ACARA II

PENGUKURAN KONSENTRASI PROTEIN

1. TUJUAN PERCOBAAN

Untuk mengetahui konsentrasi total protein terlarut suatu sampel dengan Metode Bradford.

2. PENDAHULUAN

2.1 Dasar Teori

Protein berasal dari kata protos dari bahasa Yunani yang berarti “yang paling

utama” adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggu yang merupakan

polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan

ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogrn, oksigen, nitrogen,

oksigen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur

fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Pada umumnya sumber protein dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu kelompok potein

hewani dan nabati.

a. Protein hewani

Yang termasuk protein hewani ialah protein yang terdapat dalam hasil ternak, yaitu

daging mamalia, daging unas, telur, susu, dan ikan atau binatang laut. Daging ternak

dewasa, tanpa lemak biasanya mengandung kadar protein 18-20 % dari berat.basah.

b. Protein Nabati

Sayur-sayuran bukan merupakan sumber protein yang baik. Berdasarkan berat basah,

kandungan proteinnya memang rendah.

Protein biji-bijian yang berasal dari beras, jagung dan sorgum stelagh mengalami

pengeringan yang cukup ( 12 %) dapat meliputi 6 sampai 15%. Protein biji-bijian terdapat

di berbagai bagian kulit biji. Di endosperm, protein terdapat dalam bagian yang disebut sub

selulosa granular atau pada bagaian yang disebut badan protein.

Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani.

Tumbuhan membentuk protein dari CO₂H₂O dan senyawa nitrogen. Di samping digunakan

untuk pembentukan sel-sel, protein juga dapat digunakan sebagai energy apabila tubuh kita

kekurangan karbohidrat dan lemak. Komposisi rata-rata unsure kimia yang terdapat dala

protein ialah sebagai berikut: karbon 50%, hydrogen 7%, oksigen 23%, hydrogen 16%,

belerang 0-3%, dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat

dilakukan penentuan kandungann protein dalam suatu bahan makanan.

Molekul monomer dari protein yang mengandung molekul nitrogen yang dikenal

sebagai asam amino. Hanya 20 macam asam amino yang ditemui dalam protein tetapi karena

molekul protein besar dan komplek sering mengandung beberapa ratus asam amino. Sebagai

contoh sel tunggal dari bakteri E. Coli dapat mengandung 600 sampai 800 macam protein

yang berbeda dan pada sel tanaman dan hewan kemungkinan mempunyai beberapa kali

jumlah protein. Pada tanaman konsentrasi tertinggi didapati dalam biji sebesar 40% dari berat

keringnya. Protein dalam bii akan digunakan sebagai energi dalam perkecambahan biji.

Protein larut dalam air, tetapi juga terdapat protein yang terikat pada membran

lipoprotein sehingga yang akan dihitung konsentrasi protein yaitu total protein terlarut, karena

sebagai pelarut atau buffernya adalah air.

Pengujian Bradford adalah sangat cepat dan untuk menentukan konsentrasi protein

dalam sampel. Metode ini telah direkomendasikan untuk penggunaan secara umum,

khususnya dalam penentuan kandungan protein dari fraksi gel atau gel electrophoresis.

Metode ini merupakan prosedur standar dengan sensitivitas antara 20 sampai 200 µg protein.

Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara

kalorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna coomassie Brilliant

Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga

memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kalorimetri

dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada

panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak). Metode ini sangat cepat dan efisien.

Pengikatan protein dengan warna terjadi setelah kira-kira 2 menit dan stabilitas warna selama

1 jam. Tidak terdapat atau hanya sedikit gangguan dari kation seperti potasium atau

karbohidrat seperti sukrosa.

CBB merupakan pewarna yang sering digunakan untuk mengukur kadar protein dengan

spektrofotometer.. pewarna CBB ini sering digunakan karena karakteristiknya, yaitu dapat

berikatan pada ikatan peptida pada protein. Senyawa ini umum digunakan untuk pewarnaan

protein (reagen pada metode Bradford). CBB memiliki nilai absorbansi maksimum pada

panjang gelombang 595 nm ketika berikatan dengan protein. Sementara itu, nilai absorbansi

maksimumnya bila tidak berikatan dengan protein pada larutan buffer sitrat dengan pH 3

adalah panjang gelombang 555 nm.

2.2 Rumusan Masalah

2.2.1 Metode apa yang digunakan dalam percobaan pengukuran konsentrasi

protein?

2.2.2 Bagaimana cara membuat larutan sampel, standar, dan blangko?

2.2.3 Bagaimana cara pengukuran konsentrasi protein?

2.2.4 Berapa nilai regresi yang diperoleh?

3. BAHAN DAN METODE

3.1 Alat dan Bahan

Alat

Tabung Reaksi

Spektrofotometer UV-Vis

Mikropipet

Vortex

Kuvet

Bahan

Aquadest

BSA

Reagen Bradford

Sampel biji jagung

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pembuatan larutan standar

Buat larutan sampel dengan konsentrasi 0,08 M, 0,2M, 0,4M, 0,8M,

Masukkan volume tertentu BSA ke dalam tabung reaksi(sesuai dengan tabel),

tambahkan volume tertentu aquadest(sesuai dengan tabel)

Tambahkan ad 950μl dengan reagen Bradford

Vorteks larutan dalam tabung reaksi ad homogen,diamkan 10 menit

lakukan analisa spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm

Hitung analisa regresinya

tabung Aquadest ¿l) BSA (μl) Bradfoard (μl)

1 50 0 950

2 45 5 950

3 40 10 950

4 30 20 950

5 10 40 950

3.2.2 Pengukuran kandungan protein sampel

Masukkan sampel dalam tabung reaksi dengan konsentrasi sebagai berikut :

(I) sampel 25 µl + aquadest 25 µl + BSA 950 µl lalu vorteks. (II) sampel 50 µl

+ BSA 950 µl lalu divorteks.

Lakukan analisa spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 595nm

Hitung kandungan protein sampel dengan grafik standar BSA dengan

perhitungan kurva regresi linier

4 HASIL PERCOBAAN

4.2 Hasil Percobaan

Setelah dilakukan analisa spektrofotometer didapatkan hasil sebagai berikut

Tabel 1. Pengukuran Absorbansi larutan Standart BSA

NO BSA (μL)

(Y)

ABSORBANSI

(X)

KONSENTRASI

1 2 200 ppm 0,08

2 5 400 ppm 0,2

3 10 600 ppm 0,4

4 20 800 ppm 0,8

dari data diatas, diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95

Tablel 2. Hasil Pengukuran Sampel

Kelompok

25 µl 50µ l

Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3

2 0,829 0,822 0,835 0,932 0,960 -

3 0,807 0,780 0,745 0,813 0,820 0,787

4 0,904 0,932 0,893 1,066 1,024 1,028

5 0,882 0,898 0,833 1,063 1,000 1,031

4.3 Analisis Hasil Percobaan

y = bx + a, dimana y adalah konsentrasi dan x adalah absorbansi

untuk sampel kelompok 2

- 25µl

Replikasi I

y = 18,87 . 0,829 – 3,07

y = 12,57322

Replikasi II

y = 18,87 . 0,822 – 3,07

y = 12,44114

Replikasi III

y = 18,87 . 0,835 – 3,07

y = 12,68645

y rata-rata

= 12,5669

- 50µl

replikasi I

y = 18,87 . 0,932 – 3,07

y = 14,51684

Replikasi II

y = 18,87 . 0,960 – 3,07

y = 15,0452

-

y rata-rata

=

14,78102

untuk sampel kelompok 3

- 25µl

Replikasi I

y = 18,87 . 0,807 – 3,07

y = 12,15809

Replikasi II

y = 18,87 . 0,780 – 3,07

y = 11,6486

Replikasi III

y = 18,87 . 0,745 – 3,07

y = 10,98825

y rata-rata

=

11,59828

- 50µl

Replikasi I

y = 18,87 . 0,813 – 3,07

y = 12,27131

Replikasi II

y = 18,87 . 0,820 – 3,07

y = 12,4034

Replikasi III

y = 18,87 . 0,787 – 3,07

y = 11,78069

y rata-rata

=

12,1521

untuk sampel kelompok 4

- 25µl

Replikasi I

y = 18,87 . 0,904 – 3,07

y = 13,98848

Replikasi II

y = 18,87 . 0,932 – 3,07

y = 14,51684

Replikasi III

y = 18,87 . 0,893 – 3,07

y = 13,78091

y rata-rata

=

14,09541

- 50µl

Replikasi I

y = 18,87 . 1,066 – 3,07

y = 17,04542

Replikasi II

y = 18,87 . 1,024 – 3,07

y = 16,25288

Replikasi III

y = 18,87 . 1,028 – 3,07

y = 16,32836

y rata-rata

=

16,54222

untuk sampel kelompok 5

- 25µl

Replikasi I

y = 18,87 . 0,882 – 3,07

y = 13,57334

Replikasi II

y = 18,87 . 0,898 – 3,07

y = 13,87526

Replikasi III

y = 18,87 . 0,833 – 3,07

y = 12,64871

y rata-rata

=

13,36577

- 50µl

Replikasi I

y = 18,87 . 1,063 – 3,07

y = 16,98881

Replikasi II

y = 18,87 . 1,000 – 3,07

y = 15,8000

Replikasi III

y = 18,87 . 1,031 – 3,07

y = 16,38497

y rata-rata

=

16,39126

0,180 0,502 0,833 1,0960

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Grafik Kurva Standard untuk BSA

absorbansi λ 595 nm

kons

entr

asi B

SA (M

)

5 PEMBAHASAN

Pada praktikum ini, kami akan membahas mengenai pengukuran konsentrasi protein dengan

metode Bradfoard. Pengukuran konsentrasi protein menurut metode Bradfoard adalah

pengukuran protein berdasarkan pada penggunaan Coomassie Briliant Blue (CBB G-260).

Senyawa pewarna ini akan berikatan dengan protein terutama pada residu asam amino

arginin, triptofan, tirosin, histidin dan fenil alanin. Namun perlu diketahui bahwa residu asam

amino arginin yang menentukan ikatan antara CBB G-250 dengan protein. Senyawa ini

dalam keadaan bebas berada dalam bentuk kation yang mempunyai absorbansi maksimum

pada λ 595 nm membentuk warna biru.

Pada praktikum kali ini disiapkan larutan standar sebagai kurva distribusi sampel dan

preparasi sampel. Larutan standar dibuat dengan berbagai konsentrasi perbandingan antara

BSA, Aquadest, dan Bradford sehingga dicapai konsentrasi 0,08 M, 0,2 M, 0,4 M, 0,8M.

Untuk mengetahui konsentrasi total protein terlarut, kami menggunakan sampel biji jagung .

Prosedur Pertama yang kami lakukan adalah memipet 25 µl (sampel I) dan 50 µl (sampel II)

biji jagung yang kemudian ditambah dengan aquadest dan BSA. Lalu divorteks dan kemudian

didiamkan selama 10 menit. Hasil inilah yang kemudian diukur dengan spektrofotometer

untuk mengetahui berapa konsentrasi proteinnya.

Prosedur pengukuran yaitu dilakukan analisis dengan spektrofotometer UV-Vis pada

standart untuk mengetahui sebaran distibusi dari standar sehingga bisa dibuat kurva

distribusinya absorbansinya dan dapat diitung regresi liniernya. Sampel juga dianalisis

dengan spektrofotometer UV-Vis dan dapat diketahui absorbansinya.

Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer didapatkan absorbansi standar dengan

diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95. Kemudian pada pengukuran sampel I(25

µl),didapat nilai konsentrasi terkecil pada kelompok 3 yaitu 11,59828. Hasil ini tergolong

sangat sedikit jika dibandingkan dengan pengukuran konsentrasi protein pada kelompok lain

padahal sampel yang digunakan setiap kelompok sama yaitu biji jagung . Pada kelompok 2,4,

dan 5 masing-masing didapatkan hasil konsentrasi protein sebesar 12,5669 ; 14,09541 dan

13,36577. Selanjutnya, pada pengukuran sampel II (50 µl),didapat nilai konsentrasi terkecil

pada kelompok 3 yaitu 12,1521. Namun pada kelompok 2,4, dan 5 masing-masing didapatkan

hasil konsentrasi protein sebesar 14,78102 ; 16,54222 dan 16,39126.

Adanya perbedaan antara hasil konsentrasi sampel tiap kelompok dapat dipengaruhi

oleh beberapa faktor antara lain :

1. Kesalahan dapat terjadi pada saat preparasi sample, baik

ketidaktepatan dalam mengambil sample.

2. Adanya kontaminan senyawa-senyawa penganggu yang

muncul karena peralatan yang digunakan untuk preparasi sample kurang bersih atau

kurang higienis.

3. Pengukuran spectrometer kurang tepat.

6 KESIMPULAN

1. Menggunakan metode Bradford, yaitu suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein

total dalam suatu larutan.

2. Larutan standar dibuat dengan berbagai konsentrasi perbandingan antara BSA,

Aquadest, dan Bradford sehingga dicapai konsentrasi 0,08 M, 0,2 M , 0,4 M , 0,8 M.

Larutan sampel dibuat dengan sampel biji jagung 25 µl / 50µl + aquadest 25µl / - + BSA

950 µl,kemudian divorteks,diamkan 10 menit lalu di spektro pada λ 595 nm.

3. Prosedur pengukuran yaitu dilakukan analisis dengan spektrofotometer UV-Vis pada

standart untuk mengetahui sebaran distribusi dari standar sehingga bisa dibuat kurva

distribusinya absorbansinya dan dapat diitung regresi liniernya.

4. Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer didapatkan absorbansi standar dengan

diperoleh nilai a = -3,07 ; b= 18.87 ; r = 0,95.

5. Pada pengamatan konsentrasi protein terdapat beberapa perbedaan pada sampel antar

kelompok, perbedaan itu dapat terjadi oleh beberapa faktor diantaranya : Ketidaktepatan

pengambilan sampel, adanya kontaminan, serta pengukuran dangan spektrofotometer

kurang tepat.

7 DAFTAR PUSTAKA

Bradford MM.1976.A Rapid And Sensitive Method For The Quantitation Of

Microorganism Quantities Of Protein In Utilizing The Principle Of Prtotein

Dye-Binding.Anal.Biochem 72:248-254

Day, Jr, R. A., Underwood, A. L. 1989. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.