1.laporan praktikum bioteknologi-pembuatan media.docx

Upload: merlin

Post on 02-Jun-2018

222 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    1/16

    BAB 1

    PENDAHULUAN

    1.1 Latar Belakang

    Kultur jaringan tanaman merupakan bagian suatuteknik perbanyakan vegetatif nonkonvensional. Perbedaanteknik ini dibandingkan dengan teknik perbanyakan vegetativekonvensional biasanya terletak dalam situasi dan lokasi yang

    berbeda. Penerapan teknikkultur jaringan tanamanmensyaratkan kondisi di dalam ruangan (laboratorium) dan

    sifatnyaaseptik (steril dari patogen). Bermuara dalam kondisiyang aseptic, maka perlu dijelaskan bahwa segala aktifitasyang berkaitan dengan jaringan harus dalam kondisi aseptik.Kondisi ini dimulai dari cara: Penyiapan peralatan (alat tanam

    berbahan logam ataupun gelas), Pembuatan media penanaman,Penanaman (inisiasi dan pemilihan: a. perbanyakan;

    b.perakaran).Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan

    salah satu factor utama dalam keberhasilan kultur. Media

    kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yangdiperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang

    ditanam. Media kultur jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat digunakan padasemua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada

    memiliki perbedaan kandungan dan konsentrasi zat-zat yangdiperlukan atau digunakan pada kultur.

    Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan

    dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan danperkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringansecara umum sangat tergantung pada jenis media. Mediatumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya

    terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibityang dihasilkannya. Oleh karena itu, berbagai komposisi

    media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkanpertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.

    Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair. Media

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    2/16

    berbentuk padat menggunakan pemadat media seperti agar.

    Media kultur yang memenuhi syarat adalah yang mengandungnutrient makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan

    tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung berbagaimacam vitamin dan ZPT.

    1.2 Tujuana. Untuk mengetahi dan mempraktikan cara membuat larutan

    stok.b. Untuk mengetahui dan mempraktikan cara membuat

    medium MS(Murashige & Skoog).

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    3/16

    BAB II

    TINJAUAN PUSTAKA

    2.1

    Macam

    Macam Media Untuk Kultur Jaringan

    Medium Dasar Murashige dan Skoog (MS) : digunakanuntuk hampir semua macam tanaman. Medium ini mempunyai

    konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa Ndalam bentuk NO3-dan NH4+.

    Medium dasar B5 atau Gamborg : digunakan untuk kultur

    suspensi sel kedele, alfalfa, legume lainnya.

    Medium dasar White : digunakan untuk kultur akar.

    Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasigaram-garam mineral yang rendah.

    Medium Vacin end Went (VW) : digunakan khusus untukmedium anggrek.

    Medium dasar Nitsch dan Nitsch : digunakan untuk kulturtepung sari(pollen) dan kultur sel.

    Medium dasar Schenk dan Hildebrandt : digunakan untuk

    tanaman monokotil.

    Medium dasar Woody Plant Medium : digunakan untuktanaman yang berkayu.

    Medium dasar N6 : digunakan untuk tanaman serealiaterutama padi (Daisy,1994).

    2.2 Komposisi Media MS serta Fungsinya

    a. Sumber Karbon

    Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secaraheterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesakebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke

    dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagipertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangununtuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan

    untuk tumbuh.Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 5% digunakan

    sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain sepertiglukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    4/16

    Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk

    menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakanlebih efisien oleh tanaman dalam kultur.

    b. Agar

    Umumnya jaringan dikulturkan pada media padatyang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau

    pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar

    yang digunakan berkisar antara 0.7 1.0%. Pada konsentrasitinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang

    tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agardengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganyatapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin

    mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatinkadangkadang digunakan pada lab komersial.

    Gel sintetis diketahui dapat menyebabkanhyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologisyang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk

    baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk inimerupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan

    kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problemvitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab denganmencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai

    agen pengental untuk 1 L media.

    c. pH

    pH media biasanya diatur pada kisaran 5.6 5.8 tapitanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda

    untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0,

    media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari5.2, agar tidak dapat memadat.

    d. Air

    Air distilata biasanya digunakan dalam kulturjaringan, dan banyak lab menggunakan aquabides (air destilataganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan

    air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan

    bahan organik dan non-organik pada media (Nugroho,1996).

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    5/16

    2.3 Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media

    1. Menyuci bersih peralatan dengan detergen dan membilas

    dengan air dan aquades.

    2.Membungkus peralatan dengan kertas coklat/Koran.

    3.Mengoven peralatan pinset, gunting, scalpel, jarum ose, danlain sebagainya selama 4 jam dengan temperatur 160oC.

    4.Memasukkan media ke dalam botol kultur dan menutupdengan kertas alumunium foil dan memanaskan selama 20-30

    menit dengan temperature 121oC dengan tekanan 17,5 psi.

    5.Mensterilkan bahan tanam dengan mencuci bersih,menggocok, direndam dengan air, dan kemudian membilas(Edi,2007)

    2.4 Jenis Kontaminasi Media

    Kontaminasi merupakan salah satu gangguan yangumum terjadi pada kultur jaringan. Menurut Santoso dan

    Nursandi (2003) tingkat kontaminasi media berbanding lurusdengan tingkat kekayaan unsur hara dalam media yaitusemakin diperkaya suatu media maka tingkat kontaminasinya

    juga semakin besar,demikian pula sebaliknya semakinsederhana suatu media maka tingkat kontaminasinya juga

    semakin kecil . Pada umumnya, kontaminasi karena jenis

    media disebabkan karena kontaminasi mikroorganisme darilingkungan luar dan yang berasal dari eksplan. Oleh karena

    itu, jika mikroorganisme dari lingkungan luar dan eksplantidak ada maka tidak akan terjadi kontaminasi media dan

    eksplan. Adapun sumber-sumber kontaminan menurut Santosodan Nursandi (2003) dapat berasal dari :

    a) Udara : kontaminan yang ada di udara dapat berupa

    spora bakteri atau cendawan dan umumnya banyak

    terdapat pada daerah yang berkelembaban tinggi.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    6/16

    b) Bahan tanam (eksplan) : untuk eksplan yang berasal

    dari tanah umumnya lebih banyak mengandung bahankontaminan dibanding eksplan yang ada di permukaan

    atau pucuk. Kontaminan yang berada di permukaaneksplan dapat dibersihkan menggunakan air dan

    larutan pensteril. Sedangkan untuk kontaminan yangberasal dari dalam eksplan ditangani denganpenggunaan antibiotika.

    c) Manusia atau pekerja : kontaminan yang berasal darimanusia dapat terbawa melalui pakaian yang

    dikenakan, anggota badan dan pernapasan.d) Alat-alat yang digunakan : kontaminan dapat berasal

    dari peralatan yang digunakan dalam kegiatan

    penanaman karena proses sterilisasi yang kurangsempurna sehingga kontaminan masih melekat dalam

    peralatan.e) Aquades (air steril)

    Menurut Gunawan (2007) untuk mengurangikontaminasi yang berhubungan dengan media maka sebaiknya

    menggunakan media MS. Kontaminasi sangat beragammulai dari jenis kontaminannya (bakteri, jamur, virus, yeast,kapang),waktu terjadinya kontaminasi (cepat, dalam hitungan

    jam; sedang, dalam hitungan hari; lambat, dalam hitunganminggu dan bulan), dan apa yang terkontaminasi (media atau

    eksplan).Jenis kontaminasi ada dua yaitu kontaminasi eksternal

    dan kontaminasi internal. Kontaminasi eksternal dapat

    disebabkan oleh jamur dan bakteri, sedangkan kontaminasiinternal umumnya disebabkan oleh bahan eksplan itu sendiri.

    Untuk mengatasi kontaminasi internal dapat digunakan HgCl2karena dapat menurunkan laju kontaminasi bakteri internaltanpa merusak jaringan. Selain itu juga dapat dilakukandengan penggunaan fungisida, HgCl2 dan klorin karenadengan penggunaan kombinasi bahan sterilan tersebut

    merupakan upaya sterilisasi berlapis untuk mereduksi resiko

    kontaminasi baik yang berasal dari cendawan, bakteri maupunkotoran-kotoran lain yang menempel pada permukaan

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    7/16

    eksplan.Sedangkan untuk pencegahan kontaminasi eksternal

    dapat dilakukan dengan sterilisasi kontak (Gunawan, 1987).

    2.5 Ciri-Ciri Media yang Sesuai untuk Pertumbuhan

    Eksplan

    Ciri ciri media yang baik untuk media kultur yaitu

    menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber

    vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengaturtumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa,

    ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan

    juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk

    tanaman.

    Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentukgaram-garam anorganik. Pada umumnya biasa diberikan

    dalam komposisi tertentu seperti komposisi media MS, WPM,

    B5, White, dan lain-lain tergantung dari jenis tanaman yang

    akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah

    vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid, vitamin B6

    (pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan sebagai

    antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik,

    yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin,

    alanin, dan threonin.

    Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam

    pembutan media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    8/16

    suatu persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1

    mM) dapat merangsang, menghambat atau mengubah polapertumbuhan dan perkembangan tanaman.Dalam kultur

    jaringan ZPT penting: sitokinin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP,Thidiazuron), auksin (IAA, NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T,

    Dicamba, Picloram). Kedua ZPT ini mempunyai fungsimasing-masing yang berbeda, sitokinin mempengaruhi

    pembelahan sel serta pembentukan organ seperti pucuk dan

    pembentukan embrio somatik. Auksin dipakai untukmenginduksi, pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara

    auksin dan sitokinin berfungsi untuk menginduksipertumbuhan kalus. Selain auksin dan sitokinin digunakanjuga giberelin(menginduksi pemanjangan tunas dan

    perkecambahan embrio, dan menghambat pengakaran) danretardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas) seperti

    pachlobutrazol.Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media

    sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawaorganik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrakragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber

    energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakansumber karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanamanumumnya), glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan

    arang aktif berfungsi untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawafenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar.

    Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut,media yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal

    yaitu 5,5-5,8. selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril.

    Autoclave sering dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatanmedia kultur jaringan. (Skoog & Miller, 1975)

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    9/16

    BAB III

    METODOLOGI

    3.1 Alat dan Bahan

    a. Alat :Gelas : untuk tempat mencampur bahanStirer : untuk mengaduk larutan secara cepatMicrowave :untuk mensterilkan,

    glatilisasi/pengentalanStopwatch : untuk mengatur waktu

    Botol Kultur : untuk tempat media MSPlastik : untuk menutup botol kultur

    Autoclave : untuk mensterilkan berbagai macam

    alat dan bahan yang digunakandalam mikrobiologi menggunakan

    uap air panas bertekanan

    Pipet : untuk mengambil cairan

    Timbangan : untuk menimbang bahan

    b. bahan

    1. Aquades : untuk membersihkan alat yang

    digunakan2. Sukrosa : sebagai sumber energi

    utama/cadangan makanan

    3. Agar (swallow) : untuk memadatkan media MS agarmudah menanam eksplan

    4. UnsurMakro

    NH4NO3

    KNO3 Sebagai pembuat 300 ml

    MgSO47H2O media kultur larutan makro

    KH2PO4

    CaCl22H2O : Untuk media kultur 3 ml

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    10/16

    5.UnsurMikro A

    H3BO3 Untuk pembuatan 300 ml

    MnSO44H2O media kultur diambil 3 ml

    ZnSO47H2O

    6. UnsurMikro B

    KI

    Na2MoO47H2O Untuk pembuatan 300 ml

    CuSO45H2O diambil larutan 0,3 ml

    CoCl6H2O

    7. FeEDTA

    FeSO47H2O Untuk pembuatan 300 ml

    Na2EDTA diambil larutan 3 ml

    8. Vitamin

    TiaminHCl

    PeridoksinHCl Untukpembuatan 300ml

    AsamNikotinat diambil 0,3 larutan vitaminOlycine

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    11/16

    3.2 Cara Kerja

    Bilas gelas dengan aquades

    Isi gelas dengan aquades 50 ml

    Tambahkan unsur yang sudah distok

    (Makro 30ml, Mikro A 3ml, Mikro B 0,3ml, FeDTA 3ml,Vitamin 0,3ml, CaCl2 3ml)

    Tambahkan aquades hingga 300ml

    Stirer + ukur pH

    pH terlalu asam ( 5,5), ditambah NaOH

    pH terlalu basa ( 5,8), ditambah HCl

    Masukkan sukrosa dan agar

    Sukrosa 9 gram

    Agar 2,1 gram

    Stirer

    Microwave selama 5 menit (1500C)

    Tuangkan kebotol kultur (tutup plastic)

    Autoclave

    3.3 Analisa PerlakuanDalam praktikum bioteknologi pertanian dalam materi

    pembuatan media ms perlakuan yang kami lakukandiantaranya yang pertama adalah mempersiapkan alat dan

    bahan. isi gelas tersebut dengan aquades sebanyak 50 ml.

    Tambahkan unsur makro yang telah disiapkan. Unsur-unsurmakro itu diantaranya yaitu Makro,Miko A,Mikro B,FE

    EDTA,Vitamin dan CaCl2.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    12/16

    Pemberian unsure ini diberikan dengan menggunakan

    pipet.Kemudian tambahkan aquades hingga 300 ml. stirer danukur ph nya.Masukkan sukrosa dan agar secara bertahap dan

    hati-hati. Lakukan pengadukan dengan stirrer. Kemudianmasukkan kedalam microwave selama 5 menit.Dan tuangkan

    kedalam botol kultur, diamkan sampai agar mulai mengerasdan masukkan ke dalam autoclave.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    13/16

    BAB IV

    HASIL DAN PEMBAHASAN

    4.1 Pembahasan

    Pada praktikum pembuatan media kultur, kamimenggunakan menggunakan media murashige dan skoog.Menurut (Hendaryono, 2014) Media Murashige dan Skoogmerupakan perbaikan komposisi media skoog terutamakebutuhan garam anorganik yang mendukungpertumbuhanoptimum kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung

    40 mMN dalam bentuk NO3 dan 29 mNN dalam bentukNH4+.Keistimewaan media MS menurut (Wetter dan

    Constabel, 1991) yakni kandungan nitrat, kalium danamoniumnya yang tinggi. Senyawa anorganik yang penting

    untuk pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan ada yangmikro dan makro.Unsur hara makro yang dibutuhkan adalah

    N,P,K Ca, Mg, S dan CHO serta unsur mikro yang

    dibutuhkan, adalah iodine (I), boron (B), mangan (Mn), zinc(Zn), molybdenium (Mo), tembaga (Cu), kobalt (Co), dan besi

    (Fe).Vitamin yang banyak digunakan adalah thiamin,

    piridoxin, dan asam nikotinat. sedangkan suplemen organikyang biasa digunakan adalah asam amino, peptone, ekstrakmalt, dan ekstrak khamir. Zat pengatur tumbuh yang diberikan

    dalam media tergantung kebutuhan kultur. Hal-hal lain yangpenting dalam media adalah komposisi agar, pengaturan pH,

    dan air (Yuwono 2008).Komposisi media yang digunakan tergantung dengan

    jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan

    biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula,

    dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan jugabervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantungdengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Zat

    pengatur tumbuh yang diberikan dalam media MS adalah

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    14/16

    auksin (IAA) dan sitokinin (kinetin). Kedua homon ini

    mempengaruhi pertumbuhan akar, tunas, dan kalusberdasarkan keseimbangan konsentrasi dari kedua ZPT

    tersebut yang terkandung dalam media. Pada konsentrasi yanghampir tepat sama antara auksin dan sitokinin akan

    menghasilkan kalus. Apabila sitokinin lebih besar dari auksinakan menginduksi tunas, sedangkan konsentrasi auksin lebih

    besar dari sitokinin akan menginduksi perakaran yang lebi

    cepat (Trigiano and Gray 2000).Menurut Shintiavira,2012 bahwa pertumbuhan

    eksplan dipengaruhi oleh media kultur yang digunakan. Jenismedia kultur dan konsentrasi nutrisi berpengaruh terhadapkecepatan pertumbuhan in vitro pemajangan dan kualitas

    morfogenesisnya.Penggunaan media MS mempengaruhi pertumbuhan

    daun tercepat dibandingkan penggunaan alternative pupuk

    majemuk Hyponex dan Growmore. Proporsi nitrogen dan

    fosfor yang lebih tinggi pada media MS menyebabkan

    pertumbuhan jumlah daun terbanyak pada minggu ke -8.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    15/16

    BAB V

    PENUTUP

    5.1 Kesimpulan

    Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakantanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangattergantung pada jenis media. Media MS mengandung 40 mM

    N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. DanMedia MS inilah yang paling banyak digunakan untuk

    berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuanmedia MS.

    Dari praktikum yang telah dilakukan yaitu pembuatan

    media MS, hasil yangdi dapatkan adalah media berhasil dibuatdan dapat digunakan untuk menanam eksplan dalam

    praktikum kultur jaringan.

  • 8/10/2019 1.LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI-PEMBUATAN MEDIA.docx

    16/16

    DAFTAR PUSTAKA

    Daisy P. Dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta :Kanisius.

    Edi, syahmi., 2007, Penuntun Praktikum Kultur Jaringan

    Tanaman, Jurusan Biologi Fakultas Matematika danIlmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Medan,Medan.

    Gunawan, L. W., 1995, TeknikKulturIn Vitro

    DalamHortikultura.PT. PenebarSwadaya, Jakarta

    Nugroho, Arinto, Heru Sugito, 1996, Pedoman PelakasanaanTeknik Kultur Jaringan.Jakarta : Penebar Swadaya.

    Santoso U, Nursandi F. 2003.KulturJaringanTanaman.Malang:UniversitasMuhammadiya Malang Press.

    Skoog, F dan Miller, C.O. 1975.Chemical Regulation of

    Growth and Organ Formation in Plant TissueCultured In vitro.Symp.Soc. Exp. Biotech11: 118

    131