rekayasa genetika (kelompok 4).pptx

Anissa Permatadietha Ardiellaputri

Fransiska Milaniati Pratiwi

Khairu Nuzula

Yunita Florensia

pemotongan modifikasi penyambungan

t u j u a n p e m o t o n g a n D N A

Untuk memudahkan dalam pemisahan DNA dengan sekuen-

sekuen tertentu. DNA yang sudah dipotong dapat digunakan

untuk produksi, kloning, dan identifikasi dalam rekombinasi

molekul DNA

(Nicholl 1994)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

m e t o d e p e m o t o n g a n D N A

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

2 cara

pemotongan

Secara mekanisPengocokan

(sonikasi)

Secara

enzimatisEnzim restriksi

j a l a n p e m o t o n g a n

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

s o n i k a s i

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php

s o n i k a s i

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php

e n z i m a t i s

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA dengan

sekuen yang didefinisikan

Enzim restriksi yang mengikat DNA pada sekuen yang

spesifik dinamakan regnition sites (Sofer 1991).

Enzim ini ditemukan pada sel bakteri yang berfungsi

sebagai bagian dari mekanisme protektif yang disebut

restriction mechanism system.

e n z i m a t i s (sekuens pengenal)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Adalah situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang

menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan

melakukan pemotongan pada sekuen tersebut

Sekuen Pengenal Ecori

e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m a t i s (hasil restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m a t i s (hasil restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m a t i s (nomenclature)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Contoh berikut enzim EcoRI yang memiliki pola

e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

PALINDROMIK

e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada

utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa, diperkirakan

akan memotong setiap 256 nukleotida.

Asumsi : setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama

untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari

4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6

basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096.

e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs

pengenalan yang sama, isoschizomers

Contoh :

e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Beberapa enzim yang berbeda dapat membentuk akhiran

yang sama. Contoh Sau3AI menghasilkan akhiran GATC-

begitu juga dengan BamHI

Pemotongan dipengaruhi oleh :

Metilasi

Buffer

Struktur sekunder dalam substrat

e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)

Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )

Aktivitas Enzim diukur dalam sebuah unit

Preparasi restriksi endonuklease digunakan untuk kloning

seharusnya terbebas dari nukleases yang lainnya

Digesti parsial mungkin berguna

Cleavage sites dapat diketahui menggunakan molekul

standard

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )

e n z i m y a n g b e r p e r a n

Phosphatases

Polymerases

Exonycleases Methylases

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )

p h o s p h a t a s e s

Enzim yang secara hidrolitik membuang gugus phosphate

dari molekul DNA, menggantinya dengan gugus hidroksil

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )

p o l y m e r a s e s

DNA-dependent DNA polymerases

RNA-dependent DNA polymerases

DNA-dependent RNA polymerases

RNA-dependent RNA polymerases

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )

e x o n u c l e a s e s

Memendekkan rantai dobel DNA dengan 2 jalan :

Memindahkan strands secara terpisah

Memindahkan kedua strands dengan

bersamaan

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )

e x o n u c l e a s e s

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i

INTERMOLEKULAR

• ujung dari molekul

diligasikan dengan

ujung dari molekul

yang lainnya

INTRAMOLEKULAR

• ujung dari molekul

diligasikan dengan

ujung dari molekul

itu sendiri

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i(enzim yang berperan)T4 DNA

Ligase

E.coli DNA Ligase

TopoisomeraseTransposase

Recombinase

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i(enzim yang berperan)

1. T4 DNA ligase

dikodekan oleh bakteriofage T4 dan diproduksi pada infeksi sel

E.Coli, dapat digunakan untuk ligasi sticky ends dan blunt

ends, butuh ATP, butuh 3’-hydroxyl dan 5’-gugus fosfat pada

molekul untuk disatukan

2. E.coli DNA ligase

– Tidak dapat digunakan untuk ligasi blunt-ended

– butuh 3’-hydroxyl dan 5’-gugus fosfat pada molekul untuk

disatukan

– NAD+ sebagai kofaktor

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i(enzim yang berperan)

Action of DNA

ligase

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i(enzim yang berperan)

3. Topoisomerase

– Mengubah derajat supercoiling dari molekul DNA.

– Dengan membelah satu atau dua strands, rotasi duplex

dan menyegelnya.

– Diberikan DNA molekuler linier dengan topoisomerasi

terlampir diakhir dan merupakan target molekul yang

sesuai, enzim akan meligasi keduany, oleh karena itu

enzim ini cepat

Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)

l i g a s i(enzim yang berperan)

4. Transposase

– Mampu memindahkan DNA satu sama lain

– Dapat digunakan sebagai jalan untuk menyisipkan

features seperti replikasi asli atau gen antibiotik

resistansi kedalam molekul

5. Recombinase

pemurnian plasmid

gel elektrofore

sissekuensing

t r a n s f o r m a s i g e n e t i k

Transformasi genetik termasuk salah satu cara

terjadinya perubahan sel akibat adanya sel dari luar.

Transformasi jarang terjadi alami

Transformasi pada bakteri digunakan untuk rekayasa

genetika

transformasi genetik

Dalam rekayasa genetika, transformasi berperan

penting untuk kloning molekuler

Gen yang ingin digandakan, disisipkan ke dalam vektor.

Vektor mengganda dan gen yang diinginkan pun

bereplikasi

transformasi dalam konteks genetic engineering

transformasi genetik

komponen transformasi genetik

vektor

gene of interest

host

vektor

Vektor adalah materi genetik yang bersifat Replicon atau

mudah mengganda. Sifat ini yang menjadikan gen dapat

mengganda dengan cepat

Contoh vektor yang sering digunakan adalah plasmid

vektor plasmid

Plasmid biasanya memiliki gen yang mengekspreksikan

resistansi terhadap antibiotik tertentu

Plasmid sangat mudah untuk mengganda

Untuk berperan sebagai vektor, plasmid pertama-tama di

isolasi sehingga dapat disispkan dengan gene of interest

gene of interest

Gen ini adalah gen yang ingin disisipkan untuk

mendapatkan sel baru dengan sifat yang diinginkan

Misalnya : gen antihama untuk sel tumbuhan ; gen pengurai

logam untuk bakteri sebagai penanggulangan limbah ; dll

Gen itu diisolasi dari gen asal setelah dilakukan sekuensing

dgn cr elektroforesis

host

Host adalah sel yang akan dimasukan plasmid rekombinan. Atau

dengan kata lain host adalah sel yang akan bertransformasi

Host yang biasa digunakan adalah E. Coli

Untuk transformasi yang bertujuan untuk menghasilkan suatu

produk, host kemudian dipecah dengan metode lisis alkali

memasukkan insert ke dalam host

Agar Plasmid bisa masuk kedalam sel, maka perlu rekayasa

terhadap Permeabilitas sel host.

Karena faktor ini menyebabkan transormasi alami jarang

terjadi

Caranya dengan menginkubasikan sel dalam larutan kalsium

klorida kemudian mengaplikasikan gelombang panas

isolasi dan purifikasi plasmid

Untuk dapat menyisipkan gene of interest kedalam plasmid

dan membuat plasmid rekombinan, sebelumnya plasmid

yang ingin digunakan sebagai vektor perlu diisolasi

Teknik isolasi dari plasmid ada bermacam-macam.

p e m u r n i a n p l a s m i d

isolasi dan purifikasi plasmid

Pada prinsipnya, yang pertama dilakukan adalah melisis sel

bakteri yang plasmidnya ingin dijadikan vektor

Kemudian komponen sel yang terlisis tersebut disentrifugasi

sehingga akan terpisah berdasarkan berat molekulnya.

Setelah itu dengan menggunakan membran dilakukan

pemisahan antara DNA sirkuler dan DNA kromosomal dengan

Membrane Binding atau penambahan reagent seperti EtBr.

p e m u r n i a n p l a s m i d

isolasi dan purifikasi plasmid

p e m u r n i a n p l a s m i d

mendapatkan gene of interest

Gene of Interest atau Insert didapatkan dengan melakukan

pemotongan DNA tepat pada basa nitrogen yang mengkodekan

protein yang diinginkan

Untuk dapat memisahkan DNA yang akan disisipkan dari

keseluruhan DNA digunakan metode Gel elektroforesis

p e m u r n i a n p l a s m i d

gel elektroforesis

Gel elektroforesis adalah teknik analitik untuk memisahkan

protein berdasarkan ukuran molekulnya.

Karena medium gel yang digunakan berpori dengan diameter

tertentu. maka molekul yang lebih besar akan membutuhkan

waktu yang lebih lama untuk melewati medium.

Karena itu fragmen-fragmen DNA akan terpisahkan

berdasarkan ukuran fragmenya

gel elektroforesis

gel elektroforesis DNA

Molekul asam nukleat di atur didalam media yang memiliki

viskositas tinggi yaitu gel.

Kemudian medan listrik diinduksikan sehingga asam nukleat

akan bergerak ke arah anoda karena muatan negatif yang

dimiliki gula-fosfat.

Karena perbedaan ukuran maka molekul yang lebih besar akan

kesulitan melewati gel sementara molekul yang lebih kecil akan

lebih mendekati anoda dibanding molekul yang lebih besar.

Gel yang biasa digunakan untuk elektroforesis DNA adalah

Agarosa atau Poliakrilamida.

gel elektroforesis dalam rekayasa genetika

Untuk dapat menyisipkan Gen kedalam plasmid,

sebelumnya perlu diketahui fragmen yang mengandung

gen yang diinginkan.

Maka perlu diketahui urutan atau sekuens dari basa

nitrogen dalam DNA

Ada 2 metode yang umum dilakukan untuk menentukan

sekuens DNA

metode maxam-gilbert

Ditemukan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert

Prinsipnya adalah menambahkan bahan kimia sehingga

memutus rantai DNA

Basa nitrogen Purin diputus dengan Asam Format

Guanin direaksikan dengan Dimetil Sulfat

Pirimidin direaksikan dengan hydrazine

Basa nitrogen Cytosin diputus dengan hydrazine yang

ditambah dengan garam dapur

s e k u e n s i n g

metode sanger

Salah satu metode untuk melakukan Sekuensing adalah

Metode Sanger atau Chain Termination Methods.

s e k u e n s i n g

metode sanger

Setelah terjadi pemutusan basa nitrogen akibat pengikatan

ddNTP, fragmen tersebut akan dibaca oleh gel elektroforesis.

s e k u e n s i n g

DNA PRIMER

dNTP

ddNTP

metode sanger

s e k u e n s i n g

hasil pembacaan

elektroforesis untuk

metode sanger

DNA primer

s e k u e n s i n g

Untuk mendapatkan Sekuens DNA dengan metode

Sanger dibutuhkan Primer DNA

Bagaimana cara mengetahui sekuens

DNA Primer agar dapat menempel di

template DNA?

caranya..... (menduga)

s e k u e n s i n g

Menggunakan metode Maxam-Gilbert

Memutasi secara terkontrol Gen-gen yang paling ujung

sehingga diketahui Gennya

Menyisipkan DNA pada plasmid bakteri yang sudah

diketahui sekuensnya.

Menggunaan DNA spesies yang mirip

kesimpulannya.....Transformasi genetik

Vektor Plasmid

Isolasi Plasmid

Insert

Sekuensing

Gel Elektroforesi

s

konsep dasar

faktor keberhasil

anmodifikasi

adalah sebuah teknik ilmiah dalam biologi molekular untuk

memperkuat satu atau beberapa salinan sepotong DNAdi beberapa

kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan tertentu

urutan DNA

p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n

1983

Kary Mullis

k o m p o n e n P C R

PCR

DNA templat

e

DNA primer

dNTP

enzim DNA

Polimerase

D N A t e m p l a t e

sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama

komponen P C R

peyiapan DNA template

Metode LisisMetode isolasi DNA

kromosom / DNA plasmid

p e n y i a p a n DNA t e m p l a t e (metode lisis)

merusak dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan menggunakan buffer lisiscontoh :

5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL

50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl20,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL

komponen P C R

buffer yang biasa digunakan

buffer lisis K

D N A p r i m e r

sebagai penginisiasi rekasi polimerisasi DNA secara in vitro

membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada

reaksi PCR

komponen P C R

Sepotong DNA pendek utas tunggal atau lebih dikenal dengan

oligonuleotida, panjangnya anatar 10 sampai sekitar 40 basa

saja.

F U N G S I D N A P R I M E R

D N A p r i m e r komponen P C R

Desain DNA primer yang bagus

keseimbangan antara spesifisitas dan efisiensiS

pesi

fisi

tasFrekuensi

terjadinya mispri

ming (kesalahan

penempelan)

primer pada

tempat yang

tidak seharusnya

Efisi

ensi Seberapa dekat

perolehan jumlah

produk PCR

dengan nilai

teoritis yang

seharusnya

dicapai

m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R

Tentukan tujuan

Menyiapkan sekuen Referensi (GenBank)

Manual atau perlu bantuan software

Siap mendesain primer

Menguji spesifisitas primer

m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R

m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R

Pada kotak yang tersedia, masukkan sekuen referensi Anda. Anda bisa juga mengunggah

(upload) sekuen dari file di komputer.

Pilih jenis primer yang ingin Anda desain, sense primer (left primer), antisense (right primer)

dan probe untuk hibridisasi (internal oligo). Kotak yang ada di bawahnya bisa diisi jika Anda

sudah memiliki kandidat primer.

Tentukan beberapa parameter lain jika diperlukan seperti excluded region (daerah dimana

primer tidak boleh menempel di situ), targets (primer harus mengapit daerah tersebut)

dan included region(kedua primer harus berada di dalam daerah ini).

Beberapa opsi yang lebih mendalam bisa kita tambahkan pula pada tab General Settings,

Advance Settings, Internal Oligo, Penalty Weights dan Sequence Quality. Namun untuk saat

ini kita biarkan dalam pilihan defaultnya.

Jika semua opsi sudah terisi, tekan tombol PICK PRIMERS untuk memulai pencarian primer

yang terbaik.

m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R

m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R

Primer3Plus akan memberikan beberapa alternatif pasangan

primer yang dapat kita pilih. Pada gambar di atas terlihat

pasangan primer pertama.

Nama Left Primer dan Right Primer

Sekuen kedua primer

Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik Leleh

(Tm), % GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder

yang mungkin terjadi.

Ukuran produk PCR

p a r a m e t e r D N A p r i m e r komponen P C R

p a n j a n g p r i m e r

• Umumnya panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa

• Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan

spesifisitas primer rendah

k o m p o s i s i p r i m e r

• Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat

menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan

terjadinya mispriming di tempat lain

• Urutan nukleotitda pada ujung 3’ sebaiknya G atau C

p a r a m e t e r D N A p r i m e r komponen P C R

m e l t i n g t e m p e r a t u r ( T m )

• Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer• [2(A+T) + 4(C+G)]

i n t e r a k s i p r i m e r - p r i m e r

• Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology

harus dihindari

d N T P

bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam

proses ekstensi DNA

komponen P C R

suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin

trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat)

dan

dGTP (deoksiguanosin trifosfat)

F U N G S I d N T P

b u f f e r P C R d a n M g C l 2

komponen P C R

untuk menjamin pH medium

buffer

sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase

MgCl2

e n z i m D N A p o l i m e r a s ekomponen P C R

Berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA

Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR

diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena

itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC

elongasi proofreading

m e k a n i s m e P C R

m e k a n i s m e P C R

m e k a n i s m e P C R

f a k t o r k e b e r h a s i l a n P C R

Jenis Polimer-ase DNA

1 Konsen-trasi2 Suhu3 Buffer

PCR4 Waktu5

j e n i s p o l i m e r a s e D N A

Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses

PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang

akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek

keberhasilan P C R

k o n s e n t r a s ikeberhasilan P C R

dNTPs

< 1 kbasa 100 uM

> 1kbasa 200 uM

MgCl2Konsentrasi MgCl2 yang

terlalu rendah akan

menurunkan perolehan

PCR. Konsentrasi yang terlalu tinggi akan

menyebabkan akumulasi produk non

target

DNA polimerase

< 2kbasa 1,25 - 2 unit

per 50 uL

> 2kbasa 3 - 5 unit per 50

uL

s u h ukeberhasilan P C R

• 93 – 95 0C• Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan

menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR

denaturasi

• 30 – 67 0C• Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm

primer yang digunakan untuk proses PCR

annealing

• 72 0Celongasi

b u f f e r P C Rkeberhasilan P C R

high-salt buffer

low-salt buffer

w a k t ukeberhasilan P C R

denaturasi

• 30 – 90 detik

annelaing

• 18 – 22 basa

: 30 detik

• > 22 basa :

60 detik

elongasi

• untuk

mengamplifi

kasi setiap

satu kilo

basa DNA

diperlukan

waktu 30 –

60 detik

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

hot start PCR

touch down PCR

nested

M E N I N G K A T K A N S P E S I F I T A S

h o t s t a r t

Sumber: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1509.html

t o u c h - d o w n

Sumber: http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR

n e s t e d

Sumber: http://www.pcrstation.com/nested-pcr/

If suitable restriction sites are not present within the DNA

sequence to be amplified, then it is possible to incorporate

them during amplification by inclusion of an appropriate

sequence containing a restriction enzyme recognition site at

the ends of the primers when they are synthesized

H A R D C O P I E S

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

h a r d c o p i e s

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press

STANDAR PCR IPCR

amplification

of sequence beTween the primer

annealing sites

amplification of sequences

outside the primers

I N V E R S P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

i n v e r s P C R

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press

R E V E R S E T R A N S C R I P T A S E P C R ( R T P C R )

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

RT PCR is a PCR amplification of a reverse transcription product

RT PCR amplifies very small amounts of any kinds of RNA

(mRNA, rRNA, tRNA etc.)

RT PCR commonly used in molecular biology where a RNA

strand is reverse transcribed into its DNA complement

(complementary DNA, or cDNA) using the enzyme reverse

transcriptase, and the resulting cDNA is amplified using PCR.

i n v e r s P C R

Sumber: http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-transcriptase-polimerase.html

I N S I T U P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

In Situ PCR (ISH) is a polymerase chain reaction

that actually takes place inside the cell on a slide.

Can be performed on fixed tissue or cells.

Factors affecting In Situ PCR sensitivity:

the strandedness of the target molecule

the lack of a complementary sequence proximal to the

target sequences

i n s i t u P C R

sumber: http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/

Q U A N T I T A T I V E P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

Quantitative PCR commonly used to analyze the PCR

amplification of the target gene in a more accurate way, for

example to estimate the abundance of a particular nucleic acid

molecule in a sample.

A fluorescent stain for dsDNA is added to the reaction and

enables us to monitor the number of replicates as the cycle

progresses.

q u a n t i t a t i v e P C R

Sumber: http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html

M U T A G E N E S I S

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

used to engineer specific mutations in the amplified

sequence by constructing a primer that corresponds

to the mutated sequence rather than the original

A S Y M M E T R I C P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

Preferential amplification of one of the strands by

reducing the amount of one of the two primers

Resulting in a preparation of single-stranded DNA,

which has a number of uses in molecular biology

A N C H O R E D P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

Applied to double-stranded DNA fragments for which the

sequence at only one end of the gene is known.

The aim is to attach the region to be amplified to a piece of

known sequence and then to use that as the second priming

site.

a n c h o r e d P C R

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press.

E M U L S I I O N P C R

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

Incorporate all the reagents inside lipid droplets

and carry out PCR on a much smaller scale.

Advantages increase and decrease the

temperature of small droplets very quickly

a n c h o r e d P C R

Sumber: http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.html

I S O T H E R M A L A M P L I F I C A T I O N

m o d i f i k a s i t e k n i k P C R

Allows templates to be amplified at a constant

temperature (typically around 650C).

It uses a DNA polymerase with strand-displacing activity

and avoids the need for heating to high temperatures.

Can be used for detection of pathogens outside of

specialist laboratories, as it is rapid and avoids the need

for expensive PCR machines

R E F E R E N S I . . . • Bruce, B. (Eds.). 1997. Genome Analysis, a laboratory manual. vol

1 (Analyzing DNA). USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.• Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second

Edition. New York: Cambridge University Press.• Innis, M.A.(Eds.). 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and

Applications. California: Academic Press, Inc..• Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific

Publisher.• Richard Williams, Sergio G Peisajovich, Oliver J Miller, Shlomo

Magdassi, Dan S Tawfik, Andrew D Griffiths (2006). "Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR". Nature methods 

• Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

• Watson, J.D., M. Gilman, Witkowski, J., Zohler, M. 1992. Recombinant DNA. USA: Scientific American Books.

• http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1509.html

• http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR

• http://www.pcrstation.com/nested-pcr/• http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/• http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html• http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-

transcriptase-polimerase.html• http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/assignments/projects/borek/

Domina/page9.html• http://www.molecularstation.com/pcr/pcr-site-mutagenesis/• http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.htm• www.Youtube.com• www.biotech.iastate.edu/lab.../plasmid_isolation_analysis.html• http://sciencebiotech.net/yuk-mendesain-primer-dengan-

primer3plus/