penuntun praktikum bioteknologi pertanian · mengetahui dan mengerti materi dan prosedur kerja...

PENUNTUN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Oleh:

Prof. Dr. Ir. Barahima Abbas, M.Si Muhammad Dailami, S.Si, M.Si

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS PAPUA

MANOKWARI

2018

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur dipanjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan

hidayaNya, sehingga diktat penuntun praktikum Bioteknologi Pertanian ini dapat

diselesaikan. Penuntun praktikum ini disusun untuk memudahkan mahasiswa

mengetahui dan mengerti materi dan prosedur kerja praktikum yang akan dilakukan

dan sekaligus sebagai pedoman atau penuntun dosen dan asisten dalam memberikan

praktikum pada mahasiswa.

Penuntun praktikum ini memuat materi teknik isolasi mikro organisme yang

berfungsi sebagai pupuk biologis (Rhizobium dan Mikoriza), sterilisasi dan eliminasi

kontaminan, pembuatan media kultur (bakteri dan jamur) teknik isolasi DNA, teknik

polymerase chain reaction (PCR), dan Elektroforesis DNA

Ucapan terima kasih ditujukan pada Bapak Dekan dan Pembantu Dekan atas

kebijaksanaannya dalam memberikan dukungan untuk pembuatan penuntun

praktikum ini. Kepada semua pihak yang ikut terlibat dalam proses pembuatan

penuntun praktikum ini diucapkan terima kasih.

Disadari bahwa penuntun praktikum Pengantar Bioteknologi Pertanian ini

belum sempurna, maka segala saran dan kritik membangun, sangat diharapkan.

Manokwari, September 2018

Penyusun

i

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR…………………………………………………… i

DAFTAR ISI…………………………………………………………….. ii

TATA TERTIB PRAKTIKUM PRAKTIKUM PENGANTAR

BIOTEKNOLOGI TANAMAN…………………………………………. 1

Petunjuk Umum………………………………………………….. 1

Tata Tertib Laboratorium……………………………………… 1

PENGENALAN PRINSIP KERJA, CARA PENGGUNAAN DAN

BAHAYA YANG DAPAT DITIMBULKAN PERALATAN

UNTUK PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI……………. 2

Pendahuluan……………………………………………………… 2 Tujuan Praktikum...……………………………………………… 2 Peralatan Praktikum Pengantar Bioteknologi...………..…..… 3

STERILISASI PERALATAN KERJA DAN PEMBUATAN

AIR STERIL……………………………………………………………... 5

Pendahuluan……………………………………………………… 5

Tujuan Praktikum………………………………………………… 6

Alat dan Bahan....................................................................... 6

Prosedur Pelaksanaan Praktikum.…....………………………. 7

PEMBUATAN MEDIA UNTUK BAKTERI RHIZOBIUM.................... 9

Pendahuluan.......................................................................... 9

Tujuan Praktikum................................................................... 9

Alat dan Bahan...................................................................... 9

Prosedur Pelaksanaan Praktikum......................................... 9

ISOLASI RIZOBIUM DARI AKAR TANAMAN LEGUM........................ 11

Pendahuluan............................................................................. 11

Tujuan Praktikum...................................................................... 11

Alat dan Bahan......................................................................... 11

Prosedur Pelaksanaan Praktikum............................................ 11

ii

ii

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKORIZA............................................ 13

Pendahuluan............................................................................. 13

Tujuan Praktikum...................................................................... 13

Isolasi Spora FMA.................................................................... 13

Alat dan Bahan.............................................................. 13

Prosedur Pelaksanaan Praktikum.................................. 13

Identifikasi Spora FMA.............................................................. 14

Alat dan Bahan................................................................ 14

Prosedur Pelaksanaan Praktikum................................... 14

ISOLASI DNA TOTAL DENGAN DNeasy Plant Mini Kit...................... 15

Pendahuluan............................................................................... 15

Tujuan Praktikum........................................................................ 15

Alat dan Bahan........................................................................... 15

Prosedur Pelaksanaan Praktikum............................................... 15

ISOLASI DNA TANAMAN DENGAN MENGGUNAKAN

GENOMIC DNA MINI KIT………………………………………………….. 17

ISOLASI DNA TANAMAN DENGAN METODE CETAB........................ 19

Pendahuluan............................................................................... 19


Bahan dan Alat........................................................................... 19


ELEKTROFORESIS DNA PADA GEL AGAROSE................................ 24

Pendahuluan............................................................................... 24



DAFTAR PUSTAKA............................................................................... 27

iii

1

BAB I. TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

1.1. Petunjuk Umum

1. Praktikan harus datang 10 menit sebelum kegiatan praktikum dimulai

2. Praktikan yang terlambat 10 menit sesudah kegiatan praktikum dimulai

tidak diperkenankan mengikuti praktikum bila tidak dapat memberikan

alasan yang dapat diterima oleh koordinator praktikum

3. Praktikan harus bersikap sopan selama berada di lingkungan laboratorium

4. Praktikan diajurkan memakai jas praktikum, sopan, tidak diperkenankan

merokok, dan memakai sepatu di dalam laboratorium

5. Tas dan perlengkapan yang tidak relevan dengan kegiatan praktikum tidak

diperkenankan dibawah masuk ke dalam Laboratorium.

1.2. Tata Tertib Laboratorium

1. Praktikan wajib menjaga ketenangan dan ketertiban di dalam ruang

Laboratorium

2. Praktikan wajib mengikuti/mematuhi petunjuk atau bimbingan asisten,

pengasuh, atau pengawas praktikum

3. Praktikan harus bekerja dengan hati-hati dan sesuai dengan prosedur

yang telah ditentukan. Bila praktikan lalai kemudian memecahkan alat-

alat gelas atau merusak peralatan yang ada, maka yang bersangkutan

wajib mengganti atau memperbaikinya

4. Menghubungkan peralatan ke sumber listrik baru dapat dilakukan setelah

mendapat persetujuan dari asisten atau pembimbing praktikum

5. Jika ada kelainan dengan peralatan, praktikan hendaknya segera

melaporkan pada asisten atau koordinator praktikum

6. Setelah selesai melakukan kegiatan praktikum, alat-alat dibersihkan dan

disusun rapi kembali seperti semula.

2

BAB II. PENGENALAN ALAT, PRINSIP KERJA, DAN BAHAYA YANG DAPAT DITIMBULKAN

2.1. Pendahuluan

Laboratorium yang ideal untuk Pengantar Bioteknologi Pertanian

adalah laboratorium yang memiliki: 1) Ruang persiapan yang di dalamnya

terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven,

pH meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer,

gelas piala, batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk

mencuci (washtaple), lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse,

fumehood, destilator, dan kereta dorong. 2) Ruang transfer yang di

dalamnya terdapat laminar airflow cabinet, dissecting, mikroskop, alat

diseksi (scalpel, pinset, spatula, gunting, dan jarum), pilter millipore,

handsprayer, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, timbangan kecil,

dan elektrofusion chamber. 3) Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak

kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC

untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker. 4) Ruang

stok yang di dalamnya dilengkapi dengan rak penyimpanan media. 5)

Ruang mikroskop atau ruang analisis yang di dalamnya dilengkapi dengan

mikroskop, gelas preparat dan penutup, dan mikrotome.

Peralatan yang mutlak harus dimiliki untuk memulai melakukan

kegiatan Bioteknologi Pertanian yaitu: timbangan analitik, destilator, pH

meter, autoklaf, laminar airflow, dan gelas-gelas standar. Peralatan yang

kemungkinan dapat menimbulkan resiko pada pemakainya atau

menimbulkan kerusakan bila salah prosedur dalam mengoperasikan

diuraikan berikut ini:

2.2. Tujuan Praktikum

Diharapkan setelah mahasiswa melakukan kegiatan praktikum ini,

mahasiswa dapat menggunakan peralatan Bioteknologi Pertanian secara

terampil serta mengetahui dengan jelas fungsi dan cara kerja dari masing-

masing peralatan.

3

2.3. Macam-macam Alat

1. Timbangan Analitik

Sebelum menimbang suatu bahan yang penting diperhatikan adalah:

1) kapasitas timbangan. Timbangan analitik yang ada di Laboratorium

Bioteknologi memiliki kapasitas maksimum 300 gram. Untuk keperluan

melebihi 300 gram dimohon tidak menggunakan timbangan analitik karena

dapat menyebabkan kerusakan timbangan. 2) Water pas. Water pas

timbangan harus selalu berada di dalam lingkaran indikator timbangan. Bila

melakukan penimbangan pada saat water pas tidak berada pada posisi yang

sebenarnya, maka pembacaan angka digital yang ditampilkan tidak akurat.

Cara mengoperasikan yaitu pertama-tama kabel listrik timbangan

dihubungkan dengan sumber arus listrik, kemudian tombol on ditekan dengan

pelan-pelan. Stelah itu tombol sero ditekan agar timbangan menunjuk angka

nol baru bahan yang akan diukur beratnya diletakkan di atas wadah obyek

timbangan. Supaya bahan yang ditimbang akurasinya tinggi, maka setiap kali

pembacaan angka digital yang ditampilkan timbangan jendela atau pintu kaca

dari timbangan harus ditutup. Setelah selesai menggunakannya kabel listrik

yang menghubungkan timbangan dengan sumber arus listrik harus

dilepaskan.

2. pH meter

Berbagai jenis pengukur pH yang dapat digunakan untuk menetapkan

pH media seperti kertas lakmus dan pH meter digital. Pengukuran pH media

sebaiknya menggunakan pH meter digital supaya pengukuran atau

penetapan angka pH yang dikehendaki dapat dilakukn dengan tepat.

Prosedur penggunaan pH meter digital yaitu pertama-tama kabel pH

meter dihubungkan dengan sumber listrik kemudian pengaturan suhu diset

sesuai dengan suhu ruangan, selanjutnya pH meter dikaliberasi dengan cara

membuka penutup plastik detektor dan mencelupkan detektor pada pH

standar (larutan yang sudah diketahui dengan pasti pHnya) sambil memutar

tombol kaliberasi sampai angka digital pada pH meter menunjukkan angka

sesuai dengan pH larutan standar. Misalnya larutan standar memiliki pH 7

maka angka pembacaan pada pH meter digital harus disesuaikan atau

ditetapkan sama dengan 7.

4

Kesalahan dalam penetapan pH untuk pembuatan media tumbuh

merupakan kegagalan pada semua kegiatan selanjutnya. Akurasi pengukuran

pH media merupakan syarat mutlak yang harus dilakukan untuk keberhasilan

kegiatan Bioteknologi Pertanian yang dilakukan. Setelah pH meter selesai

digunakan, detektor harus dibilas dengan air bersih kemudian ditutup kembali

dengan plastik penutup ujung detektor. Selanjutnya detektor diletakkan

kembali pada tempatnya dan kabel listrik dilepas dari sumber arus listrik.

3. Destilator

Kegiatan Bioteknologi Pertanian mutlak harus menggunakan air

destilasi atau air suling ( air yang bebes dari mineral organik dan an oraganik)

supaya kebutuhan tanaman akan hara organik dan an organik dapat

ditetapkan sesuai dengan kebutuhannya. Untuk itu, destilator merupakan alat

yang vital untuk melakukan kegiatan Bioteknologi Pertanian .

Prinsip kerja destilator yaitu air dipanaskan kemudian terbentuk uap

air. Uap air dialirkan melalui wadah pendingin sehingga uap air mengalami

kondensasi atau pengembunan. Titik air yang terbentuk melalui proses

kondensasi ditampung pada wadah tertentu. Air hasil tampungan itu disebut

air destilasi. Mengapa air destilasi bebas dari mineral organik dan an

organik?. Jawabannya adalah mineral organik dan an organik yang terlarut

dalam air tidak dapat menguap bersama dengan dengan uap air, sehingga

pada proses penguapan terjadi pemisahan anatara zat-zat terlarut dan uap air

menyebabkan uap air yang mengalami kondensasi membentuk air kembali

adalah air murni atau air yang bebas dari mineral organik dan an organik.

Cara mengoperasikan destilator yang ada di Laboratorium Bioteknologi

adalah pertama-tama kabel listrik disambungkan dengan sumber arus listrik

dan selang air pendingin disambungkan dengan kran sumber air. Setelah air

di dalam tangki pemanasan mendidih atau terbentuk uap air, baru air

pendingin dialirkan dan diatur secukupnya saja agar tidak terlalu boros dalam

penggunaan air. Selanjutnya selang yang dilalui air kondensasi dihubungkan

dengan wadah penampungan air destilasi (jerigen). Selama penyulingan

berlangsung, harus dijaga terus menerus karena dapat menyebabkan

destilator terbakar apabila tiba-tiba aliran air pendingin macet atau habis dari

tempat penampungan. Aliran air pendingin, di samping berfungsi sebagai

5

kondensator uap air juga berfungsi mensuplai air ke dalam tangki

pemanasan. Bila aliran air pendingin macet menyebabkan air di dalam tangki

habis diuapkan dan menyebabkan terjadinya kebakaran pada elemen

destilator dan kerusakan destilator, serta dapat menyebabkan kebakaran di

Laboratorium.

4. Autoklaf

Autoklaf mutlak harus dimiliki untuk melakukan kegiatan Bioteknologi

Pertanian karena media dan semua peralatan yang digunakan harus dalam

keadaan aseptik (steril). Autoklaf terdiri atas berbagai macam tipe dan model.

Laboratorium Bioteknologi memiliki autoklaf model horizontal dan vertikal.

Model vertikal teridiri atas dua tipe yaitu tipe yang tidak dilengkapi dengan

timer dan tipe yang dilengkapi dengan timer (pengatur otomatis). Fungsi

autoklaf adalah mensterilkan peralatan dan media yang akan digunakan

untuk menumbuhkan berbagai macam mikro organisme.

Prinsipnya adalah memadukan tekanan tinggi dan suhu tinggi

sehingga tidak ada mikro organisme yang lengket diperalatan dan media

mampu bertahan hidup setelah disterilisasi dengan menggunakan autoklaf.

Sterilisasi peralatan diperlukan waktu yang agak lama yaitu satu jam dan

sterilisasi media diperlukan waktu yang singkat yaitu 30 menit setelah

tekanan autoklaf mencapai satu atmosfir (atm).

Prosedur penggunaan autoklaf yaitu sebelum alat atau media

dimasukkan ke dalam autoklaf terlebih dahulu harus diperiksa airnya. Posisi

air di dalam autoklaf yaitu rapat pada dandangan (plat) penahan beban. Jika

air kurang ditambahkan sampai mencapai atau rapat dengan permukaan

bawa dandangan. Autoklaf yang digunakan dalam keadaan air kurang akan

menyebabkan elemen pemanas autoklaf mengalami kerusakan. Regulator

pengatur tekanan tidak boleh diubah atau digeser karena akan menyebabkan

autoklaf meledak dengan sangat hebat dan menghancurkan semua yang ada

disekitarnya. Katup pembuangan udara ditutup setelah terbentuk butiran uap

air didekat lubang pembuangan udara. Setelah katup pembuangan udara

ditutup, Indikator tekanan mulai bergerak menuju tekanan yang telah

ditentukan. Saat jarum autoklaf mencapai tekanan 1 atm maka regulator

pembuangan udara bekerja membuang kelebihan tekanan yang ditandai

6

dengan hembusan uap air keluar. Saat regulator tekanan mengeluarkan uap

air saat itulah mulai dihitung waktu autoklaf yang diperlukan (30 menit untuk

media dan 60 menit untuk alat-alat).

5. Mikropipet

Penggunaan alat yang tidak sesuai dengan prosedur dapat

menyebabkan kerusakan pada alat tersebut dan juga hasil yang diperoleh

tidak sesuai dengan kenyataan. Untuk menghindari terjadinya kerusakan

akibat kesalahan operator (Human eror), maka setiap peserta praktikum yang

akan menggunakan peralatan diharuskan mengikuti penjelasan dan arahan

dari teknisi laboratorium. Penguasaan cara menggunakan alat-alat tersebut

merupakan kunci keberhasilan dalam pemanfaatan teknik biologi molekuler

dalam penelitian di bidang sains lainnya. Oleh karenanya, mahasiswa dituntut

untuk dapat mengetahui prinsip kerja, cara penggunaan dan juga bagaimana

mengatasi permasaahan yang timbul dari setiap alat-alat yang ada.

Penelitian dalam bidang biologi molekuler selalu berhubungan dengan

molekul DNA yang berukuran kecil tidak kasat mata. Hal ini menuntut teknik

pengerjaan yang detail dan se-seteril mungkin. Bahan-bahan yang digunakan

merupakan bahan kimia dengan tingkat kemurnian sangat tinggi (bioteknologi

grade), sehingga harganya sangat mahal. Sebagai akibatnya, teknik biologi

molekuler selalu menggunakan volume/jumlah yang sangat sedikit, yakni

pada skala mikroLiter. Oleh karenanya, pada percobaan ini peserta

praktikum selain dikenalkan dengan perlatan laboratorium juga akan dibekali

dengan teknik sterilisasi dan penggunaan pipet mikro yang merupakan alat

dasar yang selalu digunakan.

Pipet mikro merupakan alat pemipet pada skala mikro yang banyak

digunakan dalam teknik biologi molekuler. Laboratorium Bioteknologi

memiliki beberapa set pipet mikro dengan berbagai ukuran, yaitu 2,5 µL, 10

µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL dan multichannel pipet yaitu pipet dengan 8

chanel pemipetan atau 8 tips sekaligus. Setiap pipet mikro memiliki batas

minimal dan maksimal jumlah larutan yang dapat dipipet. Untuk menghindari

kerusakan pipet, penggunaan pipet hanya boleh dilakukan dalam batasan

range minimal dan maksimal tersebut. Pipet 200 µL, memiliki batas minimal

20 µL dan batas maksimal 200 µL, pipet tersebut hanya boleh digunakan

5

7

untuk mengambil larutan dengan range antara 20-200 µL, tidak boleh kurang

dari 20 µL ataupun lebih dari 200 µL.

6. Mesin Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pemakaian mesin PCR di daerah yang aliran listrinya tidak stabil

disarankan menggunakan Stablizer agar mesin PCR lebih awet. Mesin PCR

sebelum digunakan terlebih dahulu disetting programnya dengan berpatokan

pada buku Manual. Program yang disetting adalah suhu denaturasi, suhu

annealing, suhu ekstensi dan jumlah siklus yang diinginkan yaitu antara 30-40

siklus.

Mesin PCR pada prinsipnya adalah mesin yang mampu menaikkan

dan menurunkan suhu cambernya dalam waktu singkat sehingga proses

8

denaturasi DNA, annealing, dan ekstensi dapat berjalan sesuai dengan waktu

yang telah ditentukan. Mesin PCR juga sering disebut termocycling karena

berfungsi mengatur irama perbahan dari suhu tinggi (92-95 oC) pada proses

denaturasi DNA ke suhu sedang (antara 35-65oC), tergantung dari primernya

pada proses annealing (penempelan primer pada template DNA) kemudia

diubah ke suhu sekitar 70-75 oC pada proses sintesis utas ganda DNA.

Prose terbentuknya utas ganda DNA (Double Strand DNA) pada template

DNA yang berkesesuaian dengan primer disebut satu siklus. Selanjutnya utas

ganda DNA yang terbentuk mengalami proses denaturasi, annealing, dan

ekstensi untuk siklus yang ke dua. Proses itu yang berlangsung antara 30-40

siklus, tergantung dari kebutuhan. Conoh salah satu mesin PCR yang

bermerek Biorad sebagai berikut:

8. Alat elektroforesis

Alat elektroforesis horisontal yang banyak digunakan untuk pemisahan

fragmen DNA menggunakan gel agarose. Gel agarose sebagai fase padat

yang berfungsi sebagai medium mobilitas fragmen DNA dan buffer

eletroforesis sebagai fase cair yang berfungsi mengantarkan muatan listrik,

sehingga memungkinkan fragmen DNA bisa bermigrasi dari posisi tertentu ke

posisi yang berlawanan dengan muatan elektromagnetik DNA. DNA memiliki

muatan elektromagnetik yang bersifat negatif sehingga jika diberi aliran listrik

menyebabkan fragmen DNA bermigrasi atau bergerak dari kutub negatif ke

kutub positif. Fragmen DNA yang berukuran lebih kecil bermigrasi lebih cepat

dibanding dengan fragmen DNA berukuran lebih besar. Fragmen DNA yang

bergerak paling jauh dari posisi loading (sumur) adalah fragmen DNA dengan

ukuran pasang basa (bp) paling kecil. Kemampuan gel agarose untuk

memisahkan fragmen DNA sangat terbatas yaitu hanya mampu memisahkan

fragmen DNA yang berukuran minimal 100 bp. Ukuran fragmen DNA yang

9

lebih kecil (puluhan basa) tidak dapat dipisahkan dengan menggunakan gel

agaros. Metode yang dapat digunakan untuk memiahkan fragmen DNA yang

lebih adalah dengan menggunakan polyacrilamid. Contoh alat elektroforesis

dengan menggunakan gel agarose disajikan berikut ini.

9. Digital Dry Bath

Digital Dry Bath (DDB) berfungsi sebagai water bath pada proses

ekstraksi DNA dengan skala kecil. Prinsip kerjanya yaitu memanaskan sel-

sel yang terdapat dalam ependorf tanpa membuat ependorfnya meleleh atau

mengalami kerusakan. Jaringan sel-sel yang telah dihancur dan ditempatkan

ke dalam ependorf bersama dengan larutan pereaksinya mengalami

pemanasan membuat sel-sel menagalami proses yang disebut lisis yang

memungkinkan DNA yang terdapat di dalam inti sel dapat terpisahkan.

10

10. Sentrifus

Kegiatan ekstraksi DNA mutlak diperlukan sentrifus yang berkecapatan

tinggi yaitu antara 8000-12000 rpm. Prinsip kerja sentrifuse yaitu putaran

dengan kecepatan tinggi memungkinkan sel-sel yang telah mengalami lisis

dan pemecahan sel dapat dipisahkan DNAnya dari komponen penyusun sel

lainnya (dinding sel, membran sel, protein, dan komponen penyusun sel

lainnya). Hal yang sangat penting diperhatikan dalam menjalankan sentrifus

adalah keseimbangan beban bahan yang disentrifuse. Ependorf yang

dimasukkan sentrifus harus memiliki volume yang sama dan diletakkan

seimbang pada semua sisi. Penempatan ependorf yang tidak seimbang pada

semua sisi dapat menyebabkan rotor sentrifus mengalami kerusakan dan

tidak dapat digunakan lagi.

11. Fortex

Fortex diperlukan untuk kegiatan ekstraksi DNA yaitu saat mencampur

Jaringan yang telah dihaluskan dengan larutan preaksi di dalam ependorf.

Ependorf yang telah berisi sel-sel tanaman atau hewan yang akan diisolasi

DNAnya perlu difortex agar tercampur merata dan terjadi reaksi yang

sempurna. Reaksi yang sempurna memungkinkan untuk mendapatkan DNA

dalam jumlah yang maksimal. Contoh Fortex yang tersedia di Laboratorium

Bioteknologi Unipa, disajikan pada gambar berikut ini.

11

12. Alat Iluminator

Alat iluminator berfungsi untuk fisualisasi DNA yang telah mengalami

elektroforesis. Alat ini dapat kita menentukan ukuran fragmen DNA dan

kualitas DNA hasil ekstraksi. Prinsip kerja alat ini adalah lampu ultraviolet

dari alat membuat fragmen DNA yang telah disisipi dengan Etedium Bromida

(EtBr) memancarkan sinar sehingga fragmen-fragmen DNA dapat terlihat

dengan ukuran yang bervariasi. Saat menggunakan alat ini perlu hati-hati

dan tunggu instruksi dari asisten karena alat iluminator memancarkan sinar

ultra violet (UV) yang dapat menyebabkan kerusakan mata bila terpapar

secara langsung. Lensa kamera juga bisa mengalami kerusakan kalau

mengambil foto gel tanpa penutup pengaman. Contoh alat iluminator yang

tersedia di Laboratorium Bioteknologi sebagai berikut.

12

BAB III. STERILISASI ALAT DAN PEMBUATAN AIR STERIL

3.1. Pendahuluan

Peralatan yang digunakan seperti pinset, scalpel, gunting, petridish,

dan botol kultur disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 1,2

kg/cm2 pada suhu 120 oC selama 60 menit untuk mematikan semua mikro

organisme yang kemungkinan ada melekat pada permukaan alat. Kegiatan

ini sangat menentukan keberhasilan Praktikum Bioteknologi Pertanian karena

peralatan kerja yang steril akan memperkecil kegagalan yang mungkin terjadi

akibat adanya kontaminan. Selain sterilisasi alat-alat (gunting, scalpel, dan

pinset) dengan menggunakan autoklaf, juga dilakukan sterilisasi pada saat

akan menggunakan (melakukan kegiatan kultur) dengan memanaskan pada

lampu sepritus selama beberapa detik.

Setiap kali akan melakukan kegiatan kultur atau transfer kultur dari

media yang satu ke media yang lain diperlukan air steril untuk mencegah agar

pada saat persiapan eksplan dilakukan pada wadah petridish tidak

mengalami kekeringan. Peralatan seperti pinset, gunting dan scalpel yang

baru disterilkan dengan pemanasan pada lampu sepritus dicelupkan terlebih

dahulu pada air steril sebelum memegang (menghandle) eksplan yang akan

dikulturkan agar eksplan tidak terbakar akibat dari pinset yang panas.


Setelah menyelesaikan kegiatan praktikum ini mahasiswa diharapkan

dapat mengetahui langkah awal yang harus dilakukan untuk melakukan

kegiatan Praktikum Bioteknologi Pertanian dan dapat membedakan antara

steril dan bersih serta dapat membedakan antara air destilasi (air yang bebas

mineral dan senyawa organik) dengan air steril.

3.3. Alat dan bahan

Autoklaf

Detergen

Air pencuci

Air destilasi

13

Destilator

Air destilasi

Aluminium foil atau plastik tahan panas (penutup botol)

Kertas

3.4. Prosedur Pelaksanaan Praktikum

1. Semua alat yang akan disterilkan terlebih dahulu dibersihkan dari sisa-sisa

agar atau jaringan tanaman. Selanjutnya dicuci bersih dengan

menggunakan detergen kemudian dibilas dengan air bersih dan dikering

anginkan atau menggunakan oven.

2. Autoklaf yang akan digunakan disiapkan terlebih dahulu dengan

memasukkan air secukupnya ke dasar autoklaf (sampai batas plat

penyangga).

3. Alat kultur (pinset, gunting, scalpel dan petridish) yang telah kering

dibungkus dengan kertas baru dimasukkan ke dalam autoklaf. Botol kultur

disterilkan dengan cara meletakkan botol kultur di dalam autoklaf pada

posisi tertelungkup.

4. Air steril dibuat dengan cara mengisi botol-botol kultur dengan air destilasi

sebanyak ¾ dari ukuran botol (botol dibiarkan kosong ¼ bagian) kemudian

ditutup dengan aluminium foil atau plastik tahan panas baru dimasukkan

ke dalam autoklaf.

5. Setelah semua alat dan bahan yang akan disterilkan selesai dimasukkan

ke dalam autoklaf , selanjutnya autoklaf ditutup dan dikancing. Kancing-

kancing dikencangkan dengan cara mengencangkan kancing secara

bersamaan dengan kancing pada posisi yang berseberangan (kancing

yang tegak lurus satu sama lain dikencangkan secara bersamaan).

Selanjutnya kabel autoklaf dihubungkan dengan sumber arus listrik.

Pengatur waktu distel (diset) ke posisi angka 60 bagian lingkaran luar

pengatur waktu autoklaf (berarti autoklaf dilakukan selama 1 jam). Katup

pembuangan udara dikendorkan dan tunggu sampai terlihat ada butir-butir

uap air yang keluar baru katup ditutup atau dikencangkan kembali dan

pengatur waktu mulai bekerja.

14

6. Setelah autoklaf berlangsung satu jam (jarum indikator penunjuk waktu

berada pada posisi angka nol) dan alarm autoklaf berbunyi sebagai tanda

bahwa autoklaf telah selesai. Lepasakan kabel listrik autoklaf dari sumber

aruslistrik dan biarkan autoklaf dingin. Bila alat-alat yang diautoklaf

segera akan digunakan, katup pembuangan udara boleh dibuka sedikit

secara perlahan untuk mempercepat terjadinya pendinginan dan

penurunan tekanan. Sebelum jarum indikator penunjuk tekanan menunjuk

posisi angka nol, kancing autoklaf tidak boleh dibuka.

15

BAB V. PEMBUATAN MEDIA UNTUK BAKTERI RHIZOBIUM

5.1. Pendahuluan

Rizobium adalah bakteri penambat nitrogen yang berasosiasi dengan

tanaman legum. Peranan bakteri rizobium sebagai penambat nitrogen belum

optimal karena belum banyak dikembangkan dan diproduksi sebagai pupuk

biologi. Rizobium perlu dikembangkan agar penggunaan pupuk kimia pada

tanaman legum dapat dikurangi untuk meningkatkan produksi tanaman

legum. Media untuk bakteri merupakan formulasi dari semua unsur-unsur

yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri. Media yang

digunakan adalah berbahan dasar nutrient broth yang diformulasikan khusus

untuk mendukung perkembangan dan pertumbuhan bakteri rizobium.


Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui cara pembuatan

media tumbuh bakteri rizobium dan melatih mahasiswa membuat media untuk

menumbuhkan rizobium

5.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah : timbangan analitik, gelas piala 1000 ml,

spatula, hot plate + magnetik stirer, autoclaf, dan botol kultur.

Bahan yang digunakan adalah : nutrient broth 6,5 g, bacto agar 5 g, aquades

500 ml, aluminium foil, kertas indikator.


1. Timbang bahan yang akan digunakan yaitu : nutrien broth dan agar

bacto sesuai dengan ukuran yang diinginkan.

2. Siapkan gelas piala tambahkan air 200 ml. Masukkan nutrient broth

aduk

3. pH ditetapkan 7,4. Bila pH diatas 7,4 maka ditambahkan HCl 1 N dan

bila pH dibawah 7,4 apabila belum mencapai 7,4 makan perlu

ditambahkan beberapa tetes NaOH 1N.

16

4. Apabila pH telah sesuai, maka tambahkan bacto agar , setelah itu

tambahkan air sampai volumenya mencapai 500 ml. Nyalakan hot

plate dan biarkan sampai mendidih. Jangan lupa tutup gelas piala

dengan menggunakan aluminium foil.

5. Setelah mendidih tuang kedalam wadah, lalu dituang ke masing-

masing gelas kultur dengan ukuran 20-30 ml tutup dengan aluminium

foil.

6. Sterilkan di dalam autoclaf selama 20 menit pada suhu 121 ° C

7. Keluarkan dari dalam autocla/f kemudian letakkan di ruangan inkubasi.

17

BAB VI. ISOLASI RIZOBIUM DARI AKAR TANAMAN LEGUM

6.1. Pendahuluan

Rizobium merupakan bakteri yang mampu mengikat N2 dengan

membentuk bintil akar pada famili leguminoceae. Taksonomi rizobium yang

terbaru (Desember 2006) membagi rizobia ke dalam 12 Genus dan 57

species. Genus rizobium yang telah ditemukan yaitu Rizobium yang teridiri

atas 16 species, Mesorizobium yang terdiri atas 10 species, Sinorizobium

(enzifer) yang terdiri atas 13 species, Bradirizobium yang terdiri atas 5

species, Azorizobium yang terdiri atas 2 species, Metylobacterium satu

species, Burkholderia yang terdiri atas 5 species, Cupriavidus satu species,

Devosia satu species, Herbaspirilum satu species, Okrobaktrum satu species,

dan Filobakterium satu species.

6.2. Tujuan

Tujuan praktikum ini adalah untuk melatih dan meningkatkan

keterampilan mahasiswa melakukan isolasi bakteri rizobium dari nodul akar

legum.

6.3. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah : petridish, pinset, tusuk gigi, cutter, korek api,

pembakar spritus, laminar air flow. Bahan yang digunakan adalah : media

nutrient broth, nodul dari kacang tunggak, spirtus, alkohol 95 %, air steril.


1. Nodul dipilih yang terbaik (segar dan paling besar).

2. Amati bentuk nodul (bulat, oval, lonjong, dan caraloid)

3. Nodul disterilisasi menggunakan alkohol 95 % selama 1 menit

kemudian diletakkan dalam air steril.

4. Nodul dilewatkan pada nyala api.

5. Nodul diletakkan pada petridish.

6. Nodul dibelah menjadi 2 bagian

7. Nodul yang telah dibelah, tusuk pada tusuk gigi (jangan menyentuh

pinggiran luar dari nodul).

18

8. Ujung tusuk gigi digoreskan pada media yang telah disiapkan.

9. Inkubasi pada ruang kultur

10. Amatilah pertumbuhan rizobium setiap hari.

19

BAB VII. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKORIZA

7.1. Pendahuluan

Mikoriza adalah suatu bentuk hubungan simbiose mutualisme antara

fungi (mykes) dan perakaran (rhiza) tumbuhan tingkat tinggi. Mikoriza

pertama kali ditemukan pada tahun 1885 oleh A.B. Frank. Berdasarkan

cara infeksinya terhadap tanaman inang maka mikoriza dikelompokkan ke

dalam lima golongan yaitu Ektomikoriza, Endomikoriza, dan

Ektendomikoriza, Pseudomikoriza, dan mmikoriza vesikula arbuskula.

Peranan mikoriza pad ekosistem adalah meningkatkan ketersediaan hara

dan kemampuan tanaman menyerap air melalui perluasan jangkauan

permukaan akar dengan adanya hyfa yang terbentuk dari mikoriza.



keterampilan mahasiswa melakukan isolasi mikoriza, mengenal mikoriza dan

mampu mengidentifikasi jenis spora mikoriza.

7.3. Isolasi spora fungi mikorhiza arbuskula (FMA)

7.3.1. Alat dan Bahan

Alat yang diperlukan yaitu satu set penyaring spora (sieve) berukuran

500 µm, 250 µm, 125 µm, 63 µm, dan 45 µm, backer 500 ml dan 1000 ml,

erlenmeyer 100 ml, dan 200 ml, cawan petridish, pinset spora, deckglass, dan

cover glass, mikroskop binokuler, timbangan analitik, hotplate, gunting,

kamera untuk dokumentasi. Bahan yang diperlukan untuk isolasi spora FMA

yaitu sukrosa, dan air destilasi.

7.3.2. Prosedur Pelaksanaan Praktikum

Sampel tanah diambil dari berbagai macam vegetasi tumbuhan

Sampel tanah ditimbang sebanyak 50 – 100 gram

Sampel tanah dimasukkan ke dalam gelas piala 500 atau 100 ml dan

ditambahkan larutan sukrosa 60% sebanyak 100 – 200 ml

20

Campuran tanah dengan larutan sukrosa diaduk selama 10 menit

Supernatan (larutan bagian atas) dituang ke dalam saringan spora

dengan ukuran paling besar sampai dengan ukuran yang paling kecil

Partike-partikel yang tertahan pada saringan paling halus dipindahkan

ke cawang petridish dengan cara menyemprotkan air dari botol

semprot

Amati spora yang terjaring di dalam petridish

Catat bentuk spora, ada tidaknya assesory pada spora, dan warna

spora

7.4. Identifikasi spora FMA

7.4.1. Alat dan Bahan

Alat yang diperlukan yaitu: cawan petridish, pinset spora, deckglass,

dan cover glass, mikroskop binokuler, timbangan analitik, gunting, kamera

untuk dokumentasi. Bahan yang digunakan untuk identifikasi spora FMA

yaitu: larutan polyvenil alkohol lacticacid glycerol (PVLG), larutan meltzer’s,

KOH 10 %, tinta Quink, cuka, aquades dan cat kuku.


Spora diangkat dengan menggunakan pinset spora

Spora diletakkan pada objek glas yang telah ditetesi aquades, larutan

PVLG dan Meltzer’s

Masing-masing tetesan PVLG dan Meltzer’s diletakkan 10 spora

Spora dibiarkan 3 – 5 menit dalam tetesan larutan PVLG dan Meltzer’s

kemudian ditutup dengan cover glass.

Objek glass diletakkan pada mikroskop dan diamati jenis spora yang

ada

21

BAB VIII. ISOLASI DNA GENOM

8.1. Pendahuuan

Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam teknik biologi molekuler.

Proses isolasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam

metode, diantaranya yaitu metode phenol chloroform, freeze dan thawing,

resin pengkhelat (chelex), kromatografi dan juga menggunakan kit-kit

komersial. Beberapa kit komersial yang bisa digunakan untuk isolasi DNA

yaitu kit isolasi DNA yang diproduksi oleh perusahaan seperti Qiagen,

Promega, Geneaid, Invitrogen dll.

Pemilihan metode isolasi, jenis sel yang akan digunakan sebagai

sumber DNA merupakan factor utama yang harus diperhatikan. Metode yang

digunakan untuk mengisolasi DNA dari tumbuhan akan sedikit berbeda

dengan metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari sel hewan,

maupun bakteri. Kit isolasi yang tersedia pun berbeda, beda. Meskipun

demikian, prinsip dasarnya tetap sama. Hanya saja metodenya disesuaikan

dengan masing-masing jenis sel nya.

Isolasi asan nukleat (DNA) merupakan persyaratan mendasar untuk

melakukan karakterisasi genom dan mapping yang mencakup penggunaan

marker genetik serta juga melakukan rekayasa genetik atau ”genetic

engineering”. Tingkat kemurnian dan kualitas DNA diperlukan untuk

pembuatan genomik DNA library, sekuensing gen tanaman, marker genetik

yang lain seperti RAPD, SSR, RFLP, dan cpSSR.

22

Secara umum, tahapan dalam isolasi DNA baik dari tumbuhan, hewan

maupun mikroba, dapat dibagi menjadi 3 tahap utama, yaitu: Pemecahan sel,

Pemisahan dan Pemurnian.

8.1.1. Pemecahan Sel (Lisis Sel)

Pemecahan sel ini bertujuan untuk dapat mngeluarkan DNA yang

berada pada bagian inti sel maupun DNA yang terdapat dalam mitokondria.

Tahap ini dapat dilakukan dengan berbagai metode asalkan DNA yang ada

tidak mengalami kerusakan. Pemecahan sel dapat dilakukan dengan cara

fisik (menggunakan suhu, gelombang suara/ sonikasi, pengggerusan),

secara kimia (menggunakan SDS/sodium dodesil sulfat, detergent, EDTA,

CTAB dll), dan secara enzimatis (menggunakan lisozim, Proteinase K,

Lipase dll). Untuk mnghindari rusaknya DNA yang akan di ambil selama

23

proses pemecahan sel, maka tahap ini harus dilakukan dalam buffer lisis

yang dapat mempertahankan keutuhan dan struktur dari DNA.

8.1.2. Pemisahan

Pemisahan DNA dari debris-debris atau sisa sisa bagian sel yang telah

dihancurkan, dapat dilakukan dengan menggunakan metode sentrifugasi

maupun dengan cara kolom kromatografi. Dengan teknik sentrifugasi, semua

senyawa yang tidak di inginkan seperti polisakarida, lipid maupun protein

akan terpisah sesuai dengan berat molekulnya setelah disentrifugasi dengan

kecepatan tinggi. Molekul yang berat seperti protein, polisakarida akan

berada pada bagian bawah atau endapan, sedangkan molekul DNA, RNA

yang memiliki berat molekul rendah akan berada di bagian supernatan. Selain

itu, metode klasik yang banyak digunakan untuk memisahkan DNA dari

molekul protein adalah metode phenol kloroform.

8.1.3. Pemurnian

Pemurnian dilakukan dilakukan untuk mendapatkan isolate DNA dengan

kemurnian yang sangat tinggi. Pada tahap ini, pemurnian dapat dilakukan

dengan menggunakan kromatografi kolom maupun menggunakan teknik

presipitasi. Penggunaan kromatografi kolom lebih baik, karena kemungkinan

kehilangan sampel DNA akan semakin kecil disbanding dengan presipitasi.

Selain itu produk yang didapatkan lebih banyak. Jika ekstrak DNA yang

dibutuhkan harus bebas dari RNA, maka pada tahap lisis dapat ditambahkan

RNAse yang dapat menghancurkan moelekul RNA. Jika yang diinginkan

adalah RNA bebas dari DNA maka dapat ditambahkan DNAse untuk

menghilangkan molekul DNA dari RNA.

Secara umum, gambaran metode isolasi DNA/RNA dengan

menggunakan phenol kloroform dapat di lihat pada Gambar berikut ini:

24

Contoh metode isolasi RNA dengan menggunakan phenol kloroform

(http://cbc.arizona.edu) 8.2. Tujuan Praktikum


keterampilan mahasiswa melakukan isolasi DNA dan mengenal DNA sebagai

materi genetik yang mengkodekan sifat-sifat dari organisme.

8.3. ALAT DAN BAHAN Pinset Geneaid isolation KIT tissue Lampu Bunsen Jaringan Hewan Rak Tabung Ethanol Tabung Bleach (pemutih) Tissu Korek Api Gelas Piala Vortex Spin Heat Block 8.4. ISOLASI DNA HEWAN 8.4.1. PROSEDUR KERJA

a. Meja kerja dibersihkan dengan menggunakan bleach (pemutih) 10%

kemudian menggunakan alcohol 70%.

b. Tabung eppendrof (microtube) 1,5 mL disiapkan dan beri label sesuai

ID sampel pada bagian tutupnya.

c. Peralatan pinset, gunting, ethanol 96% dalam gelas piala, Bunsen dan

korek disiapkan.

25

d. Pinset dan gunting disterilkan dengan mencelupkan kedalam etanol

dan dibakar diatas lampu Bunsen.

e. Jaringan hewan diambil sedikit (kira-kira satu cm) dengan

menggunakan pinset dan potong halus dengan menggunakan gunting

lalu masukkan ke dalam mikrotube yang telah diberi label

f. Tambahkan 200 µL GT buffer, jika perlu haluskan dengan

menggunakan mikropastel.

g. Tambahkan 20 µL Proteinase K dan campurkan secara merata dengan

menggunakan vortex selama 10 detik, kemudian spin selama 20 detik.

h. Panaskan pada suhu 60 oC selama 30 menit.

i. Tambahkan 200 µL GBT buffer dan inkubasikan pada suhu 70oC

selama 20 menit.

j. Jika terdapat bagian yang tidak dapat hancur dan tidak dapat terlarut

dengan baik, pisahkan ampas tersebut dengan sentrifugasi pada

kecepatan 15000 rpm selama 2 menit.

k. Ambil bagian supernatant dan pindahkan pada tabung yang baru.

l. Pada saat tiba di tahap ini, panaskan elution buffer pada suhu 70oC

sampai nanti akan digunaan pada tahap.

m. Tambahkan 200 µL etanol 96% dalam supernatant hasil pada tahap K

dan vortex selama 10 detik

n. Siapkan GD kolom dalam tube 2 mL dan beri label pada bagian

tutupnya.

o. Transfer campuran supernatant dan etanol ke dalam GD kolom,

kemudian sentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 30 detik.

p. Buang larutan pada bagian bawah dan tempatkan kembali GD kolom

dalam tube 2 mL tersebut.

q. Tambahkan 400 µL W1 buffer kedalam GD kolom dan sentrifugasi

pada kecepatan 15000 rpm selama 30 detik. Kemudian buang larutan

bagian bawahnya dan tempatkan kembali GD kolom pada tabung 2

mL.

r. Tambahkan 600 µL Wash buffer, dan sentrifugasi pada 15000 rpm

selama 30 detik, lalu buang larutan bagian bawahnya. Keringkan

kolom dengan cara disentrifugasi pada 15000 rpm selama 3 menit.

26

s. Pindahkan GD kolom pada tabung 1,5 mL yang baru (beri label) dan

tambahkan 100 µL elution buffer yang tadi dipanaskan tepat pada

bagian kolomnya (bukan dinding tabung).

t. Diamkan selama 3-5 menit, kemudian sentrifugasi pada 15000 rpm

selama 30 detik. Buang GD kolom dan simpan larutan pada bagian

bawah (Ekstrak DNA) dalam freezer.

8.5. Isolasi DNA total dengan DNeasy Plant Mini Kit


1. Jaringan tanaman digerus dengan menggunakan mortar sampai halus

2. Tambahkan 400 l buffer AP1 dan 4 l Rnase ke maksimum 100 mg

berat basah jaringan tanaman atau 20 mg bahan kering tanaman dan

di vorteks.

3. Inkubasikan campuran tersebut selama 10 menit pada suhu 65oC.

Kocok 2-3 kali dengan membalik ependorf (mini tube) selama inkubasi.

4. Tambahkan 130 l buffer AP2 ke dalam ependorf lisis, kocok dan

inkubasikan selama 5 menit ke dalam es yang telah digerus

kemuduian disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 rpm.

5. Supernatan diambil dengan pipet dan dimasukkan ke dalam

“QIAshredder Mini Spin Colum (ungu) yang telah diletakkan ke dalam

tube 2 ml kemuudian disentifus selama 2 menit dengan kecepatan

14.000 rpm.

6. Pindahkan larutan yang tertampung di dalam tube (tahap 5) ke dalam

tube baru tanpa mengganggu pellet yang terbentuk.

7. Tambahkan 1.5 volume buffer AP3/E ke dalam cairan yang telah

tersaring, dan dicampur dengan menggunakan pipet (buffer AP3 telah

ditambahkan ethanol 96-100 % sebelumnya sebanyak yang tertera di

label botol).

8. Masukkan 650l campuran dari tahap 7 ke dalam DNeasy Mini Spin

Culum yang diletakkan ke dalam 2 ml tube penampungan kemudian

disentrrifuse selama 1 menit pada kecepatan 8000 rpm dan buang

cairan larutan yang tertampung.

27

9. Ulangi tahap 8 dengan campuran larutan yang tersisa dari tahap 7 dan

buang larutan yang tertampung.

10. letakkan “DNeasy Mini Spin Culumn” ke dalam tube 2 ml baru dan

tambahkan 500l buffer AW ke “DNeasy Mini Spin Column” dan

sentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Buang larutan

yang tertampung dan gunakan lagi tubenya untuk tahap 11.

11. Tambahkan 500l buffer A W ke “DNeasy Mini Spin Column” dan

disentrifuse selama 2 menit dengan kecepatan 14.000 rpm untuk

mengeringkan membran.

12. Pindahkan “DNeasy Mini Spin Column” ke dalam 1.5 ml tube

mikrosentrifus dan pipet 100l yang telah dipanaskan pada 65oC buffe

AE secara langsung pada DNeasy membran. Inkubasikan selama 5

menit pada temperatur ruangan (15 –25oC dan sentrrifus selama 1

menit dengan kecepatan 8000 rpm untuk melarrutkan DNA yang

tertahan pada membran.

13. Ulangi tahap 12 sekali lagi untuk melarutkan DNA yang masih terrsisa

pada membran (tube penampungan dapat digunakan lagi untuk

menggabungkan DNA yang dipeoleh).

8.6. ISOLASI DNA TANAMAN DENGAN MENGGUNAKAN GENOMIC DNA

MINI KIT

Berbagai species tanaman memiliki kadungan hasil metobolit yang

bervariasi seperti polisakarisda, polifenol, dan protein. Penggunaan standar

protocol GP1 untuk lisis banyak digunakan untuk tanaman. Alternatif lain

yang dapat digunakan yaitu menggunakan GPX1 yang telah disediakan

dalam kit untuk memastikan sel tanaman mengalami lisis secara efisien untuk

tanaman yang menghasilkan kandungan polisakarida tinggi.

28

8.6.1. Sebelum menggunakan Genomik DNA Mini Kit

1. Tambahkan isopropanol (lihat label botol untuk volume) ke dalam

buffer GP3 sebelum digunakan

2. Tambahkan etanol absolut (lihat label botol untuk volume) ke dalam

buffer pencuci sebelum digunakan

3. Tambahan persyaratan yang diperlukan yaitu mikro tube senrifuse,

isopropanol, dan etanol absolut

8.6.2. Prosedur Isolasi DNA

Prosedur isolasi DNA dengan menggunakan Genomik DNA mini KIT terdiri

atas lima langkah atau tahap kegiatan yaitu:

8.6.2.1. Gerus sampel tanaman (dissosiasi Jaringan)

a. Potong 50 mg sampai 100 mg daun muda atau 10 mg sampai 25 mg

sampel kering

b. Tambahkan nitrogen cair ke dalam sampel (kalau ada)

c. Gerus sampel sampai membentuk bubuk yang halus dan pindahkan ke

dalam mikrosentrifuse tube ukuran 1.5 ml

d. Tambahkan 400 µl buffer GP1 atau buffer GPX1 dan 5 µl RNase A ke

dalam sampel tube dan campurkan dengan memvortex

e. Inkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit, selama inkubasi, mikro tube

dibalik tiap 5 menit.

8.6.2.2. Lisis

Tahap ini buffer elusi sebanyak 200 µl per sampel dipanaskan pada suhu

60oC untuk step

a. Tambahkan buffer GP2 sebanyak 100 µl ke dalam mikro tube yang telah

diinkubasi pada suhu 60oC kemudian divortex dan diinkubasi pada es

selama 3 menit

b. Letakkan filter ke dalam tube 2 ml kemudian pindahkan campuran yang

telah diinkubasi pada es ke dalam tube melalui filter

c. Sentrifus selama 1 menit pada kecepatan 1000 rpm, kemudian buang

kolom filter

29

d. Pindahkan supernatant secara hati-hati dari ependorf 2 ml penampungan

ke dalam ependorf 1.5 ml .

e. Tambahkan buffer GP3 1.5 volume (pastikan bahwa isopropanol sudah

ada dalam GP3) dan segera divortex selama 5 detik.

Contoh

Tambahkan buffer GP3 750 µl ke dalam 500 µl lysat, jika presifitasi muncul,

maka aduk dengan pipet

8.6.2.3. DNA binding (Penempelan DNA)

a. Letakkan kolum GD ke dalam tube (ependorf) 2 ml

b. Pindahkan 700 µl dari campuran dan yang tersisa ke dalam kolom GD

c. Sentrifus pada kecepatan 14.000 – 16.000 selama 2 menit

d. Buang cairan yang tertampung dalam tube dan letakkan kolom GD kembali

pada tube penampungan 2 ml

e. Tambahkan 400 µl buffer W1 ke dalam kolom GD kemudian sentrifuse

pada kecepatan 14.000- 16.000 rpm selama 30 detik

f. Buang cairan yang lolos pada tube penampungan, kemudian letakkan

kolom GD kembali ke dalam tube penampungan 2 ml

g. Tambahkan 600 µl buffer pencuci (pastikan bahwa buffer pencuci telah

ditambahkan etanol)

h. Sentrifus pada kecepatan 14.000- 16.000 rpm selama 30 detik

i. Buang cairan yang tertampun dalam tube penampungan, kemudian

letakkan kolom GD kembali ke dalam tube penampungan

8.6.2.4. Pencucian DNA

a. Centrifus pada kecepatan 14.000- 16.000 rpm untuk mengeringkan kolom

matrix

b. opsional (boleh tidak), jika masih ada pigmen pada kolom, maka lakukan

langkah berikut: Cuci dengan buffer tambahan, tambahkan 400 µl pada etanol

absolut ke dalam kolom GD, sentrifus pada kecepatan 14.000 – 16.000 rpm

selama 30 detik, buang larutan yang tertampung tube penampungan,

letakkan kembali kolom GD pada tube penampungan, sentrifus selama 3

menit pada keceptan 14.000-16.000 rpm untuk mengeringkan kolom matrix.

30

c. Standar larutan DNA yaitu 100 µl , jika sampel yang digunakan sedikit

maka kurangi volume larutan DNA menjadi 30 – 50 µl untuk meningkatkan

konsentrasi DNA.

8.6.2.5. DNA elusi (Melarutkan DNA)

a. Pindahkan kolom GD yang kering ke dalam ependorf 1.5 ml

b. Tambahkan 100 µl buffer elusi yang telah dihangatkan atau TE di tengah-

tengan kolom matrix

c. Diamkan selama 3 – 5 menit memastikan bahwa buffer elusi telah terserap

merata

d. Sentrifus pada kecepatan 14.000- 16.000 rpm selama 30 menit untuk elusi

DNA murni

8.7. ISOLASI DNA TANAMAN DENGAN METODE CETAB

Program pemuliaan tanaman dalam rangka perbaikan sifat-sifat

tanaman sangat bergantung pada sifat genetik dan keanekaragaman dari

sifat-sifat genetik tanaman tersebut. Yang menentukan informasi genetika dari

tanaman adalah DNA. DNA di dalam tanaman (eukariot) disimpan dalam

suatu organ nukleus (inti sel) yang disebut dengan kromosom, mitokondria,

dan kloroplas. Freifelder dan Malcinski (1993) menyatakan bahwa materi

genetik memiliki sifat-sifat, seperti: (1) mampu menyimpan informasi genetik

dan mengekspresikannya dalam sel apabila diperlukan, (2) mampu

mentransfer informasi tersebut ke sel turunannya dengan kesalahan

seminimal mungkin, (3) stabil secara fisikokimia, sehingga informasi tersebut

tidak hilang dalam waktu atau periode yang panjang, dan (4) berpotensi untuk

terjadi perubahan pada turunannya tanpa banyak kehilangan informasi

induknya. Memahami informasi genetik yang terdapat dalam DNA, maka

perlu dilakukan pengkajian terhadap DNA. Langkah awal yang harus

dilakukan adalah mengisolasi DNA dari tanaman target menggunakan

prosedur yang sesuai. Tujuan khusus dari praktikum isolasi DNA tanaman

adalah (1)

31

8.7.1. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan: memperkenalkan kepada mahasiswa cara

mengisolasi DNA tanaman, menunjukkan cara memisahkan DNA tanaman

dari selnya, agar dapat digunakan untuk kegiatan-kegiatan lain, dan

mengidentifikasi DNA tanaman target.

8.7.2. Bahan dan Aalat

Alat : - Mortar dan penggerus

- Sentrifuse

- Water bath

- Tabung ependorff 1,5 ml

- Pipet mikro 1 ml beserta tipnya

- Gelas piala dan nampan plastik

- Rak tabung

- Keranjang es beserta esnya

- Tissue

- Tabung reaksi steril

- Vortex mixer

Bahan : - Bahan tanaman

- Buffer lisis (100 mM Tris-HCl pH 8, 2% (m/v) CTAB, 1,4M NaCl, 20

mM EDTA)

- -mercaptoetanol

- Pasir kuarsa

- Isopropanol

- RNAse

- Fenol

- Kloroform isoamil

- 3M Sodium asetat pH 5,2

- Etanol absolut

- Etanol 70%

- H2O Bidestilata

- TE 1X

32


1. Sebanyak 2 gr daun tanaman yang masih muda dimasukkan ke dalam

mortar yang berisi 10 ml buffer lisis (100 mM Tris-HCl pH 8, 2% (m/v)

CTAB, 1,4M NaCl, 20 mM EDTA, dan 0,2% -mercaptoetanol

(ditambahkan pada saat akan isolasi)) dan 0,07 gr pasir kuarsa,

selanjutnya digerus sampai halus.

2. Serbuk daun dipindahkan ke dalam tabung 15 ml dan diinkubasi pada

suhu 60oC selama 1 jam.

3. Suspensi DNA dipanen dengan melakukan sentrifuse pada 4 000 rpm

selama 3 menit.

4. Suspensi DNA diekstrasi dengan 1 volume kloroform:isoamil alkohol

(24:1).

5. DNA di dalam suspensi dipresipitasi dengan menambahkan 0,1 volume

sodium asetat 3M pH 5.2 dan 0,8 volume isopropanol.

6. DNA diendapkan dengan melakukan sentruse pada 4 000 rpm selama 3

menit.

7. Endapan DNA yang dihasilkan dicuci dengan etanol 70% dan dikering-

anginkan.

8. DNA disuspensi dalam 500 l larutan TE 1x.

9. Untuk menghilangkan kontaminan RNA, dalam suspensi DNA

ditambahkan RNase A dengan konsentrasi akhir 100 g/ml dan diinkubasi

pada suhu 37oC selama 1 jam.

10. Suspensi DNA diekstraksi dengan menambahkan 1 volume fenol dan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.

11. Suspensi DNA disentrifuse pada 4 000 rpm selama 3 menit.

12. Suspensi DNA dipindahkan ke epperndorf baru dan diekstraksi lagi

dengan 1 volume kloroform: isoamil alkohol (24:1).

13. DNA di dalam suspensi dipresipitasi dengan menambahkan 0,1 volume

sodium asetat 3M pH 5.2 dan 0,8 volume isopropanol.

14. DNA diendapkan dengan melakukan sentrifuse pada 4 000 rpm selama 3

menit.

33

15. Endapan DNA yang dihasilkan dicuci dengan etanol 70% dan dikering-

anginkan.

16. DNA disuspensi dalam 500 l larutan dH2O.

17. Ukurlah konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 260 nm dan 280 nm.

34

BAB IX. ELEKTROFORESIS DNA PADA GEL AGAROS

9.1. Pendahuluan :

Penetapan kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan pemotongan

dengan enzim restriksi, baik dari plasmid maupun tanaman, dapat dilakukan

dengan memigrasikan DNA tersebut di dalam gel agarosa menggunakan alat

elektroforesis.

Resolusi tiap fragmen DNA berbandingterbalik dengan ukurannya, dan

fragmen yang besar (> 50 kb) cenderung bermigrasi bersama-sama. Untuk

memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih dari 1 kb biasa

menggunakan gel agarosa, sedangkan untuk memisahkan fragmen

DNAberukuran < 1 kb menggunakan poliakrilamida. Gel agarosa lebih

mudah dalam hal preparasinya daripada poliakrilamida. Konsentraasi gel

agarosa bervariasi antara 0,3% - 1% tergantung dari ukuran DNA yang akan

dipisahkan. Biasanya gel agarosa dengan konsentrasi 0,8-1% paling baik

untuk memisahkan fragmen DNA berukuran 1-20 kb.

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah berdasarkan gaya tarik listrik.

DNA yang bermuatan negatif akan tertarik menuju arah muatan positif.

Dengan adanya gaya tarik ini menyebabkan terjadi pemisahan DNA

berdasarkan ukurannya. DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih

cepat dibandingkan dengan DNA yang berukuran besar.


Praktikum ini bertujuan: supaya mahasiswa dapat mengetahui cara

memigrasikan DNA dengan elektroforesis, mengidentifikasi kwalitas dan

kuantitas DNA hasil isolasi dan pemotongan, dan mengidentifikasi ukuran

DNA

9.3. Bahan : - DNA

- Agarosa

- TAE 1x atau TBE 1x

- H20

35


1. Timbang agarosa sesuai kebutuhan dan masukkan ke dalam labu

erlenmeyer. Misalnya untuk mengecek kualitas DNA total diperlukan

konsentrasi agar 0.7%. Jika tray elektroforesis ukuran kecil (25 ml), maka

agaros yang diperlukan yaitu 0.7/100 x 25 ml = 0.175 gram.

2. Suspensikan agarosa di dalam larutan penyanggah yang sesuai (TAE 1x

atau TBE 1x). Konsentrasi agarosa tergantung besarnya fragmen DNA

yang akan dimigrasikan atau dipisahkan. Semakin kecil fragmen tersebut,

semakin tinggi konsentrasi agarosa yang digunakan. Pada umumnya gel

agarosa menggunakan konsentrasi 0,8%.

3. Panaskan agarosa (dengan hot-plate atau microwave) hingga tidak terlihat

lagi butiran agarosa dan larutan menjadi jernih (transparan, tidak putih).

Bila menggunakan hot-plate untuk memanaskan agarosa, masukkan

magnet pengaduk ke dalam erlenmeyer dan tutuplah erlenmeyer

menggunakan kertas alumunium. Panaskan erlenmeyer yang berisi

agarosa pada suhu 175oC.

Bila menggunakan microwave untuk memanaskan agarosa, maka

erlenmeyer yang berisi agarosa dan larutan penyangga tidak boleh ditutup

dengan kertas alumunium, dengan demikian akan terjadi penguapan.

Untuk menjaga agar konsentrasi agarosa tetap seperti sebelum

dipanaskan, maka banyaknya penguapan harus diganti dengan H2O.

Untuk itu, timbanglah erlenmeyer yang berisi agarosa dan larutan

penyanggah sebelum dipanaskan (Bo) dan setelah dipanaskan (B1).

Tambahkan H2O sebanyak Bo-B1. Tutuplah erlenmeyer dengan kertas

alumunium, goyang-goyang supaya tercampur merata, hindari terjadinya

gelembung udara. Biarkan supaya suhunya menurun. Tambahkan

ethidium bromida dengan konsentrasi final 0,5 g/ml.

4. Sambil menunggu turunnya suhu larutan agarosa, siapkan tempat untuk

menuang gel (tray). Pasanglah sisir (comb) pada tempatnya, dan letakkan

tray di tempat yang rata.

5. Setelah suhunya tidak terlalu panas (60-70oC), tuangkan agarosa ke

dalam tray yang telah disiapkan dan hindari terjadinya gelembung udara.

Bila terdapat gelebung udara, tariklah ke arah pinggir gel sehingga

36

jalannya migrasi DNA pada gel tidak terganggu. Biarkan gel membeku,

jangan digoyang.

6. Setelah gel beku, tempatkan gel pada alat elektroforesis, dimana sisir

terletak pada kutub (elektroda) negatif. Tuangkan larutan penyanggah

(TAE 1x) sampai gel terendam. Ambil sisir secara hati-hati, dan

tambahkan ethidium bromida pada larutan penyanggah untuk mewarnai

DNA (alternatif lain: gel diwarnai setelah selesai migrasi).

7. DNA yang akan dimigrasikan dicampur dengan larutan pewarna (loading

dye) bromofenol biru untuk menandai laju migrasi. Masukkan larutan DNA

ke dalam sumur pada gel dengan menggunakan pipet gilson. Jangan lupa

untuk menyertakan penanda ukuran molekular seperti /HindIII). Tutuplah

alat elektroforesis pada bagian atasnya.

8. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply, sehingga kutub

positif (merah) dihubungkan dengan kutub positif (merah) dan kutub

negatif (hitam) dihubungkan dengan kutub negatif (hitam). DNA akan

bermigrasi ke arah kutub positif.

9. Hidupkan power supplay pada 30-150 volt (tergantung dari besarnya

molekul DNA dan larutan penyanggah yang digunakan).

10. Setelah cukup jauh bromofenol biru bermigrasi, matikan power supplay (±

1-2 jam untuk ukuran gel kecil dan 3-4 jam untuk ukuran gel besar).

Hindari memigrasikan DNA sampai pewarna bromofenol biru keluar dari

gel. Buka penutup kotak elektroforesis dan ambil gel agarosanya.

Selanjutnya periksa DNA yang telah bermigrasi dengan menggunakan

transluminator ultraviolet. Gunakan sarung tangan yang terbuat dari latex

untuk menghindari sentuhan langsung kulit dengan ethidiun bromida

(senyawa karsinogen). Gunakan kacamata untuk melihat DNA dengan

sinar ultra violet.

37

BAB X. Elektroforesis DNA Genom

10.1. Pendahuluan

Elektroforesis DNA adalah metode pemidahan molekul kimia yang

didasarkan pada perbedaan ukuran dan muatan yang memanfaatkan arus

listrik dan gel sebagai media pemisahan. DNA merupakan makromolekul

yang secara total bermuatan negative. Sifat ini yang digunakan sebagai dasar

dalam pemisahan DNA dengan menggunakan metode elektroforesis. Dengan

adanya aliran listrik, maka molekul DNA akan bergerak dari kutub negative

(hitam) menuju ke kutub positif (merah).

Molekul DNA dengan ukuran besar akan bermigrasi lebih lambat

dibandingkan molekul DNA dengan ukuran yang lebih kecil. Hal ini di

tunjukkan pada gambar berikut: molekul DNA memulai perpindahan atau

pemisahan dari bagian atas yang terdapat sumur atau lobang ke arah bawah

foto. Semakin ke bawah, semakin kecil ukuran DNA nya, sedangkan semakin

keatas, semakin besar ukuran DNAnya.

Gambar contoh hasil elektroforesis DNA

Untuk dapat divisualisasikan dengan UV transluminator, DNA harus

diwarnai dengan menggunakan EtBr, Syber green, gel red maupun pewarna

lainnya. Etidium bromide akan terikat diantara basa-basa DNA dan akan

bersinar ketika di sinari dengan lampu UV seperti pada gambar berikut.

38

Posisi pengikatat EtBr pada DNA

Matriks atau fase diam yang digunakan dalam elektroforesis DNA

adalah agarose. Konsentrasi yang digunakan bervariasi antara 0.5%, 1%, 2%

dan lain sebagainya. Untuk elektroforesis genom DNA, konsentrasi yang baik

digunakan adalah konsentrasi 1% (b/v). gel yang terbentuk cukup kuat (tidak

mudah patah/pecah) dan dapat memisahkan molekul DNA dengan baik.

Untuk melakukan elektroforesis, diperlukan larutan buffer, yaitu buffer SB

(sodium boric), TBE (Tris Boric EDTA) atau TAE. Semua jenis buffer memiliki

peranan yang sama dalam proses elektroforesis. Buffer SB merupakan buffer

yang paling tahan untuk digunakan pada tegangan listrik yang tinggi seperti

pada tegangan 200 V.

10.2. TUJUAN

a. Mengenalkan prinsip kerja dari elektroforesis DNA

b. Mengetahui dan melatih ketrampilan mahasiswa dalam melakukan

elektroforesis DNA

c. Mengamati kualitas DNA genom atau hasil amplifikasi PCR dengan

menggunakan gel agarosa.

10.3. ALAT DAN BAHAN Pipet mikro Agarosa

Paket alat elektroforesis Molekular grade water

Microwave Etidium Bromida

Gelas Piala SB Buffer

39

10.4. Prosedur Kerja

1. Pembuatan gel Agarosa 1 % (b/v)

a. Timbang 0,40 gram agarosa dan masukan dalam gelas piala

b. Ukur 40 mL buffer SB dan masukan dalam gelas piala yang

berisi agarosa

c. Panaskan dalam microwave hingga semua agar terlarut dan

berwarna bening

d. Siapkan cetakan gel, dan pasang sisir gel

e. Tuangkan larutan agarosa dan amati jangan sampai ada

gelembung

f. Diamkan hingga mengeras sekitar 20 menit.

2. Running elektroforesis

a. Masukan gel dalam tangki elektroforesis yang berisi SB buffer

(pastikan semua gel terendam sempurna)

b. Hamparkan parafilm

c. Ambil 4 µL loading dye dan totolkan pada parafilm menjadi 4

totol.

d. Ambil 4 µL PCR product dan campurkan dengan salah satu

totolan loading dye, mix hingga rata.

e. Ambil campuran tersebut dan masukan dalam sumur gel (pada

sumur kedua)

f. Tambahkan DNA marker pada sumur pertama

g. Running mesin pada tegangan 200 volt, 400 Ampere selama 15

menit.

3. Visualisasi hasil elektroforesis

a. Angkat gel dan masukan dalam larutan etidium bromide

(gunakan blue glove) diamkan selama 15 menit.

b. Angkat dan masukan dalam air pembilas, diamkan beberapa

saat

c. Angkat dan letakan diatas lampu UV.

Nyalakan lampu UV dan foto hasilnya.

40

BAB XI. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 11.1. Pendahuluan

PCR adalah reaksi berantai DNA yang memungkinkan untuk

menggandakan potongan DNA tertentu menjadi banyak. Prinsip kerja PCR

adalah denaturasi DNA, annealing (penempelan primer) dan extention

(pemanjangan atau sintesis DNA). Denaturasi adalah pemisahan double

strand DNA menjadi single strand DNA dengan menggunakan suhu tinggi (94

oC). Annealing adalah penempelan primer pada DNA target dengan

menggunakan suhu yang bervariasi (tergantung dari primernya, antara 35 –

65 oC). Extention (ekstensi) adalah pemanjangan DNA atau sintesis DNA

target menjadi dua utas potongan DNA pada suhu antara sekitar 72 oC.

Proses dari denaturasi ke annealing dan selanjutnya dari annealing ke

exstention disebut satu siklus. Siklus berikutnya mulai lagi dari denaturasi

kemudian berakhir pada extention (Gambar prinsip kerja PCR; Saiki et al.

1988) sebagai berikut.

41

Proses amplifikasi DNA dengan PCR bergerak dari ujung 5’ ke ujung 3’

seperti pada gambar berikut ini (Saiki et al 1998)

Pemanfaatan teknik PCR dapat dilakukan untuk menentukan

keragaman genetik dan kekerabatan genetik, penentuan gen spesifik yang

mengkodekan karakter tertentu, pelacakan gen ketahanan terhadap hama

dan penyakit, pelacakan gen terhadap ketahanan lingkungan ekstrim,

investigasi hirarki, penentuan rekombinan DNA, penentuan mutasi genetik,

dan penentuan variasi somaklonal pada tanaman hasil kultur jaringan.

11.2. Tujuan

a. Mahasiswa memahami prinsip kerja dari PCR

b. Mahasiswa mampu menggunakan mesin Thermocycler

c. Mahasiswa mampu dan memiliki ketrampilan dalam melakukan PCR

d. Mengamplifikasi fragmen gen sitokrom oksidase I

11.3. Alat dan Bahan

Pipet mikro Hasil ekstraksi

Rak Tabung Molecular grade water (dd H2O)

Tips PCR buffer

PCR Strip Tube dNTP’s

Centrifuse MgCl2

34

42

Thermocycler Primer

Tabung eppendroff enzyme taq polymerase

10.4. Prosedur Kerja

a. Form PCR diisi dan dihitung jumlah reagen yang dibutuhkan

(dilebihkan 1 dari jumlah sampel untuk cadangan eror pipeting);

b. Cube atau tabung diberi label inisial, tanggal, primer pada bagian

tertentu tabung

c. Label angka ditulis pada bagian tabung

d. Tabung 0,75 mL disiapkan untuk mastermix dan beri label M1

e. Mastermix dibuat sesuai dengan form PCR (setiap menambahkan

larutan, campurkan dengan pipet)

f. Master mix dispin selama 10 detik untuk menurunkan semua larutan

yan berada di dinding tabung

g. Mix dengan menggunakan pipet (lakukan pelan-pelan) kemudian ambil

24 µL mastermix dan masukan dalam PCR strip tube

h. DNA template yang telah disiapkan diambil 1 µL dan campurkan ke

dalam mastermix.

i. DNA template dispin selama 10 detik kedalam thermocycler sebelum

digunakan.

j. Jalankan program gold yang sudah disetting dalam

43

DAFTAR PUSTAKA

Clark M.S. 1996. Plant molecular biology. A laboratory manual. Springer Berlin. 529p.

Brundrett M, N. Bougher, B. Dell, T. Grove, and N. Maljczuk. 1994. Working

with mycorhizas in forestry and agriculture. International Mycorhizas Workshop Kaiping China. 1994. 374p.

Saiki RK, DH Gelfand, S Sto fel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis,

and HA Erlich. 1988. Polymerase Chain Reaction: Amplification of a Short DNA Stretch by Repeated Cycles of In Vitro DNA Polymerization. Science, Vol 239(4839): 487-491

Smith S, and D.J. Read. 1997. Mycorrhizal Symbiosis. 2nd ed. Academic

Press. 605p. Somasegaran P and HJ. Hoben. 1994. Hand book for rhizobia: Methods in

legume-rhizobium technology. Springer –verlag USA. 450p.

penuntun praktikum bioteknologi pertanian · mengetahui dan mengerti materi dan prosedur kerja...

Documents