PENUNTUN PRAKTIKUMDASAR BIOTEKNOLOGI TANAMAN

DISUSUN OLEH:

DR. Ir. SUKENDAH, MSc.IR. PANGESTI N., MP.IR. MAKHZIAH, MP.

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGIAGROTEKNOLOGI, FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN”JAWA TIMUR

2014

YAYASAN KESEJAHTERAAN PENDIDIKAN DAN PERUMAHANUNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JATIM

FAKULTAS PERTANIAN-LAB. BIOTEKNOLOGI

Nama Mahasiswa : ……………………………………………………

N P M : ……………………………………………………

Semester/ Progdi : ……………………………………………………

Tahun Ajaran : ……………………………………………………

Gol / Kelompok : ……………………………………………………

Nilai Akhir : ……………………………………………………

KARTU TANDA PESERTA PRAKTIKUMPraktikum : Dasar Bioteknologi Tanaman

No MateriPraktikum

TanggalPraktikum

LaporanTanggal

NilaiAktifitas Laporan I II

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

Keterangan :1. Buku praktikum harap dibawa setiap praktikum2. Buku hilang tanggung jawab praktikan

Mengetahui,Ka.Lab. Bioteknologi

…………………………………

Pembimbing Praktikum

…………………………………

i

KATA PENGANTAR

Dengan mengucap syukur ke Hadirat ALLAH SWT, tim penyusun telahmenyelesaikan penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman. PenuntunPraktikum ini disusun dengan tujuan sebagai pegangan dan membantumahasiwa melakukan praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman.

Penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman ini dibuat atas dasarperubahan kurikulum mata kuliah Dasar Bioteknologi Tanaman yang sekarangbermuatan teknopreneurship. Beberapa mata praktikum disusun untukmenghasilkan produk dengan orientasi bisnis. Praktikum Dasar BioteknologiTanaman kali ini merupakan ajang praktek dan marketing bagi mahasiswauntuk berwirausaha di bidang bioteknologi tanaman. Mahasiswa harus mampumenghasilkan produk-produk kultur jaringan yang mempunyai nilai jual tinggi.Mahasiswa diberi bekal kemampuan teknik in vitro dan molekuler khususnyauntuk isolasi DNA. Setelah itu mahasiswa harus bisa mempraktekkan ilmu-ilmukultur jaringan dalam berbagai mata praktikum ini yaitu: Pengembangantanaman mini in vitro, Membangun sumber eksplan anggrek silangan,Mulptiplikasi dan aklimatisasi anggrek komersial, Mikroprogasi tanaman melaluiorganogenesis tidak langsung, dan Metode isolasi dna tanaman minipreparasi.

Tim penyusun menyampaikan terima kasih kepada RAM-IPB yang telahmemberi dukungan dana dalam perubahan kurikulum Dasar BioteknologiTanaman, termasuk penuntun praktikumnya. Tim Penyusun jugamenyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah memberimotivasim, dorongan dan bantuan dalam penyediaan referensi dalam penulisanpenuntun praktikum ini.

Saran dan tanggapan guna kesempurnaan materi dalam penuntunpraktikum ini sangat kami harapkan. Semoga penuntun praktikum ini dapatmembantu dan bermanfaat bagi pihak yang membutuhkannya. Terima kasih

Surabaya, Maret 2014

Tim Penyusun

ii

DAFTAR ISI

HalKATA PENGANTAR………………………………………………………… ii

DAFTAR ISI………………………………………………………………….. iii

TERMINOLOGI………………………………………………………………. 1

PERSYARATAN LABORATORIUM……………………………………….. 1

PRA-PRAKTIKUM/PERCOBAAN………………………………………..... 2

I. PENGEMBANGAN TANAMAN MINI (MINI PLANT) IN VITRO………… 8

II. MEMBANGUN SUMBER EKSPLAN ANGGREK SILANGAN………….. 11

III. MULTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK KOMERSIAL……….. 15

IV. MIKROPROPAGASI TANAMAN MELALUI ORGANOGENESISLANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG…………………………………… 20

V. ISOLASI DNA TANAMAN METODE MINI PREPARASI………………... 23

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………… 25

LEMBAR PENGAMATAN………………………………………………….. 27

iii

1

TERMINOLOGI

1. Aseptik Bebas dari mikroorganisme kontaminan2. Kalus Masa sel yang tidak berdiferensiasi membentuk organ dan

terbentuk karena pengaruh hormon tanaman pada level tertentu3. Etiolasi Tanaman yang memanjang dan berwarna kuning karena

kekurangan atau tidak menerima cahaya4. Eksplan Bagian dari tanaman yang digunakan sebagai sumber bahan

tanam in vitro5. Embriogenesis Embryogenesis adalah proses pembentukan dan

perkembangan embrio sampai menjadi biji yang siap untukberkecambah

6. BAP 6-Benzylaminopurine, salah satu hormon tanaman yangdigunakan untuk menstimulasi dan pembentukan tunas

7. IAA Indoleacetic acid, hormon tanaman untuk meningkatkanperpanjangan sel di bawah kondisi tertentu. Implikasi dari IAAadalah menstimulasi pembelahan sel dan pembentukan akar

8. IBA indole-3-butyric acid, salah satu auksin endogen9. In Vitro "di dalam kaca" adalah istilah yang dipakai untuk menyebutkan

kultur suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di dalamlaboratorium

10. NAA 1-Naphthalene acetic acid adalah salah satu auksin sintetik11. Organogenesis Kemampuan sel atau bagian tanaman untuk membentuk organ12. Totipotensi Kemampuan untuk membentuk tanaman utuh dari bagian kecil

tanaman (sel, jaringan, organ)13. 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), salah satu sintetik

auksin yang sangat kuat

PERSYARATAN LABORATORIUM

Ruangan Laboratorium- Laboratorium Bioteknologi Tanaman mempunyai ruangan-ruangan khusus yang

terpisah antara satu dan lainnya dengan tujuan tertentu, misalnya ruangan untukpersiapan media dan sterilisasi, ruangan untuk tanam dan ruangan untukpenumbuhan.

- Laboratorium Bioteknologi Tanaman juga dilengkapi dengan peralatan molekuleruntuk isolasi DNA tanaman. Ruangan untuk isolasi DNA masih menjadi satudengan ruangan persiapan media dan sterilisasi.

.Glassware

- Penggunaan glassware hanya untuk kepentingan kultur jaringan, bukan untukpenggunaan di lapang atau eksperimen lainnya. Bahan-bahan logam beracunakan terabsorbsi dalam glassware dan bisa menjadi problem untuk kultur in vitro

- Cuci glassware dengan detergen kemudian bilas dengan air kran- Sebelum digunakan bilas glassware dengan air aquadest

Air Aquadest- Gunakan air aquadest untuk semua prosedur kultur in vitro. Sebaiknya tidak

menyimpan air kran karena bisa menjadi sumber kontaminan.- Untuk keperluan sterilisasi dan inokulasi eksplan gunakan air aquadest steril

2

Bahan Tanam-Eksplan

- Tanaman yang digunakan untuk kultur in vitro harus sehat dan sedang aktiftumbuh. Tanaman yang sedang stres terutama stres air biasanya tidak akantumbuh dalam in vitro.

- Tanaman untuk sumber eksplan sebaiknya yang bebas hama dan penyakit sertakontaminan lainnya. Sebaiknya diperlakukan lebih dulu dengan meletakkan digreen house yang relatif steril atau disemprot dengan pestisida

- Untuk mendapatkan eksplan yang steril bisa dengan menggunakan benih yangdikecambahkan secara in vitro

Teknik Aseptik

- Yang paling penting untuk teknik aseptik adalah mencegah seranganmikroorganisme (kontaminan) selama proses pengkulturan. Bahan tanam(eksplan), peralatan, botol kultur, dan media harus dalam kondisi steril.

- Media dan peralatan bisa disterilkan dengan autoklaf tekanan 15 lbs/inch2(121°C) selama15 menit.

- Bahan-bahan hormon yang sangat labil terhadap suhu panas seperti GA3disterilkan dengan filter sterilization

- Inokulasi dan subkultur dilakukan di laminar flow hood yang dilengkapi denganpenyaring udara sehingga mikroorganisme tidak bisa masuk

- Bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi adalah etil alkohol, HgCl2

andNaOCl

Peralatan Laboratorium- Petridish: digunakan sebagai tempat peletakan potongan eksplan di LAF

sebelum dilakukan penanaman.- Botol Kultur: digunakan sebagai botol tempat ditanamnya eksplan.- Erlenmeyer: digunakan untuk menyimpan larutan stok.- Scalpel: digunakan untuk memotong eksplan.- Pinset: digunakan untuk menjapit eksplan- Aluminium Foil: digunakan untuk menutup botol kultur maupun untuk melindungi

larutan stok dari cahaya matahari secara langsung.

PRA-PRATIKUM/PERCOBAAN

Sebelum pratikum atau melakukan percobaan di laboratorium BioteknologiTanaman, maka beberapa hal yang perlu dipersiapkan adalah:

A. Sterilisasi Peralatan, Eksplan dan Tempat Kerja

1. Sterilisasi alat dan botol kultur2. Sterilisasi media3. Sterilisasi eksplan, eksplan disterilkan dengan bahan kimia seperti etil alkohol,4. Sterilisasi tempat kerja

Prosedur Sterilisasi:

1. Dengan pemanasan menggunakan autoklaf (Steam or Wet sterilization):

Sebagian besar sterilisasi alat dan media menggunakan autoklaf dengan suhuantara 115- 135

0C. Kondisi standard untuk sterilisasi dengan autoklaf adalah suhu

3

1210C dan tekanan sebesar 15 psi (pounds per square inch) selama 15 menit. Kondisi

ini berdasarkan keadaan yang dibutuhkan untuk membunuh mikroorganismetermophilik. Suhu 121

0C hanya dapat diperoleh pada tekanan 15 psi.

- Alat dan Bahan yang disterilisasi dengan autoklafBahan dan peralatan yang digunakan pada sterilisasi dengan autoklaf adalah:peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish, gelaspiala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel), aluminiumfoil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus, plastic seal.

a. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas ataualuminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutupterlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

b. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

c. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruhdalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelumdimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagaipembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alatsektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengankertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uapsukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

d. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertasmerang.

- Prosedur Kerja1. Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan

air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminiumfoil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpeldibungkus dengan kertas aluminium foil.

2. Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu120oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehinggatekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankanselama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.

4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untukmembuang uap air hingga tekanan 0 psi.

5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uapair. Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume danjenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menittergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Sterilisasi media yang terlalu lama dapat menyebabkan :1. Penguraian gula.2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

4

2. Dengan Sistem Filter

Beberapa zat pengatur tumbuh (hormon) seperti asam amino dan vitamin sangatlabil dalam kondisi panas dan akan rusak jika disterilisasi dengan menggunakanautoklaf. Sterilisasi hormon yang tidak tahan pemanasan atau vitamin dilakukan denganmenggunakan membran filter 0.22 μm to 0.45μm size.

3. Radiasi

Sterilisasi dengan sistem radiasi hanya bisa dilakukan di suatu area yangdilengkapi dengan sinar UV. Sinar UV biasanya digunakan untuk mensterilkan petridishatau pipet di dalam suatu lemari yang dilengkapi dengan sinar tersebut. Sinar UVdigunakan untuk membunuh organisme di dalam ruangan atau di area kerja (dalamlaminair) dan sinar ini dalam gelombang panjang tertentu bisa merusak mata dan kulit.

4. Laminar Airflow Cabinet:

Laminar Airflow Cabinet alat yang dipakai untuk menipulasi ruangan aseptik.Udara ditarik ke arah kipas elektrik dan melewati filter coarse kemudian melalui filterbakteri halus (HEPA-High Efficiency Particulate Air Filter). Dengan sistem kerja sepertiini, ruang kerja di dalam laminair bebas dari mikroorganisme. Sebelum dipakai ruangankerja di sterilkan dengan menyemprot alkohol 70%.

B. Membuat Larutan Stok Unsur Hara

Larutan stok adalah larutan media kultur yang dibuat dalam volume besar.Gunanya untuk efisiensi dalam pekerjaan pembuatan media, seperti menimbang bahan-bahan kimia yang berulang-ulang dan dalam skala kecil. Selain itu juga untuk menekanterjadinya kesalahan dalam penimbangan dan meningkatkan ketelitian dalampembuatan media kultur.

Larutan stok dikelompokkan sesuai dengan kebutuhan unsur hara tanaman, yaitu:

1. Larutan Stok Hara MakroKebutuhan unsur hara makro untuk embrio kelapa kopyor adalah:-NH4Cl : 535 mg/l-KNO3 : 2020 mg/l-MgSO4.7H2O : 247 mg/l-CaCl12.2H2O : 294 mg/l-KCl : 1492 mg/l-NaH2PO4.2H2O : 312 mg/l

Karena kebutuhannya banyak, biasanya stok makro dibuat untuk 10 kalikonsentrasi. Pembuatan yang lebih besar dikuatirkan akan terjadi pengendapan karenakepekatan yang tinggi.

Cara pembuatan larutan stok makro:a. Setiap unsur hara makro ditimbang setelah dikalikan 10:

Misal: NH4Cl = 535 x 10 = 5350 mg = 5.35 gKNO3= 2020 x 10 = 20200 mg = 20.2 gdst

5

b. Setiap bahan/unsur hara dimasukkan satu per satu ke dalam beaker glass 1000 mlyang telah berisi 700 ml aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti pengadukanagar bahan terlarut sempurna, baru disusul oleh bahan berikutnya.

c. Setelah bahan larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml dan diterakansampai volume satu (1) liter dengan ditambah aquadest.

d. Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label: Stok makro 10X,tanggal pembuatan, dan jenis media.

e. Untuk pembuatan media satu liter diambil 100 ml dari larutan stok hara makro

2. Larutan Stok Hara Mikro

Pembuatan stok hara mikro karena dibutuhkan dalam jumlah sedikit biasanyadibuat dalam konsentrasi besar, misal sampai 100x konsentrasi awal.Kebutuhan unsur hara mikro adalah:KI : 8.3 mg/lH3BO3 : 3.1 mg/lMnSO4.7H2O : 11.2 mg /lZnSO4.7H2O : 7.2 mg/lCuSO4.5H2O : 0.25 mg/lCoCl12.6H2O : 0.24 mg/lNaMoO4. H2O : 0.24 mg/lNiCl.6 H2O : 0.024 mg/l

Cara pembuatan larutan stok mikro:a. Setiap unsur hara makro ditimbang setelah dikalikan 100:

Misal: KI : 8.3 mg/l = 8.3 x 100 = 830 mg/l = 0.83 gH3BO3: 3.1 mg/l = 3.1 x 100 = 310 mg/l = 0.31 gDst.

b. Setelah selesai penimbangan setiap unsur,bahan/unsur hara dimasukkan satu persatu ke dalam beaker glass 1000 ml yang telah berisi 700 ml aquadest. Setiapmemasukkan bahan diikuti pengadukan agar bahan terlarut sempurna, baru disusuloleh bahan berikutnya.

c. Jika bahan sudah larut, larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1000 ml danditerakan sampai volume satu (1) liter dengan ditambah aquadest.

d. Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label: Stok makro 10X,tanggal pembuatan, dan jenis media. Botol yang berisi stok mikro dimasukkan direfrigerator.

e. Untuk pembuatan media satu liter diambil 10 ml dari larutan stok hara makro

3. Larutan stok vitamin

Sama seperti unsur hara mikro, kebutuhan vitamin juga sangat sedikit, sehinggabisa dibuat stoknya sampai 100 kali konsentrasi awal.

Kebutuhan vitamin bagi embrio kelapa kopyor adalah:Pryridoxine HCl : 0.05 mg/lThiamine HCl : 0.05 mg/lNicotinic Acid : 0.05 mg/lBiotin : 0.05 mg/lFolic Acid : 0.05 mg/lGlycine : 1.00 mg/l

Cara pembuatan larutan stok vitamin sama seperti larutan stok unsur hara mikro

6

4. Larutan Stok Besi/Iron

Besi adalah unsur hara mikro, tetapi larutan stoknya dibuat tersendiri terpisah darilarutan stok mikro. Sumber unsur iron didapatkan dari Fe2SO4.7H2O dan Na2EDTA.Larutan stok besi juga dibuat dalam konsentrasi besar, misl sampai 100x.

Kebutuhan unsur hara besi adalah:Fe2SO4.7H2O : 41.7 mg/lNa2EDTA : 55.8 mg/l

Cara pembuatan larutan stok besi:a. Unsur ditimbang seratus kalinya, yaitu:

Fe2SO4.7H2O : 41.7 mg/l x 100 = 4170 mg = 4.17 gNa2EDTA : 55.8 mg/l x 100 = 5580 mg = 5.58 g

b. Setelah ditimbang, kedua larutan dilarutkan secara terpisah. Larutan EDTAdipanaskan hingga 40-60C selama beberapa menit. Selanjutnya ke dalam larutanEDTA ditambahkan larutan Fe2SO4.7H2O dan diaduk merata.

c. Setelah tercampur sempurna larutan dibiarkan sampai mencapai suhu kamar (25C).Larutan dimasukkan dalam botol yang gelap dan diberi label. Larutan sebaiknyadisimpan di refrigerator.

d. Untuk membuat media kultur satu liter diambil 10 ml dari larutan stok besi.

5. Larutan Stok Zat Pengatur Tumbuh

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat essensial dalam mengatur pertumbuhankultur. Berbagai jenis ZPT yang digunakaan dalam kultur jaringan adalah: Auksin,Sitokinin, Giberellin, Zat Penghambat Tumbuh. ZPT yang sering dipakai adalah darigolongan auksin dan sitokinin. Umumnya ZPT hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit,sehingga larutan stok ZPT dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml.

Berikut ini diuraikan cara pembuatan larutan stok ZPT dari golongan auksin dansitokinin.

a. Larutan Stok Auksin (IAA, NAA, IBA, dan 2-4 D)Golongan auksin bereaksi asam pelarut: NaOH 1 N atau alkohol 40%Konsentrasi: 1 mg/ml, membuat 100 ml:

1. Timbang bahan 100 mg2. Tuang dalam beaker glass 100 ml yang berisi 70 ml aquadest3. Teteskan sedikit NaOH 1 N sambil diaduk4. Setelah larut merata, pindahkan ke labu takar 100 ml5. Tambahkan aquadest sampai volume 100 ml6. Pindahkan ke erlenmeyer 100 ml7. Beri label, tanggal pembuatan dan konsentrasi, tutup rapat dan simpan di dalam

refrigerator8. Volume pemakaian: 1 ppm = 1 ml per 1 L media

2 ppm = 2 ml per 1 L media

b. Larutan Stok Sitokinin (Kinetin, Adenin, Zeatin, BA, 2-iP)Golongan sitokinin merupakan reaksi basa pelarut: HCl 1 N dan pemanasanKonsentrasi: 1 mg/ml: 100 ml

1. Timbang bahan 100 mg2. Tuang dalam beaker glass 100 ml yang berisi 70 ml aquadest3. Teteskan larutan HCl 1 N sambil diaduk4. Panaskan sebentar hingga bahan-bahan benar-benar larut dan berwarna jernih

7

5. Pindahkan ke labu takar 100 ml dan tambahkan aquadest sampai volume 100 ml6. Pindahkan larutan ke dalam erlenmeyer 100 ml, tutup rapat dengan aluminium

foil7. Beri label, tanggal pembuatan dan konsentrasi, kemudian simpan dalam

refrigerator8. Volume pemakaian: 1 ppm = 1 ml per 1 L media

2 ppm = 2 ml per 1 L media

Hal-hal yang harus diperhatikan pada larutan stok1. Larutan stok sebaiknya tidak disimpan terlalu lama, terutama vitamin dan ZPT. Oleh

karena itu pembuatan larutan stok harus diperhitungkan betul jumlah kebutuhannya2. Larutan stok yang telah mengalami perubahan, misalnya: ada pengendapan atau

terkontaminasi (ditumbuhi mikroorganisme) sebaiknya tidak digunakan lagi3. Semua alat-alat yang digunakan untuk membuat larutan stok dibilas terlebih dahulu

dengan aquadest guna mencegah terkontaminasi dengan zat-zat lain yang tidakdiinginkan

4. Setiap larutan stok harus berlabel mengenai: tanggal pembuatan, jenis larutan stokdan kepekatan.

5. Untuk larutan stok yang bersifat labil seperti vitamin dan ZPT disimpan di dalamrefrigerator. Hindarkan larutan stok dari cahaya langsung, simpan dalam botol yangberwarna gelap.

8

I. PENGEMBANGAN TANAMAN MINI (MINI PLANT) IN VITRO

I.1. Pendahuluan1.1. Latar Belakang

Kemajuan teknik propagasi tanaman dengan cara in vitro telah memacuperkembangan ilmu tanaman dengan pesat. Propagasi tanaman in vitro kini bukanhanya sekedar bertujuan untuk perbanyakan tanaman pangan saja, namun telahmeluas kepada berbagai komoditi tanaman. Bahkan perkembangan metode propagasitanaman in vitro lebih banyak diterapkan terhadap tanaman non pangan, antara laintanaman hias dan tanaman obat-obatan.

Tanaman hias dibudidayakan untuk memenuhi kebutuhan akan keindahan dankenyamanan, serta sebagai sarana penyaluran hobi / kesenangan (to have fungrowing). Budidaya tanaman hias dengan metode kultur jaringan in vitro, selain untukmengembangbiakkan tanaman, juga sekaligus untuk memperoleh bibit tanaman yangunik dengan cara memanipulasi media dan lingkungan tumbuh in vitro.

Keunikan tanaman tumbuh di dalam sebuah wadah kaca, dapat menjadi dayatarik yang memiliki nilai jual. Tidak salah jika dikatakan bahwa kultur jaringan tanamanadalah: “… the art and science of multiplying plants in vitro.”

1.2. TujuanPraktikum bertujuan untuk membuat tanaman mini in vitro unik yang memiliki

daya jual.

I.2. Bahan dan Metode

2.1. Bahan Bahan tanaman (eksplan): shoot tip (tunas pucuk) tanaman Puring, ujung daun

muda tanaman Sansivera, tunas pucuk kastuba, dan daun Begonia Media padat dalam botol kultur: (MS+BAP), (MS+NAA) dalam botol kultur Sterilant (Alkohol, Larutan sublimat dan Bayclin) Aquadestilata

2.2. PeralatanAlat yang digunakan dalam praktikum ini adalah laminar flow cabinet, pisau

scalpel, pinset, botol kultur, lampu bunsen, gunting, petridish, hand sprayer, tisu, label.(Semua peralatan sudah disterilkan).

2.3. Metode

a. Sterilisasi eksplanEksplan berupa tunas pucuk (shoot tip) Puring sepanjang ± 5 cm, Daun muda

Sansivera dan Begonia, diambil dari tanaman di dalam Green House. Pemotongantunas dilakukan dengan menggunakan pisau atau gunting yang bersih dan tajam.

Tunas pucuk dicuci bersih di bawah air mengalir selama 15 menit, direndamdalam larutan deterjen selama 15 menit, kemudian direndam dalam larutan fungisida +bakterisida 2% selama 30 menit. Bilas hingga benar-benar bersih. Pembilasan terakhirdilakukan dengan menggunakan aquadest steril, kemudian ditiriskan.

Dilakukan pemotongan untuk memperkecil ukuran eksplan. Pemotongandilakukan di dalam LAF dalam kondisi aseptik.

Dilakukan sterilisasi bertingkat sebagai berikut:1) direndam dalam larutan alkohol 70% selama 15 menit,2) bilas dengan aquadest steril3) direndam dalam larutan sublimat (Hg2Cl2) 0.1% + 5 tetes Tween4) bilas dengan aquadest steril

9

5) larutan Clorox 20% selama 15 menit6) bilas dengan aquadest steril7) larutan Clorox 5% selama 15 menit8) celupkan dalam larutan Bethadine 50% selama 1 detik

b. Penanaman eksplan Penanaman dilakukan di dalam LAF yang telah disterilkan dengan sinar UV dan

dilap dengan larutan alcohol 70% eksplan yang telah disterilkan selanjutnya ditanam dalam botol kultur yang telah

berisi media tanam. Setiap botol diisi dengan 4 atau 5 eksplan Penanaman dengan menggunakan pinset yang senantiasa diterilkan dalam

larutan alcohol 90% dan dibakar pada lampu Bunsen. Mulut botol kultur diusahakan agar selalu dekat dekat lampu Bunsen Setelah penanaman, botol kultur segera ditutup kembali dan diberi label

c. Penumbuhan dan multiplikasi eksplan Eksplan dalam botol kultur disimpan dalam rak kultur di ruang inkubasi Dilakukan pengamatan visual eksplan setiap hari Dijaga agar suhu udara, kelembaban udara dan cahaya konstan Setelah eksplan tumbuh dan bertunas, dilakukan multiplikasi (pemisahan tunas)

dan ditumbuhkan dalam media tanam baru (sub kultur) Eksplan yang akan disubkultur diletakkan di petridish, kemudian segera ditanam

pada media sesuai perlakuan dengan menggunakan pinset setiap botol diisi satuatau dua eksplans, kemudian botol ditutup

Multiplikasi dilakukan sebulan sekali Eksplan yang telah berdaun lengkap dipindahkan (sub kultur) pada media untuk

perakaran.

d. PerlakuanSetiap jenis tanaman diperlakukan dalam beberapa komposisi media tanaman

sebagai berikut:

Tabel 1. Perlakuan Media Tanam

Media Puring Sansivera BegoniaPenumbuhan tunas MS+BAP 1 mg/L MS+BA 1 mg/L MS+BAP 0.2 mg/L

Sub kultur MS+BAP 3 mg/L MS+BAP 1 MS+BAP 0.4 mg/L

Perakaran MS+NAA 3 mg/L MS+NAA 0.4mg/L MS+NAA 0.2 mg/L

Aklimatisasi Pasir+kompos Pasir+Kompos Pasir+kompos

2.4. Pengamatan

a. Persentase pertumbuhan eksplan (%)Kultur dikatakan tumbuh adalah berwarna hijau, secara visual ukuran bertambah,

berat bertambah dan perubahan embriogenesis maupun morfogenesis. Persentasetumbuh dihitung tiap minggu dengan rumus:

10

Persentase tumbuh = Jumlah eksplan yang tumbuh x 100%Jumlah eksplan per perlakuan

b. Jumlah tunas (tunas)Dihitung jumlah tunas yang terbentuk dari setiap planlet yang dilakukan pada

akhir penelitian.c. Panjang tunas (cm)

Tinggi planlet diukur dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur daritempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi dilakukan pada akhirpenelitian.c. Jumlah daun (helai)

Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka sempurna darisetiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.d. Jumlah akar (helai)

Jumlah akar dihitung dari jumlah akar yang terbentuk dari leher akar pada setiapplanlet yang dilakukan pada akhir penelitian.e. Bentuk daun

Bentuk daun dilihat daun membulat atau melebar pada setiap planlet yangdilakukan pada akhir penelitian.f. Warna daun

Warna daun dilihat berwarna hijau, kuning atau perpaduan kuning dan hijau padasetiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.

I.3. Tugas Praktikuma. Setiap kelompok melakukan percobaan dengan satu jenis tanaman, dan setiap

mahasiswa menanam eksplan dalam 5 botol kultur (5 ulangan)b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada tanaman masing-

masing dan tanaman kelompoknyac. Membuat catatan pengamatan mingguan (Tabel 1 dan 2)d. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum

Tabel I.1. Pengamatan Pertumbuhan Eksplan

Tang-gal

Perlakuan /ulang

an

% eksplanberbentuk

kalus

%eksplanmembentuk

tunas

∑ tunasper

eksplan

% eksplanmati dan

terkontamin-asi

Penyebabkontaminasi

Table I.2. Pengamatan Visual

Perlakuan UlanganTanggal

11

II. MEMBANGUN SUMBER EKSPLAN ANGGREK SILANGAN

II.1. Pendahuluan

1.1. Latar BelakangPada dasarnya tanaman anggrek merupakan tanaman yang sulit untuk

melakukan penyerbukan sendiri, sehingga perkembangbiakannya pun cukup sulit.Selain itu, biji yang kecil, tidak mengandung cadangan makanan dan kulit yang sangatkeras serta tebal membuat tanaman anggrek sulit ditumbuhkan tanpa bantuan manusia,kecuali anggrek yang tumbuh liar di hutan. Untuk mengatasi hal tersebut danmenumbuhkan anggrek secara masal, maka tindakan yang bisa dilakukan adalahdengan mengawinkan anaman anggrek (dapat sekaligus memperoleh varietaspersilangan yang baru). Perbanyakan anggrek pada umumnya dilakukan dengan caraperkecambahan biji secara in-vitro (Young et.al., 2001 dalam Rianawati dkk., 2009),sehingga hasil yang diperoleh tidak seragam dan menghasilkan warna bunga yangberagam (Rianawati, dkk. 2009). Setelah membentuk buah dan berbiji, makapenumbuhan bijinya dilakukan secara in-vitro hingga menjadi tanaman yang siapditanam di area terbuka untuk berproduksi atau dipasarkan.

Sebelum melakukan kultur jin vitro anggrek, kegiatan yang pertama harusdilakukan adalah memilih bahan induk anggrek yang akan diperbanyak. Bahan indukanggrek ini merupakan sumber eksplan yang akan dikultur. Bahan induk anggrek bisadiperoleh melalui persilangan dalam satu atau antar spesies. Persilangan memerlukanindukyang mempunyai sifat-sifat unggul sehingga perpaduan dari sifat-sifat tersebutakan muncul pada hasil persilangan. Hasil persilangan berupa buah yang mengandungpuluhan biji anggrek hibrida.

Penyilangan anggrek sebagai sumber eksplan dilakukan dengan cara memilihinduk jantan dan betina yang mempunyai sifat-sifat unggul, seperti ukuran bunga, warnadan bentuk bunga. Agar penyilangan berhasil, sebaiknya dipilih induk betina yangmempunyai kuntum bunga yang kuat, tidak cepat layu atau gugur, mempunyai tangkaiputik dan bakal buah yang lebih pendek agar tabung polen (pollen tube) dapat denganmudah mencapai kantong embrio yang terdapat pada bagian bawah bakal buah.Pencatatan nama kedua induk yang disilangkan sangat penting agar tidak merusak tatanamanya.

1.2. Tujuan

Tujuan dari Praktikum ini adalah : Mahasiswa dapat membangun sumber eksplan anggrek hasil silangan Mahasiswa mampu melakukan persilangan pada tanaman anggrek Mahasiswa tanda-tanda keberhasilan maupun kegagalan dalam persilangan

anggrek

II.2. Bahan dan Metode

2.1. BahanBahan tanaman anggrek yang berbunga putih, merah, kuning dan ungu. Label,

cotton bud atau tusuk gigi.

2.2. PeralatanAlat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spidol, pensil, loupe,

pinset/jarum oase.

12

2.3. Metode

a. Kenali bagian-bagian dari bunga anggrek seperti yang tertera pada GambarII.1. berikut ini:

Gambar II.1. Bagian-bagian bunga anggrek termasuk putik dan polen yang sangatpenting untuk proses persilangan

b. Tahap Persiapan Persilangan

- Pemilihan tanaman induk: pilih induk betina ( putik) dan induk jantan (sumberpolen/serbuk sari)

- Pemilihan karakteristik induk: Catat karakter induk jantan dan induk betina →jenis/spesies, bentuk bunga, warna bunga (bila memungkinkan ambil gambar/fotoinduk jantan dan induk betinanya)

- Pengecekan kematangan putik dan polinia.Kuntum bunga yang akan disilangkansebaiknya yang sudah mekar selama3-4 hari.

Putik

Polenk

13

c. Tahap Persilangan

- Siapkan alat untuk mengambil polen/tepung sari: jarum, cotton bud, atau tusukgigidibersihkan atau disterilkan

- Kuntum bunga induk betina dipilih yang bernomor ganjil dihitung dari pangkalbatang. Sementara untuk bunga induk jantan bisa dipilih yang mana sajaasalkan masih segar, sehat dan kuat.

- Ambil tepung sari dari bunga jantan dengan memakai cotton bud/jarum/tusukgigi. Tepung sari letaknya di pusat bunga berwarna kuning. Congkel perlahan-lahan tepung sarinya (Gambar II.2). Tepung sari akan melekat pada ujung jarum(Gambar II.3).

- Tempelkan/usapkan tepung sari ke putik pada bunga betina sampai menempelsempurna. Posisi putik persis di bawah kotak sari, yaitu suatu lekukan yangberlendir (Gambar II.4). Tepung sari dari induk bunga betina dibuang.

- Labellum dari induk bunga betina dibuang untuk mencegah serangga datang danmenempelkan tepung sari dari bunga lain.

Gambar II.5. Skema persilangan anggrek untuk sumber eksplan

Persiapan alat persilangan

Pengamatan

Labeling

Gambar II.4

Gambar II.3

Gambar II.2

14

- Tiap kelompok menyilangkan 3 macam anggrek dan diulang pada 3 bungaseperti yang tertera pada tabel berikut ini:

No. Induk Betina Induk Jantan Bunga 1(ulangan 1)

Bunga 2(Ulangan 2)

Bunga 3(Ulangan 3)

1.

2.

3.

d. Pengamatan

Dalam waktu 3-4 hari jika tangkai kuntum bunga induk betina masih segarberwana kehijauan, berarti persilangan berhasil. Sebaliknya jika kelopak dan mahkotabunga layu dan gugur berarti persilangan gagal.

- Tanda terbentuknya buah:1. Mahkota dan kelopak layu setelah diserbuki, tangkai bunga tetap segar2. Beberapa hari kemudian bakal buah mulai membesar3. Mahkota dan kelopak bunga mengering, bakal buah semakin membesar

Gambar II.6. Ciri-ciri bunga yang berhasil dalam persilangan sehinggamembentuk buah

- Pengamatan hasil persilangan

Tabel II.1. Tanggal dan keberhasilan dalam persilangan antar induk anggrek

No. TanggalPersilangan

Parent (Induk Betinax Induk Jantan)

% bunga yangjadi

Terbentuknyabuah

1.

2.

3.

Buah anggrek

15

III. MULPTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK KOMERSIAL

III.1. Pendahuluan1.1 Latar Belakang

Biji anggrek hasil silangan pada praktikum sebelumnya hanya memiliki embriodan tidak memiliki endosperm (cadangan makanan) sehingga tidak bisa disemaikandengan cara biasa. Umumnya biji anggrek disemaikan dengan cara in vitro pada mediabuatan yang berperan sebagai endosperm yaitu cadangan makanan bagi embrio untuktumbuh (Arditti, 1992). Di alam biji anggrek akan berkecambah apabila di tempatjatuhnya terdapat cendawan mycoryza. Hasil dari metabolisme mycoryza berupasenyawa-senyawa organik sederhana yang dimanfaatkan biji anggrek untukberkecambah dan tumbuh sebelum mampu memproduksi makanan sendiri. Embrioyang berkecambah membentuk protocorm yaitu struktur seperti corm (batang berlapis)berukuran sangat kecil, berwarna hijau dan dapat melakukan fotosintesis. Setelahsenyawa organik yang terbentuk mencukupi dalam protocorm, barulah tunas dan akarakan terbentuk (Wattimena et al., 1992)

Planlet anggrek yang diperoleh dari protocorm selanjutnya di multiplikasi dalammedia multiplikasi untuk mendapatkan anggrek dalam jumlah yang banyak. Setelahcukup dewasa anggrek dipindahkan dari botol kultur di dalam laboratorium ke pot yangada di screen house (aklimatisasi). Aklimatisasi anggrek tidak hanya sekali dilakukan,tetapi beberapa kali tergantung fase pertumbuhannya.

1.2 TujuanPraktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu:1. menanam biji anggrek hasil silangan dengan teknik in vitro2. melakukan subkultur planlet anggrek.3. melakukan aklimatisasi planlet anggrek dari botol ke compot.4. memelihara tanaman anggrek dengan baik dan benar selama di screen house.

III.2. Bahan dan Metode

2.1. BahanBahan utama yang digunakan pada praktikum ini adalah buah-buah anggrek

hasil silangan dan planlet Dendrobium, serta Phalaenopsis, media MS, dan agar.Bahan-bahan tambahan yang dibutuhkan yaitu alkohol 70%, aquades, spiritus, plastik,karet gelang, dan tisu.

Sedangkan bahan yang digunakan pada proses aklimatisasi yaitu bibit anggrek,arang sekam, sphagnum moss, serbuk pakis, cocopeat, dan fungisida.

2.2. PeralatanAlat-alat yang digunakan yaitu otoklaf, laminar air flow cabinet, neraca analitik,

botol kultur, bunsen, hand sprayer, pinset, cawan petri, labu erlenmayer, gelas piala,gelas ukur, pisau, corong, scapel, pengaduk kaca, pipet, labu takar, pH meter, dan kainpembersih. Sedangkan alat yang digunakan untuk proses aklimatisasi yaitu toplesplastik, pinset, baskom dan hand sprayer.

16

2.3. Metode

a. Penaburan benih/biji anggrek- Buah anggrek dipilih yang sudah matang, sekitar 3 bulan hingga 2 tahun setelah

penyerbukan tergantung pada jenisnya. Buah yang akan merekah dicirikan olehperubahan warna menjadi hijau kekuningan. Biji yang berwarna keputih-putihan dankosong adalah biji yang kurang baik. Biji yang baik yaitu bulat berisi, berwarna kuningatau kecoklat-coklatan.

- Sterilisasi buah/kapsul anggrek. Kapsul anggrek yang berisi puluhan biji disterilkandengan klorok 1.5% selama 15 menit. Setelah itu buah dibilas dengan aquadeststeril.

- Di dalam laminair air flow, kapsul dibakar sebentar di atas bunsen dan dibuka denganscapel. Biji-biji anggrek dikeluarkan dari kapsul dan diinokulasi pada media MS.

- Botol-botol kultur yang berisi media dengan biji-biji anggrek selanjutnya diletakkandalam ruang penumbuhan dengan cahaya lampu.

b. Multiplikasi planlet

- Persiapan Planlet. Planlet anggrek yang digunakan berasal dari biji-biji anggreksilangan yang dikulturkan secara in vitro. Planlet dikeluarkan dari botol dandiletakkan pada cawan petri steril (Gambar III.1). Setiap planlet dipisahkan satupersatu dari rumpun menggunakan scapel.

- Penanaman planlet. Penanaman planlet pada seluruh media dilakukan di dalamlaminar air flow cabinet. Alat-alat, bahan atau tangan harus disterilisasi terlebihdahulu dengan menyemprotkan alkohol 70% ketika menanam. Penanaman planletdilakukan dengan menancapkan ke dalam media 2 planlet setiap botol.

Gambar III.1. Rumpun planlet yang akan dipisahkan menjadi satu planlet

- Pembesaran dan pemeliharan planlet. Pembesaran dan pemeliharaan planletdilakukan dengan menjaga keadaan lingkungan ruangan kultur yaitu memberikanpenyinaran lampu flourescent berintensitas cahaya 1000 lux pada rak kultur tempatbotol-botol diletakkan dan suhu ruangan diatur 20-25

oC. Kondisi ini terus berlangsung

selama 24 jam setiap hari.

17

c. Aklimatisasi

- Persiapan bibit dan mediaMedia tanam yang akan digunakan dicuci hingga bersih terlebih dahulukemudian direndam dalam fungisida 1 g/l selama 5 menit kemudian ditiriskan.Setelah itu masing-masing media dimasukkan ke dalam pot. Bibit yang akandigunakan dikeluarkan dari botol. Buka tutup botol, kemudian isi dengan air.Kemudian satu persatu bibit ditarik dengan kawat yang ujungnya dibentuk U, dandiusahakan akar keluar dulu (Gambar III.2). Apabila sulit dikeluarkan, botoldapat dipecahkan.

- Bibit dicuci bersih sampai media agar-agarnya hilang, kemudian dimasukkan bakyang berisi fungisida dan direndam beberapa menit. Bibit diangkat dan ditiriskandi atas nampan yang dialasi kertas atau tisu bersih (Gambar III.3).

Gambar III.2. Planlet anggrek dalam botol yang dikeluarkan untuk diaklimatisasi

Gambar III.3. Bibit anggrek yang sedang ditiriskan di atas nampan untuk dipindahkan kepot dalam proses aklimatisasi

18

- PenanamanPot komunitas (compot) diisi pecahan batu bata sebanyak 1/3 bagian bawah,arang pada lapisan tengah, dan lapisan atas diisi pakis. Bibit ditanam sedalam 1-2 cm. Dalam satu compot (diameter 15 cm) jumlah yang ditanam tidak lebih dari20 bibit.

Gambar III.4. Compot yang berisi bibit anggrek pada proses aklimatisasi

- PemeliharaanPot diletakkan pada tempat yang terkena sinar matahari pagi dan diberi naungan(bisa dengan paranet 35 %) (Iswanto, 2002). Pemeliharaan dilakukan denganpenyiraman 2 kali sehari, pemupukan menggunakan pupuk daun Vitabloom (30-10-10) 2 g/l satu kali seminggu dengan cara disemprotkan ke daun danpencegahan cendawan menggunakan Dithane M-45 berbahan aktif Mancozeb80% sebanyak 3 g/l 2 minggu sekali.

Gambar III.5. Proses aklimatisasi anggrek di pembibitan

- Pemindahan Tanaman dari Compot ke Single PotSetelah tanaman mencapai ketinggian 5 cm atau lebih sebaiknya bibitdipindahkan satu per satu ke single pot. Cara pengisian media dan penanamanbibit sama seperti pada compot (Iswanto, 2002).

- PemupukanPemupukan dilakukan melalui daun, caranya dengan penyemprotan Pemupukansebaiknya dilakukan pada pagi hari, antara pukul 07.00-09.00. Sehingga pupukyang diberikan tidak cepat menguap. Jika pupuk diberikan lewat media, yangdiambil oleh tanaman hanya yang larut dalam air saja dan yang langsung kontakdengan ujung akar. Sisanya akan terus berada dalam pot.

19

d. Pengamatana. Pembesaran planlet secara in vitro:1. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.2. Jumlah akar, dihitung saat akar mencapai 2 mm.3. Tinggi tunas, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal tunas hingga titik pertemuan

antara dua daun paling atas4. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang dari pangkal

hingga ujung daun.5. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian tengah daun.6. Panjang akar, diukur saat akhir pengamatan pada akar terpanjang dari pangkal

hingga ujung akar.

b. Aklimatisasi bibitPada proses aklimatisasi, peubah yang diamati yaitu:1. Persentase hidup, dengan membandingkan bibit hidup dengan bibit awal dikalikan

100%.2. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.3. Tinggi tanaman, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal hingga titik tumbuh tunas.4. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang dari pangkal

hingga ujung daun.5. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian tengah daun.

Contoh Tabel Pengamatan

Nama Anggrek :Tanggal Tranplanting :Jumlah awal :

∑ anggrek setelahtransplanting

∑ daun Tinggi tanaman Panjang daun

Minggu 1

Minggu 2

Minggu 3

Minggu 4

Minggu 1

Minggu 2

Minggu 3

Minggu 4

Minggu 1

Minggu 2

Minggu 3

Minggu 4

Minggu 1

Minggu 2

Minggu 3

Minggu 4

20

IV. MIKROPROGASI TANAMAN MELALUIORGANOGENESIS LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG

IV.1. Pendahuluan

1.1. Latar BelakangKultur jaringan (Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan tanaman

menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Juga merupakanmetode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas, sel, jaringan dan organ(daun, batang, akar, biji, bunga, buah) dan menumbuhkan dalam kondisi aseptik(Rahardja 1989). Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplanbisa berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda dan terdiridari sel-sel meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif membelah-belah dan apabiladikulturkan pada media tumbuh yang sesuai secara invitro, maka eksplan tersebut akantumbuh dan berkembang biak menjadi banyak (Nugroho dan Sugito 2004).Organogenesis merupakan proses pembentukan organ-organ tubuh. Untukmendapatkan tanaman utuh dengan kultur jaringan tumbuhan dapat melalui dua carayaitu organogenesis dan embriogenesis somatik (Karim 2006), secara langsung atau taklangsung melalui pembentukan kalus terlebih dahulu (George & Sherington 1984).

Organogenesis merujuk kepada proses yang menginduksi pembentukanjaringan, sel atau kalus menjadi tunas tanaman sempurna. Proses ini diawali olehhormon pertumbuhan benziladenin dan sitokinin lainnya, baik sendiri maupun dalamkombinasi dengan asam naftalasetat atau asam indolasetat dan kadang-kadang denganasam giberelat menyebabkan diferensiasi dan pembentukkan tunas.

Tanaman yang digunakan dalam praktikum ini adalah sirsak dan karet. BuahSirsak (Annona muricata L) adalah salah satu buah yang populer di Indonesia karenakasiatnya. Salah satunya adalah obat penyakit kanker. Buah sirsak mengandungbanyak karbohidrat, terutama fruktosa. Kandungan gizi lainnya adalah vitamin C, vitaminB1 dan vitamin B2 yang cukup banyak. Bijinya beracun, dan dapat digunakan sebagaiinsektisida alami, seperti juga biji srikaya. Sementara itu karet adalah tanamanperkebunan yang penting namun sudah lama tidak mengalami peremajaan ataudiregenerasikan.

Media yang digunakan adalah media dasar Murashige Skoog (MS) termasukmedia kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap dibandingkan media dasar lainnya,walaupun demikian perlu ditambah suplemen seperti air kelapa untuk mendorongpertumbuhan jaringan. Indeks keasaman (pH) media adalah 5,6. Komposisi dalammedia Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro, mikro, vitamin, gula, asam aminodan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk differensiasi sel (Gunawan 1995).

1.2. Tujuan

- Mahasiswa mampu melakukan mikropropagasi pada tanaman sirsak dan karet- Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis langsung pada tanaman sirsak

dan karet- Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis tidak langsung pada tanaman

sirsak dan karet

IV. 2. Bahan dan Metode

2.1. Alat dan bahan

21

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah laminar, pinset, pisau, botolsteril, gelas ukur, bunsen, silk, plastik, dan karet. Sedangkan bahan yang digunakanadalah biji sirsak dan karet, larutan fungisida dan bakterisida, larutan bayclin 5%, larutantween, alkohol 96%, alkohol 70%, dan media MS, Hormon BAP dan 2,4-D, aquadeststeril, label

2.2. Metode

- Menyiapkan bahan yang akan digunakan. Ambil biji sirsak dan karet (Gambar IV. 1)dan direndam dengan larutan fungisida 2 g/ml, dan bakterisida 2 g/ml selama 1 jam.Bilas dengan air mengalir selama 30 menit.

- Bawa kedalam laminar, sterilisasi dengan alcohol 70% selama 5 menit. Bilas denganaquades steril, kemudian merendam dengan bayklin 20% selama 10 menit. Bilasdengan aquades steril, kemudian rendam dengan bayklin 10% selama 5 menit. Bilasdengan aquades steril, kemudian rendam/gojok dengan bayklin 5% selama 20 menit.Terakhir bilas dengan akuades steril

Gambar IV.1. Biji sirsak dan karet yang akan dijadikan sumber eksplan

- Penanaman biji sterilBiji sirsak dan karet ditanam pada media MS dengan posisi tidur. Satu botol kultur tigabiji steril. Botol kultur diinkubasi pada ruang kultur.

- Induksi kalus dan tunasSetelah biji sirsak dan karet tumbuh menjadi bibit, ambil bagian kotiledon, hypokotildan internodia sebagai sumber eksplan. Tanam pada media untuk induksi kalus (MS ++BA 0.1 mg/l +2,4-D 1.0 mg/l) sedangkan untuk proliferasi kalus pindah ke mediaMS+BA 0.1 mg/ l +2,4-D 0.5 mg/l. Media untuk induksi tunas sirsak adalah MS + BA1.0-2 mg l–1 + NAA; 0.1 mg l–1. Botol kultur yang berisi eksplan sirsak dan karetselanjutnya diinkubasi pada ruang kultur yang dilengkapi dengan lampu inflourescent.

IV.3. Pengamatan

Tang-gal

Perlakuan /ulang

an

% eksplanberbentuk

kalus

%eksplanmembentuk

tunas

∑ tunasper

eksplan

% eksplanmati dan

terkontamin-asi

Penyebabkontaminasi

22

IV.4. Tugas Mahasiswa

a. Mahasiswa dibagi dalam 4 kelompok. Setiap kelompok melakukan percobaan dengansatu jenis tanaman (sirsak atau karet) dan satu metode mikropropagasi, yaituorganogenesis langsung atau tidak langsung

b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada tanaman masing-masing dan tanaman kelompoknya

c. Membuat catatan pengamatan mingguand. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum

No. Kelompok Mahasiswa Jenis Tanaman Jenis Mikropropagasi

1. Kelompok I Sirsak Organogenesis Langsung2. Kelompok II Sirsak Organogenesis Tidak langsung3. Kelompok III Karet Organogenesis Langsung4. Kelom[ok IV Karet Organogenesis Tidak langsung

23

V. ISOLASI DNA TANAMAN METODE MINIPREPARASI

V.1. PENDAHULUAN1.1Latar belakang

Deoxiribose Nucleic Acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung materigenetik dan berfungsi mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupansecara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Untuk analisisyang menggunakan DNA misalnya identifikasi kekerabatan, identifikasi dan pemetaangen, konservasi dan lain-lain, maka diperlukan isolasi DNA.

Kegiatan utama dalam isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenismolekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih beratakan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.Presipitasi bertujuan mengendapkan protein histon.

Isolasi DNA melalui beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, pelisisan dindingdan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap isolasijaringan adalah untuk mengisolasi jaringan sel, maka sel yang masih memilikikomponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yangtersisa hanya sel. Pelisisan dinding dan membran sel dilakukan dengan caramemberikan larutan pelisis sel yang merupakan larutan hipotonis. Purifikasi bertujuanuntuk membersihkan sel dari zat-zat lain yaitu dengan memberikan RNAse. Presipitasibertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagimenggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon sehingga DNA menjadi dapatdilihat dan diambil.

1.2 TujuanPraktikum bertujuan untuk dapat mengisolasi DNA tanaman dengan metode

minipreparasi.

V.2. BAHAN DAN METODE

2.1 Bahan:

1. Daun jagung, sengon, puring, tomat dan cabe2. Nitrogen cair3. Bufer lisis (0,2 M Tris-Cl pH 7,5; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl; 2% CTAB)4. Bufer ekstraksi (0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O).5. Bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl).6. TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0)

2.2 Alat:

1. Mortar dan pestel2. Tabung 1,5 µl3. Sentrifuse

2.3. Cara Kerja:

1. Ambil sampel daun sebanyak kurang lebih 1 gram kemudian digerus denganmenambahkan nitrogen cair 2 ml sampai halus dan dimasukkan tabung 1,5 ml danditambahkan buffer isolasi 750 µl . Inkubasi 1 jam dengan suhu 65º C. Tambahkan750 µl kloroform:isoamil (24:1) dan disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit.

24

2. Supernatan (cairan) diambil dipindahkan ke tabung 1,5 µl baru. Larutandiendapkan (presipitasi) dengan iso propanol dua kali jumlah volume. Homogenkandengan vortex dan disentrifus 10.000 rpm selama 10 menit.

3. Pelet diambil dan supernatan dibuang, kemudian dibilas dengan etanol 70%sebanyak 1 ml, dihomogenkan dan sentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit.

4. Supernatan diambil dan pelet dibuang, kemudian dikering anginkan.5. Tambahkan 50 µl TE.6. DNA disimpan pada suhu -200 C.

V.3. PENGUKURAN DNA

Pengukuran DNA dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara kuantitatif dankualitatif. Kedua cara tersebut dapat dilakukan dengan metode elektroforesis dandengan menggunakan spektrofotometer. Elektroforesis bertujuan memisahkan DNAberdasarkan ukurannya pada gel agarose yang dialiri listrik (Gambar 1), sedangkanpengukuran DNA dengan spektrofotometer berdasarkan absorbansi pada panjanggelombang 260 nm dan 280 nm.

Gambar 1. Visualisasi DNA hasil elektroforesis beberapa jenis tanaman

a. Konsentrasi DNA (µg/ml) = nilai absorb. 260 x 50 µg/ml x faktor pengenceran

b. Kualitas (kemurnian) DNA = absorbansi 260 = 1,7 – 2,0 (sangat baik).absorbansi 280

V.4. TUGAS MAHASISWA1. Setiap kelompok mahasiswa mengisolasi DNA tanaman yang berbeda.2.Tentukan kualitas dan konsentrasi DNA yang diperoleh dengan spektrofotometer.3. Bandingkan konsentrasi DNA tiap tanaman.4. Buat pembahasan maksud dan tujuan dari tiap perlakuan tahapan isolasi DNA dan

faktor – faktor yang mempengaruhi konsentrasi dan kualitas DNA.

25

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous, 2008. Report on of The Validation on” Dellaporta Derived”. Method for DNAExtraction from Ground Maize Grains and Seeds. CRF-GMFF: maize grains andseeds DNA Extraction

Ardiana, Wahyuni, Dwi. 2009. Teknik Pemberian Benzil Amino Purin Untuk MemacuPertumbuhan Kalus dan Tunas Pada Kotiledon Melon (Cucumis melo L.).Sumatera Barat. Buletin Teknik Pertanian Vol 14, No 2, 2009, hal 50-53.

CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s FirstTraining Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow.12(1):13-15.

George.E.F. And Sherrington.P.D. 1984. Plant Propagation by Tissue Cultures.Handbook and Directory of Commercial Laboratories. England: Exegeneticslimited.

Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Laboratorium Kutur JaringanPAU Bioteknologi IPB, Bogor. Hal: 252.

Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Jakarta: Direktorat JendralPendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Hal: 304.

Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies, and R. L. Geneve. 1990. Plant propagationprinciples and practices. 6th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs, N.J.

Kyte, L. 1990. Plants From Test Tubes. An Introduction to Micropropagation. Oregon:Timbers Press, Portland.

Moega, J.P. 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta: Erlangga.Hlm. 204-208.

Rout GR, Mohapatra A, Mohan Jain S. 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: Acritical review on present scenario and future prospects. BiotechnologyAdvances 24 (2006) 531–560. Available online at www.scienedirect.com

Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A laboratoryManual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA.

Santoso, Untung dan Nursandi, Fatimah. 2001. Kultur Jaringan Tanaman. Malang:Universitas muhammadiyah Malang (UMM Press).

Sarmast MK, Salehi M, Salehi H. 2009. The Potential of Different Parts of SansevieriaTrifasciata L. Leaf for Meristemoids Production. Australian Journal of Basic andApplied Sciences, 3(3): 2506-2509

Sudarmadji. 2003. Penggunaan Benzil Amino Purin Pada Pertumbuhan Kalus KapasSecara in vitro. Malang. Buletin Teknik Pertanian Vol 8, No 1, 2003.

Wattimena, G. A. 1992. Sitokinin, Bioteknologi Tanaman. Bandung: Pusat AntarUniversitas Institut Pertanian Bogor. Hal: 66-67.

Wijayani, Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.

26

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan: Cara memperbanyak tanaman secara efisien. AgroMedia Pustaka, Jakarta

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Kiat Mengatasi Masalah Praktis. Cara MemperbanyakTanaman Secara Efesien. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Yusnita, Pungkastiani W, Hapsoro D. 2011. In Vitro Organogenesis of Two SansevieriaCultivars on Different Concentrations of Benzyladenine (BA). Agrivita 33(2):147-153

Zulkarnain. 2009. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya Kultur Jaringan Tanaman.Jakarta: Bumi Aksara.

.

27

LEMBAR PENGAMATAN I

28

LEMBAR PENGAMATAN II

29

LEMBAR PENGAMATAN III

30

LEMBAR PENGAMATAN IV

31

LEMBAR PENGAMATAN V