar: bovine serum albumin digunakan untuk membuat kurva

standar.

b. Persiapan contoh

1) Contoh untuk analisis harus berbentuk cairan. Sedangkan sampel dalam bentuk

padat harus dibuat dalam bentuk larutan terlebih dahulu.

2) Contoh yang diperlukan berkisar 1-10 mg protein per ml.

3) Contoh padat dicairkan dengan menghancurkan dalam waring blender dengan

penambahan air. Hancuran disaring lalu disentrifugasi sehingga terbentuk

supernatan yang digunakan dalam penngukuran (protein yang terukur adalah

protein terlarut).

4) Contoh cair dilakuka pengenceran

5) Bila larutan contoh keruh atau mengandung komponen pengganggu (seperti

glukosa) maka perlu perlakuan menghilangkan komponen. Ekstrak hasil dari

waring blender lalu didistribusikan dalam tabung reaksi, tambahkan trichloro

acetic acid (TCA) 10% sehingga protein terdenaturasi (menggumpal). Lakukan

sentrifugasi dan protein mengendap. Selanjutnya supernatan dibuang, endapan

dicuci dengan etil eter untuk menghilangkan TCA. Lakukan sentrifugasi,

keringkan endapan, endapan kering dilarutkan dalam air dan dicampur merata.

Protein akan larut sempurna pada saat penambahan larutan Biuret pada penetapan

contoh.

c. Pembuatan kurva standar

1) Membuat beberapa konsentrasi larutan bovine srum albumin yang diketahui

konsentrasinya. Penetapan contoh dengan preaiksi Biuret dan diukur pada

spektofotometer λ = 540 nm.

2) Kurva standar dibuat dnegan memplotkan konsentrasi larutan bovine pada sumbu

x dan absorbans pada sumbu y. Sehingga membentuk persamaan linier y=a+bx

(regresi linier), y adalah nilai absorbans, x adalah konsentrasi larutan protein

BSA, dimana a adalah titik potong pada sumbu y, dan b adalah kemiringan garis.

d. Penetapan contoh

1) Larutan contoh didistribusikan dalam tabung reaksi dan ditambahkan pereaksi

biuret.

2) Disimpan pada suhu 370C (10 menit) atau suhu kamar 30 menit) hingga terbentuk

warna ungu sempurna.

3) Absorbans diukur menggunakan spektrofotometer pada λ = 540 nm.

e. Perhitungan

1) Kandungan protein contoh ditentukan dengan kurva standar BSA.

2) Nilai y pada persamaan linier disubtitusi dengan nilai absorbans untuk contoh,

sehingga iperoleh nilai x yang menunjukkan konsentrasi protein contoh.

3. Metode Lowry

Pada metode inireaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam

fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptophan (residu protein) yang

terdapat dalam protein akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama

dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat. Pereaksi fenol, Folin, Lawry, Folin-

Ciacalieau merupakan pereaksi kompleks yang berisi fosfomolibdat dan fosfotungstat.

Sensitivitas metode ini 10-200 µg protein. Metode ini lebih sensitif daripada metode

Biuret.

Senyawa fenolik juga dapat membentuk warna biru dengan metode Lowry sehingga

dapat mengganggu pengukuran. Gangguan ini dapat dihilangkan dengan cara

mengendapkan protein dengan TCA, sehingga supernatan mengandung senyawa fnolik

dihilangkn. Lalu protein yang mengendap dianalisis.

Pada metode ini menggunakan 3 macam pereaksi yaitu:

a. Pereaksi tembaga sulfat: mengandung CuSO4.5H2O2, kalium, tartrat, Na2CO3,

NaOH.

b. Pereaksi Folin-Ciocalteau

c. Larutan protein standar: bovine serum albumin.

Dalam mempersiapkan contoh dilakukan sebagaimana yang dilakukan pada metode

Biuret. Sedangkan penetapan contoh, larutan contoh didistribusikan dalam tabung reaksi

dan ditambahkan pereaksi tembaga sulfat, didiamkan 10 menit, dan ditambahkan

pereaksi Folin Ciocalteau lalu didiamkan 1 jam hingga warna biru terbentuk. Intensitas

warna biru diukur absorbans menggunakan spektrofotometer pada λ = 700 nm.

Perhitungan pada metode ini, kandungan protein contoh ditentukan dengan kurva

standar BSA. Nilai y pada persamaan linier disubtitusi dengan nilai absorbans untuk

contoh sehingga diperoleh nilai x yang menunjukkan konsentrasi contoh.

4. Metode pengikatan zat warna (Dye Binding)

Pada metode ini penetapan protein terjadi secara tidak langsung. Zat warna yang

digunakan adalah Amido Black dan Orange G. Metode ini sesuai untuk analisis contoh

bentuk cair seperti susu.

Prinsip penetapan metode ini didasarkan pada kemampuan gugus polar protein yang

bermuatan ion berlawanan mengikat zat warna dan membentuk kompleks tidak larut.

Kompeks tidak larut dipisahkan dengan cara sentrifuse atau penyaringan intensitas warna

zat warna yang tidak terikat dengan protein diukur absorbansnya dengan

spektofotometer. Intensitas warna Amino Black diukur pada 615 nm dan Orange G pada

485 nm. Semakin rendah intensitas warna dari supernatan, maka semakin banyak zat

warna yang terikat oleh protein, semakin tinggi pula kandungan protein dalam contoh.

Peetapan konsentrasi prtein dalam metode ini ditentukan berdasarkan kurva standar

yang menyatakan hubungan antara absorbans zat warna dengan kadar protein (yang

ditetapkan dengan metode Kjeldahl). Nilai y (absorbans) pada persamaan linier yang

diperoleh disubtitusi dengan nilai absorbans untuk contoh, sehingga diperoleh nilai x

(konsentrasi protein contoh).

5. Metode titrasi formal

Metode ini digunakan untuk analisis protein pada susu. Pengerjaannya cepat dan

sederhana, tapi senderug protein lebih rendah terutama pada protein susu. Prinsip

penetapan metode ini, formaldehida (metanal) ditambahkan ke dalam susu (yang sudah

dinetralkan). Formaldehida ini bereaksi dengan gugus amino (residu asam amino) seperti

lisisn. Hal ini terjadi konversi gugus –NH2 menjadi gugus –N=CH2 sehingga kehilangan

sifat asam dan meningkatkan keasaman protein.

Peningkatan keasaman protein diukur secara titrasi denga sodium hidroksida dengan

fenolftalein sebagai indikaor. Titik akhir titrasi dilihat dari pembentukan warna pink.

Peningkatan keasaman protein berkolerasi dengan konsentrasi protein. Konsentrasi

protein ditentukan dengan rumus.

%Protein = T x 0,17

T = ml NaOH yang diperlukan untuk menetralkan keasaman proteindari 100 ml susu.

6.