LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERCOBAAN 2

ANALISIS GEN DAN HOMOLOGI PROTEIN

I. TUJUAN PERCOBAAN

1. Mampu melakukan analisis terhadap ekspresi gen dan dapat mendeteksi hasil

ekspresi gen

2. Dapat mencarai homologi gen penghasil protein tertentu dari manusia

dengan gen beberapa organisme lain.

II. DASAR TEORI

A. PENDAHULUAN

Salah satu fungsi dasar yang harus dijalankan oleh DNA sebagai

materi genetic adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur

pertumbuhan dandi ferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu

fenotipe tertentu.

Fenotipe organisme sangat ditentukan oleh hasil interaksi protein-

protein di dalam sel. Setiap protein tersusun dari sejumlah asam amino dengan

urutan tertentu, dan setiap asam amino pembentukannya disandi (dikode) oleh

urutan basa nitrogen di dalam molekul DNA. Rangkaian proses ini, mulai dari

DNA hingga terbentuknya asam amino, dikenal sebagai dogma sentral

biologi molekuler.

Gambar 1. Diagram dogma sentral biologi molekuler

Perubahan urutan basa di dalam molekul DNA menjadi urutan basa

molekul RNA dinamakan transkripsi, sedangkan penerjemahan urutan basa

RNA menjadi urutan asam amino suatu protein dinamakan translasi. Jadi,

proses tanskripsi dan translasi dapat dilihat sebagai tahap-tahap ekspresi

urutan basa DNA. Namun, tidak semua urutan basa DNA akan diekspresikan

menjadi urutan asam amino. Urutan basa DNA yang pada akhirnya menyandi

urutan asam amino disebut sebagai gen. Dengan demikian, secara kimia gen

adalah urutan basa nitrogen tertentu pada molekul DNA yang dapat

dieskpresikan melalui tahap-tahap transkripsi dan translasi menjadi urutan

asam amino tertentu.

B. TAHAP-TAHAP TRANSKRIPSI

Transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan

promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing akan dijelaskan

sebagai berikut.

a. Enzim RNA polimerase mengikat untai DNA cetakan pada suatu daerah

yang mempunyai urutan basa tertentu sepanjang 20 hingga 200 basa.

Daerah ini dinamakan promoter. Baik pada prokariot maupun eukariot,

promoter selalu membawa suatu urutan basa yang tetap atau hampir tetap

sehingga urutan ini dikatakan sebagai urutan konsensus. Pada prokariot

urutan konsensusnya adalah TATAAT dan disebut kotak Pribnow,

sedangkan pada eukariot urutan konsensusnya adalah TATAAAT dan

disebut kotak TATA. Urutan konsensus akan menunjukkan kepada RNA

polimerase tempat dimulainya sintesis. Kekuatan pengikatan RNA

polimerase oleh promoter yang berbeda sangat bervariasi. Hal ini

mengakibatkan perbedaan kekuatan ekspresi gen.

b. Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan

terikat pada suatu tempat di dekat daerah promoter, yang dinamakan

tempat awal polimerisasi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan

di tempat ini dan sintesis RNA pun segera dimulai.

c. Selama sintesis RNA berlangsung RNA polimerase bergerak di

sepanjang molekul DNA cetakan sambil menambahkan nukleotida demi

nukleotida kepada untai RNA yang sedang diperpanjang.

d. Molekul RNA yang baru saja selesai disintesis, dan juga enzim RNA

polimerase, segera terlepas dari untai DNA cetakan begitu enzim tersebut

mencapai urutan basa pengakhir (terminasi). Terminasi dapat terjadi oleh

dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan

basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan

kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya

terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan

basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom

adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh

karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa

tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung

terminasi berbentuk batang dan kala (loop).

Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi

sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan

pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA

polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi

transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan

terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang

berbeda-beda.

Secara umum mekanisme transkripsi pada prokariot dan eukariot

hampir sama. Hanya saja, pada prokariot produk langsung transkripsi atau

transkrip primernya adalah mRNA (akan dijelaskan di bawah), sedangkan

pada eukariot transkrip primernya harus mengalami prosesing RNA terlebih

dahulu sebelum menjadi mRNA. Prosesing RNA ini mencakup dua peristiwa,

yaitu modifikasi kedua ujung transkrip primer dan pembuangan urutan basa

pada transkrip primer yang tidak akan ditranslasi (disebut intron). Ujung 5’

dimodifikasi dengan penambahan guanosin dalam ikatan 5’-5’ yang tidak

umum hingga terbentuk suatu gugus terminal yang dinamakan cap, sedangkan

ujung 3’ dimodifikasi dengan urutan poliadenosin (poli A) sepanjang lebih

kurang 200 basa. Sementara itu, panjang intron yang harus dibuang dapat

mencapai 50% hingga 90% dari panjang transkrip primer, tetapi segmen yang

mengandung ujung 5’ (gugus cap) tidak pernah dibuang. Setelah intron

dibuang, segmen-segmen sisanya (disebut ekson) segera digabungkan menjadi

mRNA. Pembuangan intron dan penggabungan ekson menjadi molekul

mRNA dinamakan penyatuan RNA atau RNA splicing.

C. MACAM-MACAM RNA

Transkripsi DNA menghasilkan molekul RNA yang kemudian akan

mengalami diferensiasi struktur sesuai dengan fungsinya masing-masing. Kita

mengenal tiga macam RNA, yaitu :

a. RNA duta atau messenger RNA (mRNA), yang mempunyai struktur

linier kecuali bagian ujung terminasinya yang berbentuk batang dan kala

(Gambar 10.2). Molekul mRNA membawa urutan basa yang sebagian di

antaranya akan ditranslasi menjadi urutan asam amino. Urutan basa yang

dinamakan urutan penyandi (coding sequences) ini dibaca tiga demi tiga.

Artinya, tiap tiga basa akan menyandi pembentukan satu asam amino

sehingga tiap tiga basa ini dinamakan triplet kodon. Daftar triplet kodon

beserta asam amino yang disandinya dapat dilihat pada Tabel 1. Pada

prokariot bagian mRNA yang tidak ditranslasi terletak di depan urutan

penyandi (disebut pengarah atau leader) dan di antara dua urutan penyandi

(disebut spacer sequences atau noncoding sequences). Sementara itu, pada

eukariot di samping kedua bagian tadi ada juga bagian di dalam urutan

penyandi yang tidak ditranslasi. Bagian inilah yang dinamakan intron

seperti telah dijelaskan di atas. Molekul mRNA pada prokariot sering kali

membawa sejumlah urutan penyandi bagi beberapa polipeptida yang

berbeda. Molekul mRNA seperti ini dinamakan mRNA polisistronik.

Dengan adanya mRNA polisistronik, sintesis beberapa protein yang masih

terkait satu sama lain dapat diatur dengan lebih efisien karena hanya

dibutuhkan satu sinyal. Pada eukariot hampir tidak pernah dijumpai

mRNA polisistronik.

b. RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), yang strukturnya mengalami

modifikasi hingga berbentuk seperti daun semanggi. Seperti halnya

struktur ujung terminasi mRNA, struktur seperti daun semanggi ini terjadi

karena adanya urutan palindrom yang diselingi oleh beberapa basa

(Gambar 3). Pada salah satu kalanya, tRNA membawa tiga buah basa

yang komplemeter dengan triplet kodon pada mRNA. Ketiga basa ini

dinamakan antikodon. Sementara itu, pada ujung 3’-nya terdapat tempat

pengikatan asam amino tertentu. Pengikatan yang membentuk molekul

aminoasil-tRNA ini terjadi dengan bantuan enzim aminoasil-tRNA

sintetase. Dalam hal ini gugus hidroksil (OH) pada ujung 3’ tRNA terikat

sangat kuat dengan gugus karboksil (COOH) asam amino. Macam asam

amino yang dibawa ditentukan oleh urutan basa pada antikodon. Jadi, ada

beberapa macam aminoasil-tRNA sesuai dengan antikodon dan macam

asam amino yang dibawanya.

c. RNA ribosomal atau ribosomal RNA (rRNA), yang strukturnya

merupakan bagian struktur ribosom. Lebih kurang separuh struktur kimia

ribosom berupa rRNA dan separuh lainnya berupa protein. Molekul

rRNA, dan juga tRNA, dapat dikatakan sebagai RNA struktural dan tidak

ditranslasi menjadi asam amino/protein. Akan tetapi, mereka adalah

bagian mesin sel yang menyintesis protein (lihat uraian tentang translasi di

bawah ini).

D. TRANSLASI

Bila dibandingkan dengan transkripsi, translasi merupakan proses

yang lebih rumit karena melibatkan fungsi berbagai makromolekul. Oleh

karena kebanyakan di antara makromolekul ini terdapat dalam jumlah besar di

dalam sel, maka sistem translasi menjadi bagian utama mesin metabolisme

pada tiap sel. Makromolekul yang harus berperan dalam proses translasi

tersebut meliputi :

a. Lebih dari 50 polipeptida serta 3 hingga 5 molekul RNA di dalam tiap

ribosom

b. Sekurang-kurangnya 20 macam enzim aminoasil-tRNA sintetase yang akan

mengaktifkan asam amino

c. Empat puluh hingga 60 molekul tRNA yang berbeda

d. Sedikitnya 9 protein terlarut yang terlibat dalam inisiasi, elongasi, dan

terminasi polipeptida.

Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam

ribosom, suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma.

Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama

inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering

dinyatakan atas dasar laju pengendapannya selama sentrifugasi sebagai satuan

yang disebut satuan Svedberg (S). Pada kebanyakan prokariot ribosom

mempunyai ukuran 70S, sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S.

Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-

masing dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P).

Molekul aminoasil-tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A,

sedangkan molekul tRNA yang membawa rantai polipeptida yang sedang

diperpanjang terikat di tapak P.

Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung

dengan arah tertentu sebagai berikut :

a. Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’

hingga ujung 3’.

b. Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan

menambahkan asam-asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai

contoh, sintesis protein yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro- . . . -Gly-Ser-

COOH pasti dimulai dengan metionin dan diakhiri dengan serin.

Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua

subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot

terdapat urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom

(ribosom binding site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot

pengikatan ribosom dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai

aminoasil-tRNA akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA

ini dengan urutan sesuai dengan antikodon dan asam amino yang dibawanya.

Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada mRNA. Ikatan peptida

terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi rantai polipeptida di

tapak P ribosom. Penggabungan asam-asam amino terjadi karena gugus amino

pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada asam

amino yang terdapat pada rantai polipeptida yang sedang diperpanjang.

Penjelasan tentang mekanisme sintesis protein yang lebih rinci disertai contoh,

khususnya pada prokariot, akan diberikan di bawah ini.

Inisiasi sintesis protein dilakukan oleh aminoasil-tRNA khusus, yaitu

tRNA yang membawa metionin (dilambangkan sebagai metionil-tRNAi Met). Hal

ini berarti bahwa sintesis semua polipeptida selalu dimulai dengan metionin.

Khusus pada prokariot akan terjadi formilasi gugus amino pada metionil-tRNAi

Met (dilambangkan sebagai metionil-tRNAf Met) yang mencegah terbentuknya

ikatan peptida antara gugus amin tersebut dengan gugus karboksil asam amino

pada ujung polipetida yang sedang diperpanjang sehingga asam amino awal pada

polipeptida prokariot selalu berupa f-metionin. Pada eukariot metionil-tRNA i Met

tidak mengalami formilasi gugus amin, tetapi molekul ini akan bereaksi dengan

protein-protein tertentu yang berfungsi sebagai faktor inisiasi (IF-1, IF-2, dan IF-

3). Selain itu, baik pada prokariot maupun eukariot, terdapat pula metionil-tRNA

yang metioninnya bukan merupakan asam amino awal (dilambangkan sebagai

metionil-tRNAMet).

Kompleks inisiasi pada prokariot terbentuk antara mRNA, metionil-tRNAf

Met, dan subunit kecil ribosom (30S) dengan bantuan protein IF-1, IF-2, dan IF-3,

serta sebuah molekul GTP. Pembentukan kompleks inisiasi ini diduga difasilitasi

oleh perpasangan basa antara suatu urutan di dekat ujung 3’ rRNA berukuran 16S

dan sebagian urutan pengarah (leader sequence) pada mRNA. Selanjutnya,

kompleks inisiasi bergabung dengan subunit besar ribosom (50S), dan metionil-

tRNAf Met terikat pada tapak P. Berpasangannya triplet kodon inisiasi pada mRNA

dengan antikodon pada metionil-tRNAf Met di tapak P menentukan urutan triplet

kodon dan aminoasil-tRNAf Met berikutnya yang akan masuk ke tapak A.

Pengikatan aminoasi-tRNAf Met berikutnya, misalnya alanil-tRNAala, ke tapak A

memerlukan protein-protein elongasi EF-Ts dan EF-Tu. Pembentukan ikatan

peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNAf Met di tapak P dan gugus

amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil transferase,

suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan

dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAala di

tapak A.

Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan

f-met-alatRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada

ribosom sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak

A masuk ke tapak P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A

ke P tersebut adalah triplet kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya,

misalnya penyandi serin, akan masuk ke tapak A dan proses seperti di atas hingga

translokasi akan terulang kembali. Translokasi memerlukan aktivitas faktor

elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan dengan EF-G.

Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung

hingga suatu tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A. Sebelum

suatu rantai polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada

f-metionin menjadi metionin. Terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA

di tapak P, dan rantai polipeptida dari ribosom. Selain itu, kedua subunit ribosom

pun memisah. Pada terminasi diperlukan aktivitas dua protein yang berperan

sebagai faktor pelepas atau releasing factors, yaitu RF-1 dan RF-2.

Sesungguhnya setiap mRNA tidak hanya ditranslasi oleh sebuah ribosom.

Pada umumnya sebuah mRNA akan ditranslasi secara serempak oleh beberapa

ribosom yang satu sama lain berjarak sekitar 90 basa di sepanjang molekul

mRNA. Kompleks translasi yang terdiri atas sebuah mRNA dan beberapa

ribosom ini dinamakan poliribosom atau polisom. Besarnya polisom sangat

bervariasi dan berkorelasi dengan ukuran polipeptida yang akan disintesis.

Sebagai contoh, rantai hemoglobin yang tersusun dari sekitar 150 asam amino

disintesis oleh polisom yang terdiri atas lima buah ribosom (pentaribosom).

Pada prokariot translasi seringkali dimulai sebelum transkripsi berakhir.

Hal ini dimungkinkan terjadi karena tidak adanya dinding nukleus yang

memisahkan antara transkripsi dan translasi. Dengan berlangsungnya kedua

proses tersebut secara bersamaan, ekspresi gen menjadi sangat cepat dan

mekanisme nyala-padam (turn on turn off) ekspresi gen, seperti yang akan

dijelaskan nanti, juga menjadi sangat efisien.

Namun, tidak demikian halnya pada eukariot. Transkripsi terjadi di dalam

nukleus, sedangkan translasi terjadi di sitoplasma (ribosom). Pertanyaan yang

muncul adalah bagaimana mRNA hasil transkripsi dipindahkan dari nukleus ke

sitoplasma, faktor-faktor apa yang menentukan saat dan tempat translasi?

Sayangnya, hingga kini kita belum dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan

tersebut dengan memuaskan. Kita baru mengetahui bahwa transkripsi dan

translasi pada eukariot jauh lebih rumit daripada proses yang ada pada prokariot.

Salah satu di antaranya seperti telah kita bicarakan di atas, yaitu bahwa mRNA

hasil transkripsi (transkrip primer) pada eukariot memerlukan prosesing terlebih

dahulu sebelum dapat ditranslasi.

1. KODE GENETIK

Penetapan triplet kodon pada mRNA sebagai pembawa informasi genetik

atau kode genetik yang akan menyandi pembentukan suatu asam amino tertentu

berawal dari pemikiran bahwa macam basa nitrogen jauh lebih sedikit daripada

macam asam amino. Basa nitrogen pada mRNA hanya ada empat macam,

sedangkan asam amino ada 20 macam. Oleh karena itu, jelas tidak mungkin tiap

asam amino disandi oleh satu basa. Begitu juga, kombinasi dua basa hanya akan

menghasilkan 42 atau 16 macam duplet, masih lebih sedikit daripada macam

amino yang ada. Kombinasi tiga basa akan menghasilkan 43 atau 64 triplet,

melebihi jumlah macam asam amino. Dalam hal ini, satu macam asam amino

dapat disandi oleh lebih dari satu macam triplet kodon.

Sifat-sifat kode genetik

Kode genetik mempunyai sifat-sifat yang akan dijelaskan sebagai berikut :

a. Kode genetik bersifat universal. Artinya, kode genetik berlaku sama hampir di

setiap spesies organisme.

b. Kode genetik bersifat degenerate atau redundant, yaitu bahwa satu macam

asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Sebagai contoh,

treonin dapat disandi oleh ACU, ACC, ACA, dan ACG. Sifat ini erat

kaitannya dengan sifat wobble basa ketiga, yang artinya bahwa basa ketiga

dapat berubah-ubah tanpa selalu disertai perubahan macam asam amino yang

disandinya. Diketahuinya sifat wobble bermula dari penemuan basa inosin (I)

sebagai basa pertama pada antikodon tRNAala ragi, yang ternyata dapat

berpasangan dengan basa A, U, atau pun C. Dengan demikian, satu antikodon

pada tRNA dapat mengenali lebih dari satu macam kodon pada mRNA.

Basa I(5’)

Basa IIBasa III

(3’)

U C A G U

U

Phe Ser Tyr Cys C

Phe Ser Tyr Cys A

Leu Ser Stop Stop G

Leu Ser Stop Trp U

C

Leu Pro His Arg C

Leu Pro His Arg A

Leu Pro Gln Arg G

Leu Pro Gln Arg U

A

ILe Thr Asn Ser C

ILe Thr Asn Ser A

ILe Thr Lys Arg G

Met Thr Lys Arg U

G

Val Ala Asp Gly C

Val Ala Asp Gly A

Val Ala Glu Gly G

Val Ala Glu Gly U

c. Oleh karena tiap kodon terdiri atas tiga buah basa, maka tiap urutan basa

mRNA, atau berarti juga DNA, mempunyai tiga rangka baca yang berbeda

(open reading frame). Di samping itu, di dalam suatu segmen tertentu pada

DNA dapat terjadi transkripsi dan translasi urutan basa dengan panjang yang

berbeda. Dengan perkataan lain, suatu segmen DNA dapat terdiri atas lebih

dari sebuah gen yang saling tumpang tindih (overlapping). Sebagai contoh,

bakteriofag фX174 mempunyai sebuah untai tunggal DNA yang panjangnya

lebih kurang hanya 5000 basa. Seandainya dari urutan basa ini hanya

digunakan sebuah rangka baca, maka akan terdapat sekitar 1700 asam amino

yang dapat disintesis. Kemudian, jika sebuah molekul protein rata-rata

tersusun dari 400 asam amino, maka dari sekitar 1700 asam amino tersebut

hanya akan terbentuk 4 hingga 5 buah molekul protein. Padahal

kenyataannya, bakteriofag фX174 mempunyai 11 protein yang secara

keseluruhan terdiri atas 2300 asam amino. Dengan demikian, jelaslah bahwa

dari urutan basa DNA yang ada tidak hanya digunakan sebuah rangka baca,

dan urutan basa yang diekspresikan (gen) dapat tumpang tindih satu sama

lain.

Tabel 1. Kode genetik

Keterangan :

phe = fenilalanin, ser = serin, his = histidin, glu = asam glutamat, leu = leusin,

pro = prolin, gln = glutamin, cys = sistein, ile = isoleusin, thr = treonin, asn =

asparagin, trp = triptofan, met = metionin, ala = alanin, lys = lisin, arg =

arginin, val = valin, tyr = tirosin, asp = asam aspartat, gly = glisin, AUG

(kodon metionin) dapat menjadi kodon awal (start codon), stop = kodon stop

(stop codon)

E. PENGATURAN EKSPRESI GEN

Produk-produk gen tertentu seperti protein ribosomal, rRNA, tRNA,

RNA polimerase, dan enzim-enzim yang mengatalisis berbagai reaksi

metabolisme yang berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel merupakan

komponen esensial bagi semua sel. Gen-gen yang menyandi pembentukan

produk semacam itu perlu diekspresikan terusmenerus sepanjang umur

individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung kepada kondisi

lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya yang

ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka

hanya akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu. Untuk

gen-gen semacam ini harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya.

Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya

transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil

penelitian menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada

prokariot, paling banyak terjadi pada tahap transkripsi.

Mekanisme pengaturan transkripsi, baik pada prokariot maupun pada

eukariot, secara garis besar dapat dibedakan menjadi dua kategori utama,

yaitu (1) mekanisme yang melibatkan penyalapadaman (turn on and turn off)

ekspresi gen sebagai respon terhadap perubahan kondisi lingkungan dan (2)

sirkit ekspresi gen yang telah terprogram (preprogramed circuits). Mekanisme

penyalapadaman sangat penting bagi mikroorganisme untuk menyesuaikan

diri terhadap perubahan lingkungan yang seringkali terjadi secara tiba-tiba.

Sebaliknya, bagi eukariot mekanisme ini nampaknya tidak terlalu penting

karena pada organisme ini sel justru cenderung merespon sinyal-sinyal yang

datang dari dalam tubuh, dan di sisi lain, sistem sirkulasi akan menjadi

penyangga bagi sel terhadap perubahan kondisi lingkungan yang mendadak

tersebut. Pada mekanisme sirkit, produk suatu gen akan menekan transkripsi

gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen kedua, produk gen

kedua akan menekan transkripsi gen kedua dan memacu transkripsi gen

ketiga, demikian seterusnya. Ekspresi gen yang berurutan ini telah terprogram

secara genetik sehingga gen-gen tersebut tidak akan dapat diekspresikan di

luar urutan. Oleh karena urutan ekspresinya berupa sirkit, maka mekanisme

tersebut dinamakan sirkit ekspresi gen.

III. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

- Satu perangkat komputer

- modem

- Alat tulis

2. Bahan

- Situs NCBI

IV. CARA KERJA

1. Analisis Ekspresi Gen

Buka situs NCBI

Isi kotak search nucleotide for dengan nama gen (kode gen : NM_000125) yang akan

dianalisis (diberi keterangan bahwa gen yang ingin diteliti adalah gen pada Homo

sapiens)

Pilih gen yang akan dianalisis

Copy sekuens dalam region CDS

Buka situs NCBI lagi kemudian klik ORF Finder

Masukkan sekuens CDS yang telah di-copy ke kolom FASTA Format-V

Klik ORF Find, akan muncul 6 frame

Klik frame tersebut satu per satu maka akan muncul sekuens asam amino hasil

transkripsi dari CDS yang telah dimasukkan tadi. Carilah frame mana yang

merupakan sekuens gen pengkode protein target dengan mencocockkan sekuens asam

amino yang didapat dengan sekuens asam amino pada tampilan awal identitas gen.

2. Homologi Protein

Buka situs NCBI

Isi kotak search nucleotide for dengan nama gen (kode gen : NM_000125) yang akan

dianalisis (diberi keterangan bahwa gen yang ingin diteliti adalah gen pada Homo

sapiens)

tentukan suatu gen yang akan dianalisis homologi proteinnya

setelah masuk ke halaman Page Sequence Viewer, copy code protein

Copy sekuens asam aminonya

Keluar dari halaman trsebut, atau buka lagi situs yang sama. Klik menu BLAST

Pilih protein-protein blast (blastp), klik. Paste sekuens asam amino pada kotak

QUERY untuk mencari homolognya

Tekan BLAST. Hasil akan muncul pada new window

Lakukan analisis lebih lanjut mengenai homologinya protein terhadap sekuens asam

amino yang dimasukkan tadi, yaitu pada organisme selain Homo sapiens, perhatikan

score-nya. Klik masing-masing organisme yang sehomolog untuk memebandingkan

residu asam aminonya dengan query.

V. DATA HASIL PERCOBAAN

1. Analisis Ekspresi Gen

a. Latihan

Kode Gen : NM_000125

Nama gen : Estrogen receptor 1 (ESR1)

Source : Homo sapiens

Region CDS : 235-2022

ORF Finder

No. Frame Start Kodon Stop Kodon

1. +1 27 atg

2. +2 4 tga

3 +2 2 Tga

4 +3 - Tga

5 +3 1 Taa

6 -1 2 Tga

7 -2 3 Tag

8 -2 9 Tga

9 -3 1 Tga

b. Tugas

Kode Gen : NM_030756

Nama gen : Homo sapiens estrogen receptor

Region CDS : 508-2298

ORF Finder

No. Frame Start Kodon Stop Kodon

1. +1 11 TAG

2. +2 4 TAG

3. +2 3 TAA

4 +2 2 TGA

5 +3 1 TGA

6 +3 - TAG

7 -1 3 TGA

8 -1 3 TAA

9 -2 2 TAG

10 -2 - -

11 -2 3 TGA

12 -3 1 TGA

2. Homologi Protein

a. Latihan

Kode Gen : NM_000125

Kode Protein : NP_000116.2

Nama Protein : Homo sapiens esterogen reseptor -1

CDS : 235…2022

Kesimpulan : ada beberapa protein hewan yang homolog dengan protein

estrogen receptor -1 pada Homo sapiens yaitu antara lain pada organism Pan

troglodytes (simpanse), Pan paniscus (simpanse kerdil), Pongo abelii (orang utan

Sumatra), Macaca mulata (kera rhesus).

b. Tugas

Kode Gen : NM_030756

Kode Protein : NP_110383.2

Nama Protein : Homo sapiens estrogen receptor

CDS : 508…2298

Kesimpulan : Ada beberapa protein hewan yang homolog dengan homo

sapiens estrogen receptor pada Homo sapiens yaitu antara lain pada organisme

mus musculus, ochtona princeps, orycterapus afer-afer.

VI. PEMBAHASAN

Pada Praktikum kali ini bertujuan untuk menganalisis ekspresi gen dan

mendeteksi hasil ekspresi gen juga mencari homologi gen penghasil protein tertentu

dari manusia dengan beberapa organisme lain. Dalam praktikum kali ini, yang

digunakan adalah kode protein dari Homo sapiens esterogen reseptor, dengan kode

gen yang digunakan adalah NM_000125. Dengan daerah CDS 235…2022. Dari

daerah itu, gen yang diambil dan dianalisis yaitu 235…2022 yang digunakan sebagai

latihan dan kode protein dari Homo sapiens estrogen Receptor dengan kode gen yang

digunakan NM_030756. Dengan daerah CDS 508...2298 yang digunakan sebagai

Tugas. Dalam Praktikum ini digunakan fasilitas ORI Finder ( Opening Reading

Frame) pada situs NCBI.

Ekspresi gen disebut juga dengan rangkaian atau varian asam amino. Proses

ekspresi gen diawali dengan transkripsi DNA menjadi mRNA yang kemudian

ditranslasikan menjadi asam amino. Asam amino inilah yang kemudian menjadi

protein. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan cara melihat sekuens suatu gen yang

diekspresikan melalui sintesis protein dalam proses translasi.

Hal pertama yang dilakukan dalam melakukan analisis ini adalah membuka

situs NCBI, mengisi kotak search nucleotide for dengan kode gen yang telah

ditentukan. Kemudian gen yang diambil dari CDS dicopy dan dibuka kembali situs

NCBI dan buka ORF Finder ( Open Reading Frame Finder) dan diisi kotak ORF yang

kosong dengan gen yang sudah dicopy kemudian dipastekan ke kolom FASTA

Format-V. Kemudian diklik dan akan muncul frame yang akan menunjukkan ada

tidaknya start kodon dan stop kodon. Karena dalam tiap frame belum tentu ditemukan

adanya start kodon dan stop kodonnya. Untuk mengetahui adanya start kodon

ditunjukkan dengan adanya warna biru sebagai tanda mulainya proses transkripsi dan

warna merah muda menunjukkan stop kodon sebagai tanda bahwa proses translasi

telah berakhir. Gen yang diekspresikan untuk sintesis protein ditunjukkan oleh

basanya.

Hasil ORF Finder dari Tugas dengan kode gen NM_030756 tesebut terlihat

ada 12 bagian frame yang dapat dianalisis. Dari ke12 frame tersebut, frame +3 dan -2

tidak mempunyai start kodon dan frame -2 juga tidak mempunyai stop kodon

sehingga tidak mencerminkan ekspresi gen dari Homo sapiens. Sedangkan frame

lainnya memiliki start kodon dan stop kodon sehingga kelima frame lainnya dapat

mencerminkan ekspresi gen dari Homo sapiens.

Pada gen Homo sapiens dilakukan juga percobaan analisis homologi protein

menggunakan fasilitas blastp (protei-protein blast) yang terdapat dalam situs NCBI.

Fungsi dari blastp adalah membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki

dengan database sekuen protein. Kemiripan protein dapat dilihat dari jumlah Query

coverage yang ditampilkan dalam blastp. Hasil blastp dari percobaan ini

menunjukkan bahwa terdapat banyak sekali protein hewan yang sehomolog dengan

protein Homo sapiens estrogen receptor antara lain protein pada :

1. Mus Mucullus ( tikus putih )

2. Ochothona Princeps ( America Pika)

3. Orycteropus afer afer

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Sekuens gen Homo sapiens estrogen receptor isoform 1 memiliki 12 frame yang

mencerminkan ekspresi gen karena memiliki start kodon dan stop kodon.

2. Beberapa protein yang sehomolog dengan protein Homo sapiens astrogen

receptor isoform 1 merupakan organisme Mus Mucullus ( tikus putih ),

Ochothona Princeps ( America Pika) dan Orycteropus afer afer.

DAFTAR PUSTAKA

Brock TD, Madigan MT. Biology of Microorganisms. 5th ed. Prentice Hall. New

Jersey. 1988

Carcillo JA, Parise A, Romkes-Sparks M. 1994. Comparisson of the enzyme-linked

oligonucleotide sorbent assay to 32P-labeled PCR/Southern blotting technique

in quantitative analysis of human and rat mRNA. PCR Methods Appl. 3: 292-

297.

Furuya H, et al. 2005. An improved method for Southern DNA and Northern RNA

blotting using a Mupid®-2 Mini-Gel electrophoresis unit. J Biochem Biophysi

Meth 68: 139-143.

Kittigul L, Suthachana S, Kittigul C, Pengruangrojanachai V. 1998. Immunoglobulin

M-capture biotin-strepavidin enzyme-linked immunosorbent assay for detection

of antibodies to dengue viruses. Am J Trop Med Hyg 59(3): 352-356.

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Tekni Dasar Pengklonan

Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi-Lembaga

Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI-DIKNAS.

Bogor.

Susanto, A.H (2002), Bahan Ajar Genetika Dasar, Fakultas Biologi UNSOED,

Purwokerto

Yuwono, T., 2008, Biologi Molekular, Erlangga, Jakarta

http://www.ncbi.nlm.nih.gov