3. METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan Penelitian

3.1.1 Alat-alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain wadah kultur

(erlenmayer 600 ml), aerator, selang, lampu TL, botol sprayer, pH meter, DO

meter, termometer, haemocytometer 0,1 mm (BOECO, Hamburg, Germany),

nampan, mikroskop (Olympus CX21, Jepang), bola hisap D&N, pipet volume 10

ml dan 1 ml pyrex lwaki, pipet tetes, elenmeyer 500 ml pyrex lwaki, autoklaf GEA,

mikropipet Eppendorf Research Plus, gelas ukur 100 ml, beaker glass pyrex 250

ml, handtally counter, gayung, washing bottle, cover glass, cuvet, sentrifuge, oven

RedLine RE53, timbangan analitik Radwag AS2201X, bak besar, refraktometer

(Master Refractometer, Jepang), kalkulator, lux meter Sunche,

spektrofotometer Spectroquant pharo 300, bunsen, sprayer, botol film, valcon,

Laminary Air Flow (LAF), sendok media, blue tip, white tip, pinset, triangle,tabung

reaksi, rak tabung reaksi, rotary evaporator (IKA® RV 10), colony counter,

timbangan digital, spektofotometer, botol vial, GC-MS, petridish dan vaccum

pump s VE115 Value.

3.1.2 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Nannochloropsis

sp. berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP)

Jepara, air laut salinitas 15 ppt, klorin, Na-Thiosulfat, alkohol 70%, tissue, kapas,

Etil acetat, Bakteri Vibrio harveyi, vitamin, pupuk walne, kertas saring GF/C

(diameter 90 mm), aquadest, metanol absolute, benang kasur, kertas koran,

kertas label,air tawar, Media Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS),

19

Media Trypticase Soy Broth (TSB), Plastic warp, Spirtus, Tetracycline disk, DMSO

10%, dan aluminium foil.

3.2 Metode Penelitian

Metode kerja pada penelitian ini menggunakan gabungan 2 metode, yaitu

metode eksperimen dan deskriptif dengan pendekatan secara kuantitatif. Menurut

Wasis (2006), metode eksperimen merupakan metode penelitian yang menguji

hipotesis berbentuk hubungan sebab-akibat melalui pemanipulasian variabel

independen (misal treatment, stimulus, kondisi) dan menguji perubahan yang

diakibatkan oleh pemanipulasian. Efek dari manipulasi disebut variabel dependen.

Selama pemanipulasian perlakuan, peneliti melakukan kontrol terhadap variabel

luar (extraneous variables) agar perubahan yang terjadi benar-benar akibat

pemanipulasian, bukan disebabkan variabel lainnya.

Menurut Sugiyono (2015), analisis deskriptif yaitu dengan memberikan

ulasan atau interpretasi terhadap data yang diperoleh sehingga menjadi lebih jelas

dan bermakna dibandingkan dengan sekedar angka-angka. Langkah-langkahnya

adalah reduksi data, penyajian data dengan bagan dan teks, kemudian penarikan

kesimpulan. Sedangkan pendekatan kuantitatif dilakukan denan cata mencatat

dan menganalisa data hasil penelitian secara eksak dengan menggunakan

perhitungan statistik.

3.3 Kerangka Operasional Penelitian

Adapun kerangka operasional pada penelitian ini (Gambar 9), yaitu

sebagai berikut :

20

Gambar 9. Kerangka Operasional Penelitian

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 kultivikasi Nannochloropsis sp.

a. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi merupakan suatu proses membunuh mikroorganisme yang tidak

diinginkan baik pada alat-alat, bahan, atau media yang digunakan. Sterilisasi yang

digunakan dalam penelitian ini meliputi sterilisasi panas basah dan sterilisasi

kimia. Sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf, sedangkan sterilisasi kimia

menggunakan bahan meliputi klorin 30 ppm selama 24 jam dan diberi Na

Thiosulfat 15 ppm untuk menghilangkan bau klorinnya (Suminto, 2009).

Peralatan yang terbuat dari kaca meliputi pipet volume dan pipet tetes

disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang akan disterilkan dicuci

menggunakan sabun, kemudian dibilas dengan air tawar, dan ditunggu sampai

kering. Selanjutnya peralatan tersebut dibungkus dengan menggunakan kertas

Analisis Data

21

rius. Namun sebelum dibungkus, pipet volume dan pipet tetes harus diberi kapas

dan diikat menggunakan benang kasur. Setelah itu, ditata peralatan yang akan

disterilkan di dalam autoklaf, kemudian ditutup. Prinsip kerja autoklaf adalah

sterilisasi panas basah dengan tekanan 1 atm pada suhu 1210C selama 30 menit.

Peralatan lainnya yaitu toples kaca, erlenmeyer, beaker glass, dan gelas ukur yang

digunakan untuk kultur disterilisasi cara direndam air tawar dan ditambahkan

larutan klorin 30 ppm, didiamkan selama 24 jam kemudian dinetralkan dengan

larutan Na Thiosulfat 15 ppm.

Media kultur berupa air laut 15 ppt ditambah dengan pupuk walne kemudian

disterilisasikan di autoclaf. Selanjutnya dilakukan penambahan vitamin sebelum

penataan wadah kultur dengan dosis masing-masing yaitu 1 mL/L. Wadah yang

telah diisi media steril sebanyak 1,5 liter kemudian diletakkan di atas rak kultur.

b. Penyiapan Inokulan

Bibit Nannochloropsis sp. diperoleh dari kultur murni BBPBAP Jepara.

Selanjutnya dikultur pada toples dengan volume 1,5 liter dengan media air laut

sebanyak 2 buah. Penyediaan inokulan Nannochloropsis sp. dilakukan selama 4

hari untuk mencapai fase eksponensial. Selama penyiapan inokulan tersebut suhu

ruang dijaga pada 28oC dengan intensitas cahaya 4.500 lux.

Stok Nannochloropsis sp. yang ditebar, sebelumnya dihitung kepadatan

awalnya untuk mengetahui seberapa banyak bibit Nannochloropsis sp. yang

dibutuhkan untuk ditebar pada media. Selanjutnya apabila telah diketahui

kepadatannya, ditentukan bibit Nannochloropsis sp. yang dibutuhkan dengan

metode pengenceran. Menurut Cresswel (2014), pengenceran dapat digunakan

untuk menghitung jumlah bibit plankton yang dikehendaki untuk budidaya maupun

untuk diberikan sebagai makanan larva. Jumlah bibit yang dikehendaki dihitung

menggunakan rumus sebagai berikut:

22

Keterangan:

V1 : volume bibit untuk penebaran awal (ml) N1 : jumlah bibit yang akan ditebar (sel/ml) V2 : volume budidaya yang dikehendaki (ml) N2 : jumlah bibit yang dikehendaki (sel/ml) c. Pelaksanaan Kultur Nannochloropsis sp.

Pelaksanaan kultur Nannochloropsis sp. dengan menempatkan wadah yang

telah diisi media sebanyak 1,5 liter di atas rak kultur. Intensitas cahaya diatur

dengan lampu TL 4.500 lux. Selanjutnya diaerasi, bibit Nannochloropsis sp. yang

ditebar memilki kepadatan awal 5 x105 sel/ml dengan pengenceran (Nass,2013).

Pengamatan pertumbuhan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari selama

masa kultur hingga fase eksponensial hingga mencapai 5 hari waktu pengkulturan.

Selanjutnya dilakukan pemanenan untuk dilakukan proses ekstraksi.

Parameter yang diukur pada media pemeliharaan meliputi suhu, DO, pH

dilakukan satu kali sehari setiap 24 jam pada pukul 11.00 WIB.

d. Pertumbuhan Nannochloropsis sp.

Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari dari awal

kultur hingga akhir percobaan. Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp.

dilakukan menggunakan metode penghitungan konsentrasi sel menggunakan 0,1

mm deep Neubauer haemocytometer dan alat bantu mikroskop dengan

menggunakan rumus perhitungan menurut Cresswel (2010) yaitu:

Jumlah (sel/ml) = x 104

23

Apabila kepadatannya tinggi maka menggunakan perhitungan yaitu

sebagai berikut:

- Laju Pertumbuhan Spesifik

Perhitungan laju spesifik dari pertumbuhan saat awal kultur hingga puncak

konsentrasi maksimum. Laju pertumbuhan spesifik dihitung dengan menggunakan

rumus Ak et al. (2008) yaitu:

µ =

keterangan:

µ : laju pertumbuhan per unit konsentrasi sel (hari-1) x1 dan x2 : konsentrasi sel pada waktu ke-1 (tl) dan waktu ke-2 (t2), berturut-turut.

- Doubling Time

Doubling time (dt) ialah waktu penggandaan dari sel Nannochloropsis sp.

Waktu penggandaan sel (dt) merupakan rata-rata waktu generasi sel membelah.

Doubling Time dihitung dari laju pertumbuhan dengan menggunakan rumus

menurut Ak et al. (2008) sebagai berikut:

3.4.2 Ekstraksi Ekstraseluler Nannochloropsis sp.

Pembuatan ekstrak ekstraseluler Nannochloropsis sp. dilakukan melalui 2

tahap yaitu sentrifugasi dan evaporasi untuk mendapatkan ekstrak murni dari

ekskresi Nannochloropsis sp. Proses ekstraksi yang pertama dilakukan adalah

sentrifugasi dengan pemisahan cairan luar tubuh Nannochloropsis sp.

menggunakan pelarut ethyl acetat. Nannochloropsis sp. dipanen pada fase

Jumlah (sel/ml) =

24

eksponensial sebanyak 1,5 liter kemudian dimasukkan kedalam 6 valcon

sebanyak 10 ml setiap valcon kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000

rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dari Nannochloropsis sp. diambil larutan

yang berada pada bagian atas biomassa yang mengendap di bawah sebagai

supernatan. Supernatan dituang sebanyak 5ml pada setiap valcon yang telah

diberi ethyl acetat sebanyak 5 ml. Perbandingan pemberian ethyl acetat dengan

larutan supernatan Nannochloropsis sp. adalah 1:1 yaitu 5 ml ethyl acetat dan 5

ml spernatan. Selanjutnya valcon ditutup kemudian disentrifugasi dengan

kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi larutan yang berada

diatas larutan supernatan diambil dan ditampung pada Erlenmeyer steril sebagai

larutan sampel supernatan Nannochloropsis sp. Proses sentrifugasi untuk setiap

sampel Nannochloropsis sp. dilakukan tiga kali ulangan. Setelah seluruh sampel

terkumpul kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan kecepatan

80 rpm selama ± 3,5 jam dengan suhu 320C. Larutan hasil penguapan kemudian

dipindahkan ke dalam botol sampel sebagai sampel hasil ekstraksi ekstraseluler

Nannochloropsis sp.. Sampel ekstrak selanjutnya disimpan dalam lemari

pendingin dengan suhu -200C hingga pemakaian.

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil asetat. Etil asetat

merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi karena dapat dengan

mudah diuapkan, tidak higroskopis, dan memiliki toksisitas rendah. Etil asetat

bersifat semi polar sehingga mampu menarik senyawa aglikon maupun glikon.

(Wardhani dan Sulistyani, 2012).

3.4.3 Pembuatan Stock AHL (Acyl Homoserine Lactone)

AHL yang digunakan dalam penelitian ini merupakan AHL sintetis. Bahan

ini termasuk dalam salah satu autoinducer yang digunakan oleh V. harveyii untuk

menyatukan sinyal antar sel dengan sel yang lain dalam kepadatannya yaitu N-3-

25

oxo-octanoyl-l-homoserine lactone (3OC8HSL). Pembuatan stok AHL 4 mM

dilakukan dengan pengukuran AHL sebanyak 215,472 µg AHL kemudian

dilarutkan kedalam 200 µl methanol 5% untuk mendapatan konsentrasi sebesar

4mM 3OC8HSL stok larutan. Kemudian larutan stok tersebut dilarutkan dengan

perbandingan methanol dengan konsentrasi 5% dan aquades untuk mendapatkan

konsentrasi pengenceran sebanyak 200; 20; 2; 0, 5; 0,1 dan 0,05 µM

perbandingan pelarut air dan methanol ditunjukkan pada Tabel 3. AHL dengan

konsentrasi 0,05 µM diambil sebanyak 5 ml untuk dimasukkan dalam valkon dan

disimpan dalam freezer -20C sebelum digunakan untuk menghindari kerusakan

dari AHL (Acyl Homoserine Lacton).

Tabel 3. Pengenceran dan pembagian Konsentrasi AHL 3OC8HSL

Larutan AHL (µM)

Pengenceran AHL 200 (10 µl dari AHL 4mM dengan pelarut methanol)

20 (20µl dari AHL 200 µM)

2 (20µl dari AHL 20 µM)

0,5 (50µl dari AHL 2 µM)

0,1 (40µl dari AHL 0,5 µM)

0,05 (100µl dari AHL 0,1 µM)

Akuades (µl)

195 0 0 0 0 0

Methanol 5% (µl)

0 180 180 150 160 100

Volume total (µl)

200 200 200 200 200 200

3.4.4 Persiapan Media Kultur Bakteri

Pada penelitian ini bakteri V. harveyi dikultur pada media agar dan media

cair. Media agar kultur bakteri V. harveyi adalah Thiosulfat Citrate Bile Salt Sucrose

Agar (TCBSA) dengan penambahan NaCl 2%. Mayoritas isolat bakteri V.harveyi

BB120 memiliki batas toleransi kadar garam 0% sampai dengan 5% dengan

pertumbuhan bakteri sebesar 96,7% (Musa et al., 2008). Persiapan pembuatan

media agar yaitu dengan menimbang sebanyak 6,6 gram TCBSA dengan

penambahan 2 % NaCl yaitu sebanyak 1,5 gram NaCl menggunakan timbangan

26

digital. Media yang telah ditimbang selanjutnya dilarutkan ke dalam 75 ml akuades

dimasukkan ke dalam erlenmayer 250 ml. Kemudian erlenmayer ditutup dengan

kapas dan alumunium foil kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20

menit dengan suhu 1210C tekanan 1 atm. Sedangkan media cair kultur bakteri

V.harveyi digunakan media Tryptic Soy Broth (TSB) dengan penambahan NaCl

sebanyak 2%, hal pertama yang dilakukan adalah penimbangan media TSB

sebanyak 0,6 gram dengan penambahan NaCl sebanyak 0,4 gram dilarutkan

dalam 20 ml akuades dimasukkan kedalam erlenmayer 250 ml kemudian dibagi

secara merata pada 2 tabung reaksi sebanyak 9 ml untuk masing-masing tabung

reaksi. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan kapas dan ditutup dengan

alumunium foil untuk selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20

menit dengan suhu 1210C.

3.4.5 Kultur Bakteri

Isolat bakteri Vibrio harveyi diremajakan di media agar TCBS dengan

konsentrasi NaCl 2%. Kultur bakteri dilakukan menggunakan metode gores

dengan jarum ose. Sebelumnya media TCBS dituang pada cawan petri ditunggu

hingga menjadi agar kemudian ditambahkan bakteri Vibrio harveyi dengan

memanaskan jarum ose pada bunsen hingga memijar untuk mensterilkan jarum

ose. Kemudian jarum ose diaklimatisasikan pada media agar kosong supaya tidak

terlalu panas saat pengambilan bakteri. Kemudian isolat bakteri diambil

menggunakan ose dan di goreskan pada media agar. Setelah itu cawan petri yang

berisi media dan bakteri peremajaan ditutup menggunakan plastic warp untuk

diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 300C. Setelah inokulan mencapai waktu

pengkulturan 24 jam kemudian inokulan diambil 1 koloni dan dibiakkan pada media

cair yaitu TSB dengan penambahan NaCl 2%, selanjutnya diaduk menggunakan

vortex mixer kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 300C. Inokulan

dihitung kepadatannya menggunakan kurva regresi dengan nilai OD600 = 89,821 -

27

6,385. Selanjutnya bakteri yang akan digunakan pada pengujian diencerkan

terlebih dahulu pada media NaFis 0,9% steril untuk mendapatkan kepadatan

106 CFU/ml.

3.5 Pelaksanaan Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dengan kultivikasi Nannochloropsis sp. terlebih

dahulu. Bibit yang ditebar pada awal kultivikasi Nannochloropsis sp. sebanyak

5x105 sel.mL-1 (Nass, 2013). Setelah itu, pengamatan pertumbuhan

Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari selama masa kultur. Pemanenan

dilakukan pada awal fase stasioner untuk tahap ekstrsksi menggunakan

sentrifuge untuk mendapatkan supernatan ekstrak ekstraseluler

Nannochloropsis sp.. Setelah mendapatkan supernatan maka dilakukan

evaporasi menggunakan Rotary Evaporator untuk mendapatkan ekstrak

ekstraseluler Nannochloropsis sp.. Kemudian ekstrak digunakan untuk ui

antagonisme bakteri, fitokimia, dan quorum sensing.

3.5.1 Uji Kandungan AHL Ekstrak Ekstraseluler Nannochloropsis sp.

Menggunakan Gas Chromatography-Mass spectrometer (GC-MS)

Pengidentifikasian dengan alat GC-MS menggunakan 3 sampel yaitu sampel

ekstraksi ekstraseluler Chlorella sp. dengan etil acetat, sampel ekstrak

ekstraseluler Chlorella sp. dengan etil acetat dan ditambahkan AHL (dengan

perbandingan 1:1) dan sampel standar AHL yang telah dilarutkan menggunakan

melthanol dengan konsentrasi 20 nM. Kemudian dianalisis dengan GC-MS untuk

mengetahui spektrum massa dari masing-masing sampel dan dibandingkan antara

keduanya. Spektrum massa yang diperoleh akan terbaca oleh spectrum massa

senyawa standar yang telah diketahui dalam database yang telah terprogram pada

alat GC-MS. GC-MS yang digunakan adalah agilent type 7890 A dilengkapi

dengan kolom jenis HP5 ukuran 30 m x 250 µm x 0,25 µm dioperasikan pada suhu

28

detektor 2300C dan suhu inlet 2500C dan digunakan gas helium sebagai fasa

geraknya. Alat GC-MS terdiri dari dua komponen alat yaitu GC (Gas

Cromatography) yang berfungsi sebagai alat pendeteksi suatu senyawa dari

bahan dan akan memecah struktur kimia dari bahan tersebut. Sedangkan MS

(Mass Spectrometry) adalah alat yang mampu memecah struktur senyawa dari

pecahan yang dihasilkan oleh GC menjadi struktur yang paling kecil dan

mendeteksi spektrum massa senyawa tersebut untuk mengetahui kelimpahan dan

waktu yang diperlukan dalam pendeteksian senyawa tersebut.

Analisis data hasil GC-MS akan dianalisis secara bioinformatika. Analisis

bioinformatika digunakan untuk melakukan perancangan suatu obat dengan

komputerisasi melalui seleksi molekul target, visualisasi struktur molekul target,

dan merancang molekul obat ata senyawa kimia didasarkan pada molekul target.

Analisis bioinformatika yang digunakan terdiri dari 4 tahapan dimana pada

tahapan 1 dilakukan pencarian informasi senyawa target dengan menggunakan

software online PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) serta untuk

mendapatkan canonical smile yang berfungsi sebagai kode untuk analisis lanjutan,

tahapan 2 dianalisis dengan menggunakan software PassOnline yang berguna

untuk memprediksi keguaan senyawa target. Tahap 3 dianalisis dengan software

Stitch 5.0 program ini digunakan untuk mengetahui mekanisme senyawa target

bakeri uji dan tahap ke 4 dianalisis dengan software Uniprot yang digunakan untuk

mempelajari protein yang berikatan dengan senyawa target. Semua data hasil

analisis tersebut terhubung langsung dengan data ncbi yang merupakan library

atau perpustakaan senyawa-senyawa kimia yang diakui internasional.

29

3.5.2 Uji Antagonisme Bakteri

a. Uji Cakram

Uji antagonisme bakteri V. harveyi terhadap ekstrak ekstraseluler

Nannochloropsis sp. pada media agar menggunakan uji cakram, yaitu pengujian

antibakteri dengan mengukur diameter daerah hambatan yang terjadi di sekitar

kertas cakram yang sudah mengandung bahan antibakteri. Larutan antibakteri

disini adalah ekstrak ekstraseluler Nannochloropsis sp. yang telah dilarutkan

menggunakan pelarut DMSO 10%. Dosis yang diujikan merupakan hasil pelarutan

antara ekstrak dengan larutan pelarut diantaranya adalah 1 ppm, 10 ppm,

100 ppm, 1.000 ppm, serta 2 perlakuan kontrol positif dan negatif. Langkah

pertama yaitu dengan menuangkan media TCBSA dengan penambahan NaCl

sebanyak 2% steril ke masing-masing cawan petri dan ditunggu hingga menjadi

agar. Pengambilan bakteri dilakukan dengan menggunakan mikropipet, diambil

sebanyak 75 µl dari suspensi biakan uji, dengan kepadatan 106 CFU/ml, kemudian

diratakan menggunakan Trianggle agar pertumbuhan bakteri dapat merata. Media

agar dibiarkan mengering kurang lebih 5 menit, kemudian tempatkan kertas

cakram steril pada permukaan lempeng agar. Selanjutnya pemberian larutan

ekstrak dengan mengambil larutan ekstrak dengan konsentrasi yang telah

ditetapkan sebanyak 25 µl untuk satu kertas cakram menggunakan mikropipet,

kemudian diteteskan pada kertas cakram. Dalam 1 lempeng agar digunakan 1

macam dosis perlakuan. Kertas cakram ditekan dengan pinset, tidak perlu terlalu

keras karena akan merusak permukaan agar. Lempeng yang sudah ditempelkan

kertas cakram diinkubasi pada suhu tumbuh optimal dari bakteri V.harveyi yaitu

320C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan selama 24 jam masa inkubasi. Zona

bening disekitar cakram merupakan petunjuk kepekaan bakteri terhadap bahan

antibakteri yang digunakan sabagai bahan uji dan dinyatakan dengan luas zona

30

hambat. Toy et al. (2015), menjelaskan cara pengukuran diameter zona hambat

menggunakan jangka sorong dengan perhitungan sebagai berikut :

Keterangan:

Dv : Diameter Vertikal Dh : Diameter horisontal Dc : Diameter Cakram

Gambar 10. Pengukuran diameter zona hambat

Setelah bakteri uji sudah tumbuh merata dan terlihat adanya zona jernih di

permukaan agar, maka luas zona bening dapat diukur dengan mengukur

diameternya dengan menggunakan jangka sorong seperti disajikan pada

Gambar 10.

b. Uji Co-Culture

Dilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Uji daya

hambat bakteri dilakukan dengan penentuan MIC (Minimum Inhibitation

Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal concentration). Pada uji MIC,

Persiapan pengujian dilakukan dengan menyiapkan tabung reaksi steril sebanyak

6 buah dan telah diberi label konsentrasi 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm dan

kontrol bakteri V. harveyi dan kontrol media. Media cair yang digunakan untuk

setiap percobaan adalah media cair TSB (Tripticase Soya Broth) dengan

penambahan NaCL 2%. Ekstrak yang telah dilarutkan DMSO 10% pada

konsentrasi yang telah ditentukan kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi

31

yang berisi media pada perlakuan 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 1 ppm masing-

masing konsentrasi sebesar 1ml. Dimasukkan 1 µl suspensi bakteri V. harveyi

dengan kepadatan 106 CFU/ml ke dalam tabung reaksi perlakuan dan kontrol,

selanjutnya divortex hingga homogen. Semua tabung diinkubasi pada suhu 300C

selama 24 jam. Setelah 24 jam, diamati dan dicatat kekeruhan pada semua tabung

dengan alat spektofotometer.

Penghitungan jumlah koloni dilakukan dengan inokulasi dari uji co-culture.

Pengenceran dengan NaFis 0,9 % dilakukan untuk memudahkan penghitungan

koloni. Pengenceran terakhir, 3 terakhir, dan 5 terakhir adalah konsentasi yang

akan ditanam untuk uji MBC. Penanaman bakteri dilakukan menggunakan metode

tuang (pour plate) dengan suspensi bakteri sebanyak 0,1 ml dari tabung

pengenceran Pengenceran terakhir, 3 terakhir, dan 5 terakhir. Media tumbuh yang

digunakan adalah media selektif TCBS. Kemudian inkubasi selama 24 jam pada

suhu 32oC. Media yang telah diinkubasi selanjutnya dihitung jumlah koloninya.

Nilai MBC ditentukan dari konsentrasi terendah ekstrak yang menunjukkan tidak

adanya pertumbuhan koloni bakteri pada cawan petri.

3.6 Analisis Data

Analisa data pada penelitian ini menggunakan metode deskriptif Menurut

Sugiyono (2015), Analisis deskriptif kualitatif yaitu dengan memberikan ulasan

atau interpretasi terhadap data yang diperoleh sehingga menjadi lebih jelas dan

bermakna dibandingkan dengan sekedar angka-angka. Langkah-langkahnya

adalah reduksi data, penyajian data dengan bagan dan teks, kemudian penarikan

kesimpulan.