a critical role of heat shock cognate protein 70 in apoptin
DESCRIPTION
A critical role of heat shock cognate protein 70 in ApoptinTRANSCRIPT
BAB III ISI
Sebagian besar penelitian mengenai protein apoptin, dalam pemisahan atau purifikasi apoptinnya
menggunakan metode immunoprecipitation. Selain itu, metode yang digunakan adalah affinity
chromatography dan knockdown. Berikut akan dijelaskan menganai ketiga metode tersebut
berdasarkan prinsip atau teori yang telah ada. Selanjutnya, masing-masing metode akan dijelaskan
protokol dan bahan yang digunakan pada aplikasi dalam penelitian-penelitian yang telah dilakukan.
Immunopresipitation
Sebagai gambaran prinsip dari immunopresipitation, berikut merupakan ilustrasi yang akan
dijelaskan. Misalkan ada campuran protein, protein a dan b. Immunoprecipitation menggunakan
antibody melawan protein a. Maka akan didapatkan protein b, yang kemudian di analisis
menggunakan gel elektroporesis.
Protein a dan b akan bereaksi membentuk komlplek protein dan ditambahkan antibody yang melawan
protein a. Kemudian menambahkan protein A atau protein G sepharose untuk menangkap semua
kompleks (protein a+protein b+antibody). Kemudian, menghilangkan impuriti dengan larutan.
Kemudian mengelusi interaksi komplek, ikatan protein a dan protein b. Menganalisis protein yang
telah terelusi menggunakan gel elektroporesis. Protein b dideteksi dengan analisis western blot.
Penjelasan diatas meerupakan proses immunopresipitation secara sederhana. Pada penelitian, prinsip
pemisahan tersebut biasanya dilakukan dengan tahap-tahap yang umum seperti:
1. Melisis cell yang didalamnya mengandung protein yang akan dipisahkan menggunakan buffer
2. Men-sentrifuge lysate dan memisahkan supernatant
3. Mengambil supernatant yang kemudian ditambah dengan antibody
4. Melakukan immunopresipitation
Immunopresipitation dilakukan dengan mereaksikan protein yang kita inginkan dengan
protein lain, kemudian menambahkan antibody, menambahkan protein A/G dengan
segharose, membasuh dengan buffer lain.
5. Setelah di-immunopresipitation, kemudian dilakukan SDS-PAGE
6. Analisis terkahir menggunakan western blot
Ada lima jenis immunoprecipitation yaitu: Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein
complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (Chip), RNA
immunoprecipitation (RIP), dan Tagged protein. Pada makalah ini, penulis hanya akan menjelaskan
tiga diantaranya yaitu IP, Co-IP dan Tagged protein.
Individual protein immunoprecipitation (IP) secara tradisional mengisolasi protein tunggal.
Menggunakan satu antibody yang spesifik terhadap satu protein yang telah diketahui. IP dilakukan
untuk memisahkan protein dari sel yang telah dilisis (cell lysate) sehingga dapat diketahui identitas,
struktur, ekspresi, aktivitas atau modifikasi dari sebuah protein. IP juga digunakan untuk mempelajari
interaksi protein yang diinginkan dengan protein lain atau asam nukleat.
Co-immunoprecipitation (Co-IP), cara kerja dari metode ini hampir sama dengan IP, namun protein
yang terpisahkan adalah protein kompleks. Pada sebuah larutan yang terdapat protein yang ingin kita
pisahkan, kedalamnya kita beri antibody yang mengenali salah satu protein yang telah diketahui.
Protein tersebut merupakan protein yang berikatan dengan protein-protein lain pada suatu kompleks
protein. Ketika sebuah antibody mengenali salah satu dari protein tersebut, maka atibody akan
menarik semua protein kompleks sehingga protein-protein yang belum diketahui yang terikat bersama
protein yang dikenali antibody juga akan ikut tertarik dan terpisah.
Hal diatas akan dapat terjadi jika protein kompleks saling berikatan dengan kuat. Co-IP ini selain
digunakan untuk pemisahan protein juga digunakan untuk mempelajari interaksi protein dengan
protein.
Pada gambar 1. Larutan berisi protein kompleks dan protein-protein lain atau molekul-molekul lain
sebagai kontaminan. Kemudian ditambahkan antibody yang mengenali salah satu protein (warna biru
muda) dalam protein kompleks. Larutan selanjutnya ditambahkan protein A atau G atau dapat pula
berupa magnetic beads yang ukuran molekulnya lebih besar untuk menangkap antibody beserta
protein kompleks sehingga terbawa ke bawah ketika dilakukan sentrifugasi (presipitasi). Setelah
terendap, endapan yang ternyata merupakan campuran protein yang diinginkan diambil dan kemudian
dianalisis dengan SDS-PAGE dan western blot.
Gambar 1.Proses Co-IP dalam campuran yang mngandung protein yang diinginkanSumber: www.leinco.com/immunoprecipitation
Tagged Protein digunakan jika antibody untuk mengikat protein yang ingin dipisahkan tidak tersedia.
Para enggineer membuat tag untuk digunakan sebagai umpan yang digunakan untuk menggantikan
fungsi dari antibody. Tag-ta ini akan mengikat protein yang diingikan pada C-terminal dan N-
terminal. Keuntungan menggunakan tag adalah dapat diguakan pada banyak jenis protein dan dapat
digunakan bersama antibody untuk menambah afinitas pengikatan protein. Namun, kekurangannya
adalah harga dari tag yang digunakan biasanya lebih mahal daripada menggunakan antibody hasil
ekspressi makhluk hidup.
Tag-tag tersebut dapat berupa sekuens pendek peptida atau protein fluorescent, seperti:
Flag; peptide sequence DYKDDDDK
c-Myc; peptide seqence EQKLISEEDL
Hemagglutinin (HA); peptide sequence YPYDVPDYA
Green fluorescent protein (GFP)
Glutathione-S-transferase (GST)
Poly-His
V5
Beberapa tag tersebut dapat membantu kelarutan protein.
Berdasarkan survey yang diakukan oleh Labome, dari 1957, 271 diantaranya menggunakan tag
sebagai metode purifikasi dan pendeteksian protein. Berikut penggunakan tag pada penelitian yang
telah dipublikasikan:
Tabel 1. Penggunaan tag dalam penilitian protein yang telah dipublikasikan
tag numFLAG 88GFP 60GST 60HA 43HIS 41C-Myc 69V5 20
Pada tabel hasil survei ditunjukkan bahwa FLAG tag paling banyak digunakan. Anaslisis penulis
terkait hasil tersebut adalah dikarenakan FLAG tag memiliki kelebihan dari tag yang lain seperti lebih
hidrofilik sehingga tidak mengakibatkan denaturasi protein atau mengakibatkan protein tidak aktif.
Jika pada tag lain antibody monoklonal harus diisolasi terlebih dahulu terhadap protein yang ada
kemudian epitope (peptida protein) dikarakterisasi untuk digunakan sebagai tag, pada FLAG tag,
FLAG didesain terlebih dahulu sehingga antibody monoklonal akan dikenali. Selain itu alasan lain
mengapa FLAG tag paling digunakan adalah karena tag ini merupaan tag pertama kali yang telah
dipatenkan dan lebih dulu dikomersialkan dari pada tag-tag yang lain.
Terlepas dari alasan-alasan itu, penggunaan tag juga dipengaruhi oleh protein yang akan kita
pisahkan, keadaan larutan dan sel yang digunakan serta biaya yang akan dikeluarkan.
Metode Immunoprecipitation Langsung dan tidak langsung
Immunoprecipiation yang dilakukan secara langsung adalah ketika antibody yang digunakan
telah dipasangkan dengan beads (substrat berbentuk padat). Kemudian, campuran protein
yang akan dipisahkan ditambahkan ke beads tersebut sehingga protein yang diinginkan akan
tertangkap oleh antibody. Immunoprecipitation secara tidak langsung dilakukan dengan
menambahkan antibody ke campuran protein. Antibody akan mengikat protein yang sesuai
seiring berjalannya waktu. Kemudian kedalam campuran, ditambahkan protein A/G . Protein
A/G adalah protein gabungan (fusion proteins) dari IgG dari protein A dan protein G, dari
gabungan ini terbentuk protein yang berukuran 50,4 kilo dalton. Dengan adanya protin A/G
yang mengikat antibody dan protein yang dinginkan akan menjadikan bentukan yang besar
sehingga dapat menuju ke beads dan tertempel.
Kedua metode tersebut sebenarnya sama disisi bahan-bahan yang digunakan dan hasil akhir
yang didapat. Namun metode secara tidak langsunglebih dipilih ketika konsentrasi protein
target rendah dan afinitas antibody yang digunakan lemah. Selain dua alasan tersebut,
kinetika pengikatan yang lambat juga menyebabkan metode tidak langsung lebih dipilih.
Batch dan Kolom
Pada metode Batch, campuran protein yang biasanya berupa buffer yang didalamnya telah
diberi sel lysate dan antibody pengikat protein target, dicampur cemua dalam tabung reaksi
(biasanya tabung sentrifuge). Setelah didiamkan beberapa waktu agar terjadi pengikatan
antara antibody dengan protein, campuran disentrifuge. Komponen yang menjadi kontaminan
yang biasanya berada di fase atas, secara perlahan dipisahkan dengan mengambilnya secara
manual dengan pipet.
Pada metode Kolom, resin beads disusun pada kolom plastik atau kaca. Campuran dialirkan
ke dalam kolom dan diinkubasi beberapa waktu sehingga antibody dapat bereaksi dengan
protein. Campuran akan terpisah akibat gaya grafitasi (jika menggunanakan gravity flow) atau
pengendapan (jika menggunakan sentrifugasi).
Pemilihan metode ini didasarkan pada banyak sedikitnya larutan yang akan dipisahkan. Pada
skala yang besar, metode yang dipilih adalah menggunakan kolom. Penggunaan metode batch
masih dapat dilakukan untuk pemisahan skala besar, tetapi perlu pegulangan pekerjaan
sehinga memakan waktu. Selain itu, pemisahan supernatant yang dilakukan secara manula
terkadang tidak akurat sehingga kontaminant masih ikut terbawa sehingga yield yang didapat
tidak maksimal.
Tabung microsentrifuge untuk metode batchSumber: http://www.extragene-web.com
Kolom yang digunakan dalam ImmunoprecipitationSumber: http://www.activemotif.com/catalog/19.html
Material yang terlibat
Buffer
Buffer yang digunakan dalam immunoprecipitation ada tiga jenis. Masing-masing buffer ini
memiliki fungsi yang berbeda.
a. Lysis Buffer
Merupakan larutan yang digunakan untuk melisis sel. Lysis buffer untuk
immunoprecipitation berbeda dengan lysis buffer untuk perlakuan separasi dengan
metode lain atau percobaan lainnya. Hal tersebut dikarenakan lysate dari sel yang
dibutuhkan akan berbeda hasilnya bergantung dengan buffer yang digunakan. Larutan ini
juga akan mempengaruhi kualitas dari sel lysate seperti konformasi bentuk natif protein, ,
kemampuan menginhibisi aktivitas enzimatik, sisi ikat antibody, denaturasi dan
kemampuan protein keluar dari jaringan sel. Komposisi lysis buffer akan berbeda sesuai
dengan protein yang akan kita pisahkan menggunakan immunoprecipitation. Hal ini
disebabkan oleh lokasi dari protein di dalam sel,seperti di membran, sitosol atau nukleus,
yang menyebabkan kemudahan protein terambil ketika terjadinya lysis.
Buffer yang tidak mendenaturasi (non-denaturing buffer) digunakan ketika antigen
yang digunakan berupa detergent yang larut dan antibody dapat mengebali bentuk
native. Buffer ini mengandung detergent non-ionik seperti NP-40 atau Triton X-100.
Buffer yang mendenaturasi (denaturing buffer) digunakan ketika protein yang akan
kita pisahkan sulit untuk diambil dari jaringan sel dan antibody tidak dapat mengenali
protein dalam bentuk asli atau natifnya. Oleh karena itu perlu larutan untuk mengubah
bentuk protein atau dengan kata lain mendenaturasi. Contoh buffer ini adalah
Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA). Buffer ini lebih keras dibandingkan dengan
buffer non-denaturinng karena mengandung detergen ionik seperti SDS atau sodium
deoxycholate. Buffer ini juga dapat merilis protein nuclear (protein yang berasal dari
inti sel). Biasanya buffer iniberupa NaCl dan Tris-HCl dan memiliki pH (7.4 to 8).
Selain itu buffer ini bisa hanya terdiri dari EDTA dalam phosphate buffered saline
(PBS). Berikut merupakan tabel mengenai kisaran komposisi dari masing-masing
komponen untuk mendapatkan buffer yang optimal untuk melisis sel yang akan
digunakan untuk immunoprecipitation.
Tabel 2. Komponen masing-masing
Komponen Kisaran komposisiDetergen non-ionik (NP-40, Triton X-100) 0.1 - 2% Detergen Ionik (SDS, sodium deoxycholate) 0,01- 0,5 %NaCl (sodium chloride, garam) 0 - 1MKation divalent 0 - 10mMpH 6 - 9EDTA 0 - 5mM
Sel lysate mengandung protease dan fosfat yang dapat mengubah atau mendegradasi
protein yanng kita inginkan. Oleh karena itu, immunoprecipitation banyak dilakukan pada
suhu 4oCdan ditambahkan inhibitor protease dan fosfat PMSF, aprotinin and leupeptin
sodium orthovanadate atau sodium fluoride.
Gambar. Lysis buffer untuk immunoprecipitation
Sumber: http://www.piercenet.com/product/pierce-ip-lysis-buffer
b. Buffer pengikat dan pencuci (binding and wash buffer)
Binding buffer digunakan untuk menstabilkan keadaan dimana antibody dan protein yang
akan diikat melakukan interaksi hingga terjadinya pengikatan. Interaksi antibody-antigen
akan terjadi ketika pH mendekati netral. Buffer yang mengandung kekuatan ion standart
seperti PBS dapat mempermudah pengikatan antara antibody dan protein.
Setelah terjadi pengikatan, seiring waktu berjalan, pengendapan pada
immunoprecipitation masih tetap berlanjut. Komponen yang tidak diinginkan dan ikut
mengendaptersebut harus segera dihilangkan. Penghilangan tersebut dilakukan dengan
pemberian buffer seperti dapat dengan PBS itu sendiri atau dengan detergen dengan
konsentrasi rendah atau dengan garam dengan konsentrasi moderat.
c. Buffer pengelusi
Pada prinsipnya, buffer pengelusi ini mendisosiasi interaksi protein-protein atau antibody-
antigen agar dapat terelusi. Buffer ini membantu sisa protein yang tertinggal dalam wadah
(kolom atau tabung microsentrifuge) sehingga dapat terelusi secara sempurna. Selain itu,
bahan kimia yang terdapat dalam buffer ini juga dapat mengatur pH larutan sehingga pH
tetap pada range yang diiginkan sehingga struktur molekul yang kita perlukan tidak rusak.
Buffer pengelusi yang paling banyak digunakan untuk pemurnian protein menggunakan
prinsip interaksi antibody-antigen adalah 0.1 M glycine•HCl dengan pH 2.5-3.0. Namun,
beberapa antibody dan protein akan rusak pada pH rendah, sehingga sangat dianjurkan
untuk menetralisir larutan dengan 1/10th volume buffer alkali seperti 1 M Tris•HC pada
pH 8.5.
Tabel... Macam-macam buffer pengelusi (elution buffer) untuk purifikasi protein
menggunakan immunoaffinity
Agarose Beads
Resin yang lazim digunakan dalam immunopprecipitation. Bentuk dari beads ini adalah
seperti spons. Berukuran 20-150 µm. Karena ukurannya yang menjadikannya memiliki
permukaan yang luas dan terdapatnya poros, mengakibatkan beads ini memiliki kapasitas
pengikatan terhadap antibody lebih besar. Kelebihannya adalah tahan lama dan kuat sehingga
dapat tahan terhadap sentrfugasi hingga 5000 x g. Tidak rusak pada tekanan 100 psi, suhu
120 oC dan pH larutan yang ekstrim.
Gambar Bead AgaroseSumber: http://course1.winona.edu/sberg
Superparamagnetic Beads
Tidak seperti agarose, beads ini memiliki bentuk bulat padat (tidak berporos) dan ukurannya
lebih kecil (1-4 µm). Maka dari itu kapasitas penempelan antibody lebih kecil. Diperlukan
rasio yang tepat antara volume larutan yang isinya ingin dipisahkan dengan volume beads ini.
Pada aplikasinya, penggunaan beads ini digunakan pula magnet berkekuatan tinggi sehingga
dapat menarik magnetic beads ini ke sisi yang diinginkan. Maka dari itu, dalam
penggunaannya tidak diperlukan sentrifugasi yang dapat merusak komponen. Pemisahannya
pun lebih efisien. Namun, karena diperlukan peralatan yang lebih canggih, percobaan tidak
terlalu sering menggunakan alternatif ini dikarenakan keterbatasan biaya.
Gambar Superparamagnetic (PVA) BeadsSumber: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pola.v46:1/issuetoc
Antibody
Antibody Sekunder
Strategi Optimasi Complex binding
High Background from Nonspecific Interactions Antibody Contamination
Contoh AplikasiDari jurnal: 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.
Affinity Chromatography