ABSTRAK

Para Triase ™ Panel Obat Penyalahgunaan (DOA) dievaluasi untuk mendeteksi phencylidine (PCP), amfetamin (AMPH), opiat (OPI), tetrahydrocannabinol (THC), benzoylecgonine kokain metabolit (BE), dan barbiturat (BARB) di urin. Pengujian ini dibandingkan dengan Syva EMIT Perbandingan dilakukan pada 606 sampel positif dan 325 negatif. Ketika ada volume yang cukup dari sampel yang tersedia untuk pengujian ulang, sampel positif dan negatif dengan hasil sumbang antara kedua tes skrining dikonfirmasi oleh gas kromatografi kuantitatif / spektrometri massa (GC / MS). Perjanjian persen antara kedua tes untuk sampel positif berkisar 93 sampai 100%. Untuk sampel negatif, perjanjian tersebut berkisar 95-100%. Untuk AMPH, 19 dari 27 sampel sumbang urin yang positif untuk Keluarkan dan negatif untuk Triage DOA terkandung amfetamin total dan konsentrasi metamfetamin kurang dari 1000 ng / mL dengan GC / MS. Untuk THC, tujuh sampel urin yang negatif untuk DOA Triase dan positif untuk keluarkan terkandung 9-karboksi konsentrasi THC pada lebih besar dari 15 ng / mL dengan GC / MS. Untuk BARB, tiga sampel yang negatif untuk DOA Triase dan positif untuk keluarkan mengandung barbiturat tingkat lebih besar dari 300 ng / mL. Dua dari tiga sampel mengandung fenobarbital di bawah konsentrasi yang menghasilkan hasil positif untuk DOA Triase. Bagi sebagian besar sampel urin dipelajari, namun, DOA Triase menghasilkan hasil yang identik dengan immunosssay komersial instrumen berbasis.

Introduction

Berbagai metode yang tersedia untuk skrining penyalahgunaan obat dalam urin, termasuk radioimmunoassay (RIA) (misalnya roche abuscreen, Nutley, nj) enzim immunoassay (misalnya syva EMIT palo alto, CA), dan immunoassay polarisasi fluoresensi (misalnya Abbott TDx, Abbott Park , IL) (1-4). Pengujian ini memerlukan instrumen seperti counter gamma untuk RIA dan analisis seperti ETS, ADX atau Cobas Mira untuk analisis isotop non. Baru-baru ini, tes yang lebih baru telah dikembangkan yang memungkinkan deteksi visual dari label dan karenanya tidak memerlukan instrumentasi apapun. Contoh dari tes termasuk pada trak uji (roche), yang didasarkan pada aglutinasi lateks dan accu-sejumput (hycor biomedis, taman Grove CA), yang didasarkan pada immunoassay enzim. Pengujian ini adalah cepat dan dirancang untuk pengujian segera atau darurat dari golongan obat yang dipilih untuk puposes toksikologi klinis. Hanya satu kelas obat namun dapat dianalisis per perangkat, membatasi utilitas untuk penyaringan cepat.

Panel triase untuk penyalahgunaan obat (DOA) (biosite diagnostik, san diego CA) adalah multi-tes skrining panel yang dirancang untuk memberikan deteksi visual simultan dan diskrit dari tujuh golongan obat di kurang lebih sepuluh menit (6). Lima dari kelas-kelas ini tercatat oleh departemen pelayanan kesehatan dan manusia (DHHS) untuk pengujian tempat kerja obat: kokain metabolit, benzoylecgonine (BE) opiat (OPI), amfetamin (AMPH), tetrahydrocannabiol (THC) dan phencyclidine (PCP). Theother dua kelas, barbiturat (BARB) dan benzodiasepins, saat ini tidak terdaftar di panduan ini. Uji ini dikonfigurasi untuk memenuhi celana skrining saat DHHS (300, 300, 1000, 100 dan 25 ng / ml). Para celana barbiturat dan bonzodiasepin masing-masing tetap sebesar 300 ng / ml.

Menggunakan sampel urin klinis, akurasi analisis untuk enam dari assaysbon ini dengan DOA triase dievaluasi terhadap uji EMIT Perbandingan hasil untuk benzodiazepin dilakukan di bawah kriteria yang berbeda dan hasilnya akan dilaporkan secara terpisah. Sampel positif dan mereka dengan hasil yang sumbang antara dua metode skrining dikonfirmasi oleh gas kromatografi kuantitatif / spektrometri massa (GC / MS) dengan perangkap ion dan analisa quadrupole.

EKSPERIMEN

Sampel urin diperoleh dari beberapa sumber dan diuji untuk PCP dan AMPH di Hermann rumah sakit, untuk OPI dan THC di institut Nichols untuk pengujian penyalahgunaan zat dan untuk BE dan BARB di Johns Hopkins Hospital. Urine spesimen dari pasien rumah sakit sebagian besar dikumpulkan untuk tujuan toksikologi klinis, sedangkan yang diperoleh dari laboratorium referensi adalah tempat kerja untuk pengujian obat. Menggunakan DOA triase, kita diuji sebanyak 95 sampel OPI, 100 masing-masing PCP, THC, BE, dan sampel BARB, dan 111 sampel AMPH yang positif menggunakan memancarkan. Juga diuji adalah 100 masing-masing OPI, THC, BE dan sampel BARB dan 125 PCP dan sampel AMPH yang negatif menggunakan memancarkan. Sampel dikumpulkan tanpa bahan pengawet dan disimpan baik di 40C jika diuji dalam beberapa hari atau di-200C jika penyimpanan jangka panjang diperlukan sebelum analisis. Urine mengandung THC spesimen diuji prospektif menggunakan kedua Keluarkan dan DOA triase karena contoh THC bisa kehilangan 60-100% dari konsentrasi THC mereka ketika disimpan dalam botol plastik.

ASSAY

Spesimen urin pada awalnya diskrining dengan EMIT D.A.U Keluarkan (untuk AMPH, OPI, THC, BE dan BARB) baik menggunakan ETS (Syva) atau Hitachi 717 analyzer (Boehringer Mannheim Diagnostik, Indianapolis, IN) untuk PCP memancarkan 700 assay digunakan. Sebuah cutoff dari 25 ng / mL untuk PCP digunakan untuk kedua pemeriksaan dan konfirmasi. Antibodi monoklonal EMIT uji digunakan untuk skrining amfetamin. Cutoff 1000 dan 500 ng / mL digunakan untuk penyaringan dan konfirmasi, masing-masing. Untuk OPI dan BARB, cutoff dari 300 ng / mL digunakan untuk kedua pemeriksaan dan konfirmasi. Untuk BE, pemutaran dan cutoff konfirmasi adalah 300 dan 150 ng / mL masing-masing. Rekomendasi dari produsen untuk kedua DOA Triase dan memancarkan diikuti seluruh.

DOA Triase menggunakan teknik immunochemical yang dikenal sebagai ASCENDTM Multimmunoassy. Representasi skematik dari proses ini ditunjukkan pada Gambar 1. Sistem antibodi monoklonal secara bersamaan menganalisis beberapa analisis dalam mode mengikat kompetitif, menggunakan reaksi solusi fase diikuti dengan reaksi padat-fase. Reaksi solusi-fase menggabungkan ada manik-manik reagen pra-ditiadakan (masing-masing untuk konjugat obat antibodi, dan buffer) yang dilarutkan dengan penambahan spesimen urin dengan reaksi juga. Antibodi manik mengandung antibodi monoklonal untuk tujuh golongan obat yang ditargetkan. Manik-manik konjugasi berisi obat perwakilan dari setiap kelas yang terkonjugasi ke partikel koloid emas (Gambar 1a). Ketika sampel air seni bebas narkoba ditambahkan ke manik-manik, semua antibodi akan berikatan dengan konjugat obat, meninggalkan pada obat terkonjugasi terbuka. Jika sampel urin mengandung satu atau lebih obat pada konsentrasi di atas batas

ambang, antibodi tersebut akan mengikat kedua terkonjugasi dan obat bebas (Gambar 1b), meninggalkan beberapa obat konjugasi terikat pada antibodi

Setelah inkubasi 10-menit, campuran reaksi dipindahkan ke daerah deteksi yang berisi membran nilon dengan antibodi monoklonal bergerak di tujuh zona deteksi diskrit. Dari campuran reaksi tunggal, beberapa obat yang terdeteksi ketika mereka diterapkan ke daerah deteksi. Sampel yang tidak memiliki konjugat obat terpapar (sampel negatif) melewati membran dan tidak berikatan dengan antibodi monoklonal amobil pada membran. Sampel yang telah terkena konjugat obat (sampel positif) ditangkap oleh antibodi amobil kedua, menghasilkan warna kulit yang berbeda pada zona yang sesuai untuk setiap obat positif (1d Gambar). Setelah solusi mencuci telah melewati membran, kehadiran bar warna dibaca secara visual. Sampel hanya pada atau di atas tingkat cutoff menghasilkan respon warna terdeteksi; sampel dianggap positif selama built-in "tes yang valid" bar warna muncul dan bar warna tidak ada dalam zona "tes tidak valid". Rancangan Perawatan Kesehatan Keuangan Administrasi (HCFA) pedoman untuk laboratorium pemeriksa telah mengindikasikan bahwa instrumen atau prosedur pemeriksaan kontrol mungkin untuk digunakan untuk memenuhi persyaratan untuk pengujian kontrol negatif dan positif setiap hari. Namun demikian, bahan kontrol eksternal kualitas (Hycor Biomedis, Garden Grove, CA) juga dijalankan pada tiga tingkat (biasanya, ada 20 sampel).

Semua sampel positif dikonfirmasi dengan kuantitatif GC / MS. Metode analitis untuk AMPH dan PCP digambarkan sebelumnya menggunakan ITS40 ion perangkap MS (Finnigan, san Jose, CA) (9) dalam modus full scan. Sampel AMPH adalah diderivatisasi dengan anhidrida heptafluorobutyric. Untuk analit lain, quadrupole MSD analyzer (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) digunakan dalam modus pemantauan ion yang dipilih. OPI adalah diderivatisasi dengan anhidrida asetat, THC dengan methyliodide, dan BE dengan iodopropane. PCP dan BRAB diuji underivatized

EVALUASI

Ketepatan setiap tes pada DOA Triase dinilai dengan pengujian ulangan dari 10 sampel urin kosong dibubuhi pada konsentrasi yang braket cutoff. Urine konsentrasi PCP yang bervariasi dari 20 sampai 30 ng / mL dalam interval 2.5-ng/mL, konsentrasi AMPH bervariasi 800-1200 ng / mL dalam interval 100-ng/mL, konsentrasi THC bervariasi 80-120 ng / mL dalam interval 10-ng/mL, dan OPI, BE, dan konsentrasi BARB bervariasi 240-360 ng / mL dalam interval 30-ng/mL. Sebuah BE konsentrasi 150 ng / mL juga diuji. Perjanjian hasil antara DOA Triase dan memancarkan juga dipelajari di total 1256 sampel urin positif dan negatif.

RESULTS

Hasil pengujian ketepatan pada DOA Triase ditunjukkan pada Tabel I. PCP, AMPH, THC, BE dan tes BARB menghasilkan hasil positif 100% dari waktu ketika diuji pada konsentrasi cutoff. OPI menghasilkan hasil positif 70% dari waktu ketika diuji pada konsentrasi cutoff. PCP, AMPH, OPI

dan BARB diuji menghasilkan hasil negatif saat diuji menggunakan benda uji kontrol yang berisi obat pada 80% dari konsentrasi cutoff, sedangkan THC dan BE tes menghasilkan hasil positif 80% dan 100% dari waktu, repectively.

Tabel II meringkas perjanjian antara DOA triase sebuah memancarkan. Untuk PCP dan BE, menyelesaikan perjanjian untuk semua sampel positif dan negatif diamati. GC / MS hasil untuk sampel PCP positif berkisar 30-1487 ng / mL, sedangkan sampel BE positif berkisar 310 sampai 170.000 ng / mL. Tak satu pun dari sampel negatif diuji dengan GC / MS

Perbedaan yang cukup terlihat antara kedua tes skrining untuk AMPH, seperti yang dirangkum dalam tabel II. Sebanyak 31 dari 236 sampel positif dan negatif diuji untuk AMPH ditunjukkan perbedaan antara DOA triase dan EMIT. Ada urin cukup untuk GC / MS konfirmasi di empat dari sampel ini. Dalam 24 dari 27 yang tersisa, dikombinasikan konsentrasi amfetamin dan metamfetamin dengan GC / MS kurang dari nilai 1000 ng / ml cutoff digunakan untuk screening (kisaran 0-924 ng / mL). 19 keluar dari ini 24 spesimen (kelompok 1, tabel III) adalah positif dan negatif menggunakan Keluarkan menggunakan triase DOA, dua (kelompok 2) adalah negatif dan positif Keluarkan oleh triase DOA dan tiga (kelompok 3) yang positif menggunakan kedua tes. Obat struktural terkait lainnya seperti amina simpatomimetik yang telah hadir dalam urines Namun, analisis GC / MS tidak ditargetkan untuk mendeteksi keberadaan obat ini.Sisa tiga urines dari 31 sampel discordant (group4) memiliki hasil amfetamin total dengan GC / MS yang lebih besar dari 100 ng / ml cutoff skrining (kisaran 1026-2133 ng / ml). masing-masing positif dan negatif menggunakan Keluarkan menggunakan DOA triase. GC / MS dilakukan pada sampel 3 kelompok ini mengikuti derivatisasi kiral (10). Sampel ini terkandung tinggi L-metamfetamin konsentrasi. Ini L-isomer yang hadir dalam beberapa antihistamin tersedia secara komersial (misalnya Vicks inhaler) (11) dan tidak tercantum dalam daftar zat yang dikendalikan penegakan obat badan. Jadi, untuk sampel ini, triase DOA benar menunjukkan bahwa hasil untuk D-isomer dari amfetamin berada di bawah cutoff 100 ng / ml, sedangkan Keluarkan dan GC / MS (menggunakan derivatisasi konvensional) menghasilkan hasil yang menunjukkan bahwa isomer lebih besar dari cutoff ini. Pengamatan ini kemudian didukung oleh manufaktur klaim bahwa L-amphetamine dan L-metamfetamin tidak bereaksi dalam ujian di 10000 dan 32000 ng / ml

Perbandingan antara EMIT dan DOA triase untuk OPI menunjukkan perjanjian yang baik antara dua metode. Semua sampel positif oleh EMIT, mulai 349-104940 ng / ml, juga positif menggunakan DOA triase. Dalam tiga dari sampel, hasil GC / MS untuk kodein dan morfin adalah di bawah 300 ng / ml cutoff skrining. GC / MS analisis mengungkapkan adanya hydrocodone di tempat lain (tabel IV).

Untuk THC, perbandingan EMIT dan DOA triase dihasilkan 100% perjanjian di antara sampel negatif dan perjanjian 93% di antara sampel positif berkisar 18-1486 ng / ml. untuk tujuh sampel positif oleh EMIT dan negatif dengan triase DOA, semua memiliki konsentrasi GC / MS yang berada di atas cutoff 15 ng / ml untuk 9-THC karboksi metabolit dengan GC / MS meskipun, hanya satu lebih besar dari cutoff triase DOA 100 ng / ml untuk metabolit THC total. Hasil antara tes skrining mungkin memiliki reaktivitas variabel untuk metabolit THC banyak, sedangkan uji konfirmasi diarahkan pada asam 11-atau-A9-THC-9-karboksilat metabolit. Ini

sampel tujuh juga diuji pada ADX Abbott (utara Chicago, iL) dan juga ditemukan negatif pada konsentrasi cutoff dari 100 ng / ml (data tidak disajikan)Perbandingan EMIT dan DOA triase untuk barbiturat juga menunjukkan 100%% kesepakatan antara sampel negatif dan perjanjian 97% di antara sampel positif mulai dari 330 untuk lebih besar dari 1200 ng / ml. seperti yang ditunjukkan dalam tabel IV, dua dari hasil discordant adalah urin sampel dikonfirmasi dengan GC / MS mengandung 370 dan 400 ng / ml Phenobarbital. Konsentrasi cutoff dari 300 ng / ml untuk uji triase DOA barbiturat telah disesuaikan untuk peka terhadap secobarbital. Itu eksperimen ditentukan bahwa fenobarbital hanya akan mulai menghasilkan hasil positif ketika konsentrasi melebihi 700 ng / ml. sampel ketiga diuji ulang menggunakan TDx dan yang terkandung obat tidur reaktivitas yang lebih besar dari 1200 ng / ml series, yang tidak terdeteksi oleh DOA triase. Spesimen urin cukup tetap untuk resolusi dari hasil sumbang.