ISOLASI DNA KROMOSOM PENDAHULUAN

DNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk untaian ganda. Kromosom sel prokariot merupakan suatu molekul besar DNA yang berkaitan erat-erat menjadi suatu daerah inti atau nukleoid.

Sel eukariot mengandung sejumlah molekul DNA, yang masing-masing pada umumnya berukuran jauh lebih besar dari satu molekul DNA didalam prokaryota. Molekul DNA didalam eukaryota bergabung dengan protein dan dikelompokkan menjadi serabut kromatin di dalam nukleus, yang dikelilingi oleh system membran ganda yang bersifat kompleks. DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan komponen jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.

Sel prokaryotik mengandung jauh lebih banyak DNA dibandingkan dengan DNA virus. Contohnya, satu sel E. Coli mengandung hampir 200 kali lebih banyak DNA dibandingkan dengan partikel bakteriofage ?. Percobaan genetik dan juga mikroskopik langsung tengah memperlihatkan bahwa DNA didalam sel E. Coli merupakan molekul tunggal yang amat besar. Molekul ini berbentuk lingkaran untaian ganda yang tertutup secara kovalen, dengan berat molekul kira-kira 2600 juta. DNA-nya mengandung empat juta pasangan basa dengan panjang keseluruhan kira-kira 1400 ?M = 1,4 mm, atau sampai 700 kali panjang sel E. Coli (2 ?M). Molekul DNA harus betul-betul berlipat erat-erat, karena molekul ini keseluruhannya terdapat didaerah inti sel-sel E. Coli. DNA sel bakteri tampaknya melekat pada satu atau lebih titik (daerah) pada permukaan sebelah dalam membran sel.

Eukaryota mengandung DNA lebih banyak dibandingkan dengan prokaryota. Sebuah sel jamur lender, salah satu eukaryota tingkat rendah, mengandung sampai 10 kali DNA sel E. Coli. Sel lalat buah (Drosophila) yang biasanya digunakan dalam penelitian genetika mengandung DNA 25 kali lebih banyak dibandingkan dengan DNA sel E. Coli. Setiap molekul sel eukaryota mengandung satu molekul DNA dupleks berukuran besar, yang dapat mencapai 4-100 kali ukuran DNA sel E. Coli. Sebagai contoh, panjang DNA salah satu kromosom terkecil pada manusia kira-kira 30 nM, hampir 15 kali lebih panjang dari DNA E. Coli. Ukuran molekul DNA didalam 46 kromosom manusia pada sel manusia tidak sama tetapi bervariasi pada kisaran 1-24 kali. DNA eukaryota berbentuk linier, tidak melingkar. Masing-masing kromosom dalam eukaryota membawa serangkain gen yang bersifat unik. Semua gen pada tiap sel menyusun genom.

DNA dalam organisme prokariot umumnya tidak bergabung dengan protein selain protein yang terlibat dalam replikasi atau transkripsi DNA. Banyak DNA dalam organisme eukariota terbungkus dalam sejumlah protein. Protein ini dan DNA membentuk suatu struktur kompleks, yaitu kromatin, yang memungkinkan adanya sejumlah besar konfigurasi molekul DNA dan tipe-tipe pengendalian yang unik bagi organisme eukariota.Informasi genetik dalam DNA sebuah kromosom dapat dialihkan melalui replikasi yang tepat, atau dapat ditukar lewat sejumlah proses yang mencakup persilangan, rekombinasi,

transposisi dan konversi. Semua ini menghasilkan suatu sarana memastikan kemampuan adaptasi dan penganekaragaman bagi organisme tersebut, kendati juga mengakibatkan penyakit.

TUJUAN

Percobaan ini bertujuan untuk memberikan pengalaman dan pengetahuan mengenai hal-hal yang harus dilakukan jika akan mengisolasi DNA kromosom bakteri.

ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan antara lain tabung reaksi, erlenmeyer, pipet tetes, penangas air 370C, shaker, tabung sentrifus sorvall, sentrifuse Backman, pipet volumetrik, freezer, gelas ukur, batang pengaduk, neraca analitik, gelas piala, mikropipet, alumunium foil, pH meter , laminar flow dan autoklaf.

Bahan-bahan yang digunakan adalah medium nutien broth (NB) steril, larutan lisozim (5 mg/ml dalam buffer TEN), larutan SDS (larutan SDS 20% dalam aquades), campuran kloroform/isoamilalkohol = 24:1, Na-asetat 2,5 M pH 6, etanol pa, buffer TEN (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM dan NaCl 10 mM), buffer SET (20% sukrosa, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, EDTA 1 mM, dan NaCl 10 mM), dan biakan bakteri E.Coli.

PROSEDUR PERCOBAAN

Hari pertama, percobaan melakukan preparasi bahan dan pensterilan alat. Pembuatan medium cair LB dilakukan dengan melarutkan Yeast ekstrak, Bacto pepton dan NaCl kedalam Erlenmeyer berisi aquades. Agar mudah larut, larutan dipanaskan dan dikocok dengan magnetic stirrer. Setelah ditambahkan larutan NaOH hingga pH-nya menjadi 7,6.Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kertas alumunium foil dan dimasukkan kedalam aotoklaf pada 2 atm, 1210C selama 10 menit. Alat-alat yang akan digunakan juga disterilkan dalam eutoklaf pada 1210C selama 30 menit. Selain itu dibuat pula bahan-bahan seperti larutan lisozim, larutan SDS 20%, buffer TEN, buffer SET, campuran kloroform:isoamilalkohol (24:1), dan larutan Na-asetat. Kemudian dilakukan inokulasi bakteri yang akan diisolasi DNA-nya kedalam medium cair NB 200 ml dalam erlenmeyer. Lalu diinkubasi dengan pengocokan pada penangas air 370C selama semalam.

Hari kedua, seluruh biakan bakteri hasil inkubasi semalam tersebut dipindahkan kedalam tabung sentrifuse sorvall (polipropilen 500 ml) yang steril. Kemudian disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm pada 40C selama 20 menit. Lalu supernatan dibuang dan disuspensikan kembali peletnya dalam 20 ml buffer SET. Suspensi disempurnakan menggunakan pipet tetes steril, yaitu dengan cara menghisap dan melepaskannya kembali berulang-ulang sampai diperoleh suspensi yang homogen dan kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse baru. Setelah itu disentrifuse lagi dalam kecepatan 5000 rpm pada 40C selama 15 menit. Lalu supernatannya dibuang dan pelet bakteri dibekukan dalam freezer 200C selama 10 menit. Kemudian pelet dilelehkan kembali dengan cara merendam tabung di aliran air keran. Perlakuan dengan cara sentrifuse pada kecepatan 5000 rpm pada 40C selama 15 menit sampai pembekuan pelet bakteri dalam freezer bersuhu 200C selama 10 menit dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali. Pelet lalu disuspensikan dalam 12,5 ml buffer SET dan dipindahkan kedalam erlenmeyer 100 ml yang steril. Lalu ditambahkan 0,5 ml larutan lisozim 5 mg/ml yang segar dan diinkubasikan dalam waterbath 370C selama 25 menit sambil

dikocok perlahan-lahan. Kemudian ditambahkan 1 ml larutan SDS 20%. Diinkubasikan kembali dalam waterbath 370C selama 2,5 jam sambil dikocok perlahan-lahan. Setelah itu ditambahkan 2 ml campuran kloroform : isoamilalkohol (24:1) kemudian dikocok dan diinkubasikan semalam pada 370C.

Hari ketiga, kedalam campuran yang telah diinkubasi semalam, ditambahkan 2 ml aquades dan 20 ml campuran kloroform : isoamilalkohol (24:1). Lalu dikocok perlahan-lahan sampai larutan menjadi putih susu kurang lebih selama 5 menit. Kemudian dipindahkan kedalam tabung sorvall steril bervolume 40 ml dan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Setelah itu diambil fase airnya (bagian atas) dengan pipet tetes steril bermulut besar dan dipindahkan kedalam tabung sentrifuse steril lainnya. Lalu ditambahkan kembali 20 ml campuran kloroform : isoamil alkohol (24:1) dan dikocok perlahan sampai larutan menjadi putih susu selama 5 menit. Langkan-langkah mulai dari pengambilan fase air (bagian atasnya) sampai proses pengocokan larutan hingga menjadi warna putih dilakukan sebanyak 2 kali. Volume fase air yang diperoleh diukur dengan gelas ukur steril. Lalu ditambahkan larutan Na-asetat 2,5 M pH 6 sebanyak 0,2 kali volume fase air yang diperoleh. Dan ditambahkan etanol dingin setetes demi setetes sambil DNA yang terbentuk dililitkan pada batang pengaduk kaca yang steril. Penambahan etanol terus dilakukan sampai 2 kali volume semula.

HASIL PERCOBAAN

DNA atau kromatin yang didapat berwarna putih berbentuk seperti benang-benang halus yang melilit pada batang pengaduk.

PEMBAHASAN

Dalam rekayasa genetika, isolasi DNA kromosom adalah tahap yang paling penting yang sering kali harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk diklon. Adapun menurut Watson dan Crick struktur heliks ganda seperti DNA mempunyai ciri-ciri khas seperti tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang basanya berpasangan dengan ikatan hidrogen, dengan aturan perpasangan A-T dan G-C. Pasangan A-T diikat oleh dua ikaan hidrogen, sedangkan G-C oleh tiga ikatan hidrogen, perpasangan dengan ikatan hidrogen ini selain mengikat juga mempertahankan jarak antara dua basa. Antara dua utasan membentuk pasangan anti pararel yaitu antara kedua utasan terdapat arah yang berlawanan; ujung 5P akan berhadapan dengan ujung 3OH, antara dua pasangan basa terdapat jarak sebesar 3,4 A0. Dan pasangan dua utasan DNA membentuk suatu pilinan disekitar suatu sumbu dengan arah pilinan kekanan atau searah dengan arah jarum jam, setiap sepuluh pasang basa (3,4A0) akan membentuk satu pilinan atau perputaran 3600 yang berdiameter 200.

Dalam memudahkan pengisolasian DNA kromosom diperlukan E.Coli dalam jumlah yang besar karena apabila E.Coli yang tersedia jumlahnya sedikit maka pengisolasian DNA kromosom akan sulit dilakukan oleh karena itu sel E.Coli harus dibiakkan terlebih dahulu. Medium untuk menumbuhkan bakteri dalam percobaan ini digunakan ekstrak Yeast dan Bacto pepton. Medium dan alat-alat yang digunakan harus steril, agar biakan E.Coli tidak terkontaminasi dengan bakteri lain. Sterilisasi merupakan suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan dari segala bentuk mikroorganisme. Seperti diketahui penyelidikan terhadap suatu spesies atau galur mikroba selalu berdasarkan atas pengamatan terhadap sifat biakan murni, dalam arti biakan yang hanya berisi satu jenis spesies atau galur saja. Oleh

karena itu, untuk menghindari terjadinya kontaminasi (tumbuhnya mikroorganisme lain selain mikroba yang akan diamati) dalam melaksanakan penelitian perlu digunakan peralatan yang steril.Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara bergantung pada macam bahan yang akan disterilkan terhadap ketahanan panas, senyawa kimia, radiasi dan lain-lain. Salah satu cara sterilisasi yang sering dipakai adalah dengan menggunakan otoklaf, yaitu menggunakan uap panas dalam tekanan tinggi (pada 1210C dan tekanan 2 atm).

Dalam percobaan ini biakan E. Coli yang masih muda dipecahkan dengan menambahkan enzim isozim dan larutan SDS yang berfungsi untuk memecah dinding atau membran sel. Dinding sel yang telah pecah menyebabkan organel-organel didalam sel keluar termasuk protein-protein yang terdapat didalam sitoplasma, sehingga DNA perlu dibersihkan dari pengotor-pengotor tersebut. Pembersihan pengotor pada DNA dilakukan dengan cara mengekstraksi larutan menggunakan campuran kloroform:isoamilalkohol (24:1). Pengekstrakan dilakukan berulang kali sampai diperoleh larutan DNA yang relatif bebas protein.

Proses merekristalisasi molekul DNA dengan menggunakan etanol dapat mengakibatkan terbentuknya endapan yang dapat dilakukan dengan cara mencelupkan batang pengaduk ke dalam larutan, maka molekul DNA akan terlilit pada batang pengaduk tersebut. Hasil isolasi DNA yang didapat dari percobaan ini adalah seperti benang-benang halus yang berwarna putih. Benang-benang tersebut merupakan kumpulan DNA yang berbentuk kromatin.Kromatin terdiri dari sejumlah molekul DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang dan massa protein dasar yang agak kecil serta hampir sama besarnya yang dinamakan histon disamping protein non histon dalam jumlah yang lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam dan berukuran lebih besar daripada histon) dan sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda dalam setiap kromosom memiliki panjang yang besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah untuk memadatkan DNA.

Dari hasil percobaan tersebut kemungkinan benang-benang halus yang terbentuk bukan hanya terdiri dari kromatin namun mungkin dapat pula terdiri dari pengotor-pengotor lainnya. Oleh karena itu untuk melakukan pengujian kemurnian DNA dapat dilakukan dengan cara SDS-page, Elektroforesis Gel Agarosa atau PFGE (Pulse Field Gel Electroforesis).

KESIMPULAN

Pengisolasian DNA kromosom harus dalam jumlah yang besar dan bersifat steril untuk mencegah kontaminasi dari bakteri lainnya. Dari percobaan didapatkan DNA yang berbentuk benang-benang halus putih yang menempel pada batang pengaduk.

DAFTAR PUSTAKAJusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta.Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia III. Terjemahan Maggy Thenawijaya. Erlangga, Jakarta.Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta.Murray, Robert K. 2000. Biokimia. Terjemahan Andry Hartono. Buku Kedokteran. EGC, Jakarta.