I

I. PENDAHULUAN

I. 1 Judul Percobaan:

ENUMERASI MIKROBIA PADA MAKANANI.2 Tujuan percobaan:

1. Mahasiswa dapat melakukan enumerasi mikrobia pada susu dan jus tomat dengan menggunakan metode dilution dan plating (Aerobic Plate Count)2. Mahasiswa dapat melakukan deteksi dan enumerasi Coliform pada susu dan jus tomat dengan metode media cair

3. Mahasiswa dapat melakukan deteksi dan enumerasi Salmonella pada susu dan jus tomat dengan metode streak plate4. Mahasiswa dapat melakukan analisis kualitas mikrobiologi pada susu dan jus tomat

II. TINJAUAN PUSTAKA

Susu merupakan sumber protein hewani yang bernilai gizi tinggi karena mengandung zat-zat yang diperlukan tubuh dan mudah dicerna. Susu merupakan medium kompleks yang mengandung lipid, karbohidrat, protein, vitamin,mineral, garam organik maupun anorganik, yang larut atau tidak larut dalam air. Susu didefinisikan sebagai sekresi dari kelenjar susu binatang yang menyusui anaknya. Beberapa bahan seperti karbohidrat, laktosa dan sebagian besar garam dan vitamin dapat larut di dalam air, sedangkan lemak, protein dan kalsium fosfat terdispersi di air dalam bentuk koloidal. Susu mengandung mineral dalam jumlah yang sedikit (trace mineral) sekitar 0,6 % seperti kalsium, fosfor, tembaga dan besi. Komponen lain dari susu yaitu asam sitrat, vitamin dan enzim (Meyer, 1987).

Susu mengandung sekurang-kurangnya 50 macam asam lemak yang berbeda yaitu asam lemak jenuh (miristat, palmitat, dan stearat), asam lemak tidak jenuh oleat, linoleat dan linolenat, dan sekitar 4 % merupakan asam lemak polysaturated. Protein susu terbagi menjadi dua kelompok utama yaitu kasein yang jumlahnya 80 % dari protein susu dan protein whey. Karbohidart utama yang terdapat dalam susu adalah laktosa. Laktosa merupakan disakarida yang terdiri dari glukosa dan galaktosa. Laktosa terdapat dalam dua fase larutan yang sesungguhnya dan mudah diasimilasikan sebagai makanan dengan proses hidrolisis menjadi glukosa dan galaktosa oelh enzim -galaktosidase (Buckle et all, 1987).

Bakteri yang umum terdapat dalam air susu adalah dari suku Lactobacillaceae dan Streptococcaceae. Bakteri lain yang biasnya terdapat dalam air susu mentah (tidak dipasteurisasi) meliputi anggota marga-marga Micrococcus, Pseudomonas, Staphylococcus dan Bacillus. Di samping itu, E. coli sering dijumpai, tetapi organisme ini sepenuhnya tidak dikehendaki, dan berapa jauh kehadirannya adalah bersangkutan langsung dengan kondisi kebersihan produk air susu (Volk dan Wheeler, 1990).Menurut Sherrington dan Gaman (1994), komposisi susu dapat dilihat dlam tabel sebagai berikut :

KomponenKadar (%)

Protein3,3

Lemak3,8

Karbohidrat4,7

Air87,6

Vitamin dan mineral0,7

Susu harus bebas dari bakteri, oleh karena itu perlu dilakukan uji pada susu. Metode bakteriologik tidak praktis dalam menguji adanya bakteri patogen dalam susu. Susu dapat diuji dengan fosfat negatif dan uji negatif terhadap biru metilen. Fosfatase adalah suatu enzim yang sedikit lebih tahan terhadap panas daripada bakteri Mycobacterium tuberculosis, karena itu perlakuan yang merusak enzim juga pasti merusak atau mematikan bakteri patogen. Biru metilen adalah suatu jenis zat warna yang berwarna biru dalam bentuk teroksidasi. Jika jumlah bakteri dalam susu cukup banyak, zat warna tersebut direduksi menjadi bentuk tidak berwarna yang berarti memberikan hasil uji positif (Sherrington dan Gaman, 1994).

Jus tomat segar sangat membantu pembentukan glycogen dalam liver. Menurut penelitian ditemukan bahwa jus tomat menyeimbangkan fungsi liver dengan cepat dan dengan demikian berarti menjaga stamina tubuh dan menyehatkan badan. Garam mineral yang kaya dalam tomat meningkatkan nafsu makan dan merangsang aliran air liur sehingga memungkinkan makanan dicerna dengan baik. Konsumsi tomat yang teratur membantu mengobati penyakit anoreksia (kehilangan nafsu makan) (Anonim a, 2008).Jus tomat bermanfaat : Untuk menguruskan badan; kesehatan pria. Jus untuk menguruskan ini hanya mengandung 50 kalori/250 ml. Jus tersebut juga mengandung bioflavonoid yang membantu memperkuat pembuluh darah kapiler, jadi tidak menimbulkan kebocoran pada pembuluh darah dan pembentukan kantong yang mengandung air pada kulit yang menyebabkan selulit. Dan kandungan likopen dalam tomat telah dikaitkan dengan penurunan resiko terjadinya kanker prostat. Tetapi penggunaannya sebaiknya dihindari pada individu dengan tekanan darah tinggi, karena jus tomat mengandung kadar garam yang tinggi (Anonim b, 2004).Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang ditentukan. Jenis populasi mikrobia dalam tanah, air, bahan makanan dan lain-lain berbeda-beda tergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara perhitungan jumlah mikrobia perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method) (Jutono dkk, 1980).

Perhitungan mikrobia secara tidak langsung, dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup atau hanya menentukan jumlah mikrobia yang hidup saja. Untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup dapat dilakukan setelah suspensi bahan atau biakan mikrobia diencerkan beberapa kali dan ditumbuhkan dalam medium dengan cara tertentu tergantung dari macamnya bahan dan sifat mikrobianya. Salah satunya adalah dengan menghitung jumlah koloni (Plate count). Cara plate count ini yang paling umum digunakan untuk perhitugnan jumlah mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10 (Dwidjoseputro, 1990).Perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung digunakan metode plate count, yakni hanya sel yang hidup yang dihitung dalam metode ini. Prinsipnya yaitu pengenceran dalam tiap konsentrasi diinokulasikan dalam medium agar dipetri dengan cara spread. Syarat-syarat yang harus dipenuhi dalam penghitungan dengan menggunakan metode ini adalah jumlah koloni 30-300 koloni, tidak ada spreader, perbandingan jumlah bakteri hasil pengenceran antara pengenceran yang lebih besar dan pengenceran sebelumnya jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia hasil pengenceran sebelumnya. Perhitungan jumlah bakteri ini digunakan pengenceran 10-3,10-4,10-5,10-6 untuk membandingkan jumlah koloni dari tiap konsentrasi pengenceran sehingga dengan mengikuti perhitungan dan persyaratan plate count akan didapatkan jumlah bakteri yang ada (Dwidjoseputro, 1990).Penggunaan media selektif dan diferensial sangat membantu mempercepat usaha pemeriksaan air guna mendeteksi organisme koliform. Pemerikasaan tersebut terdiri dari 3 langkah yaitu uji pendugaan (persumtive test), uji yang diperkuat (confirmed test), uji lengkap (completed test) (Pelczar dan Chan, 1988).

Uji penduga dilakukan dengan menginokulasikan contoh air pada media laktosa dan diinkubasi selama 48 jam dengan menggunakan tabung durham. Gas yang tertampung mungkin berasal dari mikroorganisme lain sehingga untuk meyakinkan hasil test pendugaan perlu diadakan uji penetapan (Dwidjoseputro, 1990).

Uji penetapan atau juga dengan uji penguat dilakuakn denga cara menginokulasikan sampel yang positif pada uji penduga pada media agar cawan eusin methylen blue dengan cara goresan dan kemudian diinkubasi selama 48 jam. Test ini dinyatakan positif jika tubuh koloni-koloni berwarna hijau mengkilap

(Fardiaz, 1989 )

Uji lengkap dilakukan dengan cara menginokulasikan bakteri dari koloni hijau metalik pada medium laktosa cair dan medium agar miring yang diinkubasi selama 48 jam. Koloni yang menunjukkan reaksi pewarnaan gram negatif berbentuk batang dan membentuk gas didalam laktosa merupakan uji lengkap adanya koloni koloform (Fardiaz, 1989).

Uji Salmonella di dalam makanan dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu :1. enrichment menggunakan media enrichment

2. seleksi menggunakan media selektif, dan

3. identifikasi

(Supardi dan Sukamto, 1999)

Media yang spesifik untuk Salmonella mengandung komponen-komponen seperti pepton atau protein hidrosilat, ekstrak daging sapi atau ekstrak khamir, dan garam yang ditambahkan dengan tujuan untuk mempertahankan daya isotoniknya maupun sebagai buffer. Salmonella biasnya terdapat dalam jumlah kecil di dalam makanan. Oleh karena itu, perlu dilakukan tahap preenrichment; dan enrichment menggunakan Lactose Broth, Selenite Cystine Broth atau Tetrathionate Broth. Media enrichment juga dapat digunakan untuk menghitung MPN Salmonella. Akan tetapi, karena pertumbuhannya di dalam media cair tidak dapat dibedakan dari bakteri-bakteri lainnya, perlu untuk menggoreskan setiap tabung MPN yang positif pada media selektif, yaitu Brilliant Green (BG) agar, Bismuth Sulfit (BS) agar, atau Salmonella-Shigella (SS) agar. Pada agar SS koloni Salmonella mungkin tidak berwarna atau berwarna coklat muda, merah muda, atau kekuningan dan transparan, mungkin tengahnya berwarna hitam (Supardi dan Sukamto, 1999).Medium Plate Count Agar terdiri dari Tryptone 5 g, Yeast extract 22.5 g, Dextrose 1 g, Agar 15 g, Aquades 1 l. Panaskan seluruh bahan tersebut hingga mendidih. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121C. Media tersedia secara komersial (Anonim c, 2006).Pembuatan Brilliant green Lactose Bile Broth : Peptone 10 g, Lactose 10 g, Oxgall 20 g, Brilliant green 0,0133 g, Aquades 1 liter. Larutkan Peptone dan Lactose dalam 500 ml Aquades. Tambahkan 20 gram Oxgall dalam 200 ml Aquades. Atur pH 7,0-7,5. Aduk dan tambahkan Aquades hingga 975 ml. Atur pH 7,4 tambahkan 13,3 ml 0,1 % Brilliant green. Tepatkan hingga 1 liter. Pipet ke dalam tabung yang berisi tabung durham. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. Media ini tersedia secara komersial (Anonim d, 2006).Pembuatan Levines Eosin Methylen Blue (L-EMB) agar : Peptone 10 g, Lactose 10 g, KH2 PO4 2 g, Bacto agar 15 g, Eosin 0,4 g, Methylen blue 0,065 g, Aquades 1 liter. Aduk hingga larut Peptone, KH2 PO4 dan agar kedalam 1 liter Aquades. Ambil 100 ml atau 200 ml campuran tertsebut dan sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. Sebelum digunakan lelehkan masing-masing 100 ml dan tambahkan 5 ml larutan steril Lactose 20 % dan 2 ml larutan eosin 2 % serta 4,3 ml larutan methylene blue 0,15 %, didihkan kembali hingga 1 liter. Ambil 100 ml atau 200 ml dan sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. Media ini tersedia secara komersial (Anonim d, 2006).Pembuatan Lactose Broth : Beef extract 3 g, Peptone 5 g, Lactose 5 g, Aquadest 1 liter. Larutkan semua bahan dan sterilisasi pada suhu 121C 15 menit. pH akhir 6,9 0.2 (Anonim e, 2006). Pembuatan Selenite Cystine Broth :Tryptone atau PolyPeptone 5 g, Lactose 4 g, Sodium acid selenite (NaHSo4) 4 g, Na2HPO4 10 g, L Cystine 0,01 g, Aquadest 1 liter. Panaskan sampai mendidih agar melarut. Tuang sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi. steril. Panaskan 10 menit dalam uap panas. Jangan di Autoclave. pH akhir 7,0 0,2. Media ini tidak steril. Gunakan pada hari yang sama (Anonim e, 2006).III. METODE

III.1 Alat dan bahan

Alat:

1. Tabung reaksi2. Mikropipet

3. Tip

4. Laminair flow

5. Inkubator

6. Cawan petri

7. Trigalski

8. Vortex

9. Handcounter

10. Tabung durham

11. Bunsen

12. Ose

13. Gelas beker

14. Pipet ukur

15. Propipet

16. Label

17. Masker

18. kertas kopi

19. karet20. erlenmeyerBahan:

1. Susu

2. Jus tomat

3. Media Plate Count Agar (PCA)

4. Media Brilliant Green Lactosa Bile (BGLB)

5. Media Eosin Methylen Blue Agar (BGLB)

6. Media Selenite Cystine Broth (SCB)

7. Media Salmonella-Shigela Agar (SSA)8. Alkohol

9. Kapas

10. Aquades

11. Tissue

III.2 Cara Kerjaa. Uji APC (Aerobik Plate Count)Sampel (jus tomat dan susu) dihomogenkan dengan vortex kemudian diencerkan dari konsentrasi tinggi ke rendah yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Sampel pada pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5 dihomogenkan dan diplating ke medium Plate Count Agar dengan metode spread plate, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni diamati dan dihitung.b. Uji ColiformSampel (jus tomat dan susu) dihomogenkan dengan vortex kemudian diencerkan 10-1, 10-2, 10-3. Sampel hasil pengenceran dihomogenkan dan di inokulasikan ke medium BGLB (Brilliant Green Lactose Bile) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni diamati (hasil positif bila terdapat gelembung gas, warna keruh, dan ada endapan). Bila hasil positif, koloni bakteri pada medium BGLB diinokulasikan ke dalam medium Eosin Methylen Blue Agar dengan metode streak plate, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni diamati (hasil positif ditunjukkan dengan adanya koloni berwarna hijau metalik) dan bila postif dihitung jumlahnya. c. Uji SalmonellaSampel (jus tomat dan susu) dihomogenkan dengan vortex kemudian diambil sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam Lactosa Broth kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, sampel dalam medium Lactosa Broth diambil sebanyak 5 ml lalu diinokulasikan ke dalam medium Selenite Cystine Broth dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni diambil dan diinokulasikan ke dalam medium Salmonella Shigella Agar dengan metode streak plate kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, koloni yang positif (hasil positif ditunjukkan dengan koloni transparan bagian tengah berwarna hitam) diamati adn dihitung jumlahnya.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

a. HasilTabel 1. Uji APC (Aerobic Plate Count)PengenceranProduk Minuman

Susu NasionalJus Tomat

1212

10-386Spreader48

10-43398SpreaderSpreader

10-500Spreader19

Tabel 2. Uji ColiformProduk MinumanPengenceranMedium% positif cemaran Coliform

BGLBEMBA

Susu Nasional10-1++3/3 x 100% =

100 %

10-2++

10-3++

Jus Tomat10-1++2/3 x 100 % = 67,7 %

10-2++

10-3+-

Tabel 3. Uji SalmonellaProduk minumanKoloniHasil

Susu nasionalbulat, transparan, ada titik hitam di tengah+

Jus tomatpink-

b. Pembahasan

Mikrobia yang ada pada bahan pangan dapat berasal dari sumber internal dan eksternal. Sumber internal adalah mikrobia yang secara alami terdapat di dalam bahan pangan itu sendiri, sedangkan sumber eksternal adalah segala sesuatu yang kontak dengan bahan pangan atau makanan dari proses penanganan, produksi, sampai pada saat makanan itu dikonsumsi.Mikrobia pada makanan dapat berperan sebagai mikrobia pembusuk atau mikrobia patogen. Kelompok bakteri berbentuk batang, gram negatif, psikotropik aerob (misalnya Pseudomonas spp.) adalah mikrobia pembusuk utama pada daging dan susu segar. E. coli strain tertentu dikenal sebagai mikrobia patogen dari kelompok coliform.Keberadaan mikrobia (tipe dan jumlahnya) pada makanan dapat diketahui dengan uji mikrobiologi. Hasil uji mikrobiologi pada makanan sering digunakan sebagai indikator prosedur sanitasi selama penanganan dan pengolahan, keamanan, umur simpan, dan stabilitas produk. Pada praktikum kali ini, dilakukan uji mikrobiologi dan menghitung jumlah bekteri yang terdapat pada susu dan jus tomat. Perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung dengan rumus :

a. jumlah koloni 30-300 :N=

C__________ (1 x n1) + (0,1 x n2) x dKeterangan:N= jumlah koloni setiap ml atau setiap gram contoh

C= total koloni dari seluruh cawan yang dihitung

n1= jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung

n2= jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung

d= pengenceran pertama yang dihitung

b. jumlah koloni