yanti puspitaningrum-fkik.pdf

7/26/2019 YANTI PUSPITANINGRUM-FKIK.pdf

1/70

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

DETEKSI DNA GELATIN SAPI DAN GELATIN BABI PADA

SIMULASI GUMMYVITAMIN C MENGGUNAKAN

REAL -TIME PCRUNTUK ANALISIS KEHALALAN

SKRIPSI

YANTI PUSPITANINGRUM

NIM : 1110102000043

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2015


2/70

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

DETEKSI DNA GELATIN SAPI DAN GELATIN BABI PADA

SIMULASI GUMMYVITAMIN C MENGGUNAKAN

REAL -TIME PCRUNTUK ANALISIS KEHALALAN

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

YANTI PUSPITANINGRUM

NIM : 1110102000043

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

JANUARI 2015


3/70

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama

NIM

Tanda Tangan

: Yanti Puspitaningrum

: 1110102000043

:

Tanggal : Januari 2015


4/70

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta


5/70

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta


6/70

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya

kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsidengan judul Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi

GummyVitamin C Menggunakan Real -Time PCRUntuk Analisis Kehalalan

Shalawat serta salam selalu tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW,

keluarga, para sahabat, dan pengikutnya yang senantiasa istiqomah mengikuti

sunnah-Nya.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana

Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Keberhasilan

penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dorongan semua

pihak. Untuk itu pada kesempatan ini, perkenankanlah penulis menyampaikan

ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:

1.

Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2.Bapak Drs.Umar Mansur, M.Sc.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta sekaligus sebagai pembimbing II.

3. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I yang sangat baik telah memberikan

ilmu, nasehat, waktu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan

penulisan skripsi.

4.Kedua orang tua, ayahanda tersayang Edi Winarko dan ibunda tercinta Siti

Rukmini yang selalu ikhlas memberikan dukungan moral, material, nasehat-

nasehat, serta doa yang tiada pernah putus hingga penulis dapat menyelesaikan

studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Juga kepada

adikku tercinta Koko Dwi Suryanto yang selalu memberikan dukungan dan

semangat. Tiada apapun di dunia ini yang dapat membalas semua kebaikan, cinta

dan kasih sayang yang telahkalian berikan.

5.Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh pendidikan di

farmasi, FKIK UIN Jakarta.


7/70

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6.Teman-teman Andalusia yang telah menjadi kepingan memori yang berharga.

Kebersamaan kita di dalam suka dan duka akan selalu terkenang didalam hati

7.

Kak Rahmadi, Kak Liken, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak Lilis,

dan Kak Ayu yang sangat banyak membantu penulis melakukan penelitian di

laboratorium.

8. Teman-teman seperjuangan tim PCR: Afifah dan Kak Sulaiman yang selalu

meluangkan waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan,

membantu penulis dalam melakukan peneltian, serta memberikan dukungan

doa dan semangat kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini. Terimakasih

atas kebersamaan yang indah ini, semoga balasan kebaikan selalu menaungikita.

9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, dan Mbak Helen yang telah

memberikan masukan dan bantuan selama penulis melakukan penelitian.

10.Sahabat tersayang : Finti, Nurul, Rifa, Ninik, dan Luni. Terima kasih atas

dukungan, kasih sayang, perhatian, doa dan persahabatan yang indah ini.

11.Farida, Yusna, Fahrur, Yuni, Vicka, Salma, Chandra, Ipho, yang menginspirasi.

Terimakasih atas dukungan,bantuan dan semangatnya.

12.Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan kebaikan dari

Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan

penulis nantikan. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi masyarakat umum

dan pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, Januari 2015

Penulis


8/70

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Salah satu produk food supplementyang disukai oleh kalangan anak-anak adalah

gummy vitamin C. Bahan basis gummy vitamin C salah satunya adalah gelatin.

Produksi gelatin di dunia sebanyak 46% masih berasal dari kulit babi, maka dari itu

perlu dilakukan penelitian tentang bahan asal gelatin. Sampel simulasigummy yang

digunakan adalahgummysapi,gummybabi,gummypencampuran gelatin babi dan

gelatin sapi dengan konsentrasi 1%, 25%, 50%, dan 75%. Salah satu teknik analisis

untuk membedakan gelatin babi dan gelatin sapi adalah teknik amplifikasi DNA

dengan instrumen Real-Time PCR. Amplifikasi DNA membutuhkan sepasang

primer spesifik yang diambil dari DNA mitokondria daerah sitokrom B serta

hydrolysis probe sebagai pewarna fluoresensi. Proses ekstraksi dan isolasi DNA

pada gummymengkombinasikan presipitasi DNA dan kit komersial. Isolat DNA

yang dianalisis dengan hydrolysis probemenggunakan suhu annealing61C untukprimer sapi dan suhu 60C untuk primer babi. Hasil kurva amplifikasi dengan

primer babi dari sampel simulasigummyhanya muncul pada gummy babi,gummy

pencampuran babi dengan konsentrasi 25%, 50% dan 75%. Tetapi pada gummy

pencampuran babi konsentrasi 1% tidak muncul kurva amplifikasi.

Nama

Nim

Judul


: 1110102000043

: Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi

Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk

Analisis Kehalalan

Kata Kunci: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, Hydrolysis

Probe, Gummy


9/70

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

One of the food supplement products which are favored by the children is gummy

vitamin C. One of vitamin C gummy bases is gelatin. About 46 % of gelatinproduction in the world still comes from pig skin, therefore the research of gelatin

bases is necessary. Gummy simulation samples consist of beef gummy, pig gummy

and the mixing gummy between porcine gelatin and bovine gelatin with the

concentration of 1 % , 25 % , 50 % , and 75 %. One of analysis technique which is

used to distinguish bovine gelatin and porcine gelatin is DNA amplification

technique using Real-Time PCR instrument. Amplification DNA needs a pair of

specific primary DNA taken from mitochondria cytochrome b and hydrolysis probe

as dye fluorescence. Extraction and isolation process of DNA in gummy combine

the precipitation of DNA and commercial kit. DNA isolates analyzed by hydrolysis

probe method using annealing temperature was 61C for bovine primer and using

annealing temperature was 60C for porcine primer. The results of the

amplification curves for sampel gummy simulation only showed the rising of

amplification curve for porcine gummy, mixing gummy with a concentration of

25%, 50% and 75% of porvine gelatin. However, mixing of porcine gummy

concentration of 1% does not show amplification curve.

Keyword : Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, Hydrolysis Probe,

Gummy

Name

Major

Title


: Pharmacy

: Detection of DNA Bovine Gelatin and Porcine Gelatin in the

Gummy Simulation Vitamin C Using Real -Time PCR

Instruments for Halal Analysis


10/70

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi GummyVitamin

C Menggunakan Real -T ime PCRUntuk Analisis Kehalalan

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di

Pada Tanggal

: Jakarta

: 18 Januari 2015

Yang Menyatakan

Yanti Puspitaningrum

Nama

Nim

Program Studi

Fakultas

Jenis Karya


: 1110102000043

: Strata-1 Farmasi

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

: Skripsi


11/70

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS..........

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING..................................................LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI..

KATA PENGANTAR

ABSTRAK..

ABSTRACT........

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...

DAFTAR ISI...........................................................................................................

DAFTAR TABEL...................................................................................................

DAFTAR GAMBAR..............................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN..........................................................................................

DAFTAR SINGAKATAN.

BAB I PENDAHULUAN.....................................................................................

1.1 Latar Belakang.................................................................................

1.2 Rumusan Masalah............................................................................

1.3

Hipotesis...........................................................................................

1.4

Tujuan Penelitian..............................................................................

1.5

Manfaat Penelitian...........................................................................

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA.............................................................................

2.1 Gummy Candy ................................................................................

2.2 Vitamin C..........................................................................................

2.3

Gelatin...............................................................................................

2.3.1 Definisi Gelatin....................................................................

2.3.2 Sifat Kimia dan Fisika Gelatin..............................................

2.3.3 Sumber Gelatin.....................................................................

2.4 Sel.....................................................................................................

2.5 DNA..................................................................................................

2.5.1 Struktur DNA.......................................................................

2.5.2

Isolasi DNA..........................................................................

iii

ivv

vi

viii

ix

x

xi

xiii

xiv

xv

xvi

1

1

3

3

3

5

5

5

5

6

6

7

8

9

12

12

14


12/70

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.5.3 DNA Mitokondria................................................................

2.6

PCR..................................................................................................

2.6.1

Komponen PCR....................................................................

2.6.2.

Tahapan PCR........................................................................

2.7 Real Time PCR.................................................................................

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN................................................................

3.1 Waktu dan Tempat............................................................................

3.2 Alat dan Bahan..................................................................................

3.2.1

Alat........................................................................................

3.2.2 Bahan....................................................................................

3.3

Tahapan Penelitian............................................................................

3.4 Prosedur Kerja..................................................................................

3.4.1 Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi

dan gelatin Sapi................................................................

3.4.2

Isolasi DNA........................................................................

3.4.3 Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan

spektrofotometer DNA........................................................

3.4.4

Amplifikasi Real Time PCR......................................

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pembuatan Simulasi GummyVitamin C.

4.2. Isolasi DNA

4.3. Analisa Konsentrasi Dan Kemurnian Isolat DNA dengan

Spektrofotometer DNA.......................................................................

4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi GummyVitamin C padaReal Time PCR

BAB 5 KESIMPULAN...........

5.1. Kesimpulan........

5.2. Saran..

DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................

16

17

18

21

22

24

24

24

24

24

25

25

25

26

28

28

30

30

30

33

34

40

40

40

41


13/70

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel.1. Aplikasi Gelatin................................................................................

Tabel.2. Perbedaan sel eukariotik dan sel prokariotik......................................Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi.................

Tabel.4. Komposisi Formula Gummy Vitamin C...........................................

Tabel.5. Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA...........................................

Tabel.6. Komposisi Kit Ekstraksi DNA.

Tabel.7. Campuran reaksiHydrolysis Probemastermix

7

1125

26

33

46

49


14/70

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar.1. Gummy candy...............................................................................

Gambar.2. Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik................................................Gambar.3. Struktur Nukleotida......................................................................

Gambar.4. Struktur DNA................................................................................

Gambar 5. Struktur DNA Mitokondria

Gambar.6. Siklus PCR....................................................................................

Gambar.7. Kurva Real Time PCR..

Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR..........................................

Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C

Gambar.10.Hasil Amplifikasi pada Uji Spesifitas Primer Sapi

Menggunakan Kontrol Positif Daging Sapi, Gelatin Sapi dan

Gummy Sapi

Gambar.11.Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy dengan Primer

Sapi..

Gambar.12.Hasil Amplifikasi Pada Uji Spesifitas Primer Babi

Menggunakan Kontrol Positif Daging Babi, Gelatin Babi, dan

Simulasi Gummy Babi

Gambar 13. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummydengan Primer

Babi.

5

1013

14

17

21

23

29

30

35

36

37

38


15/70

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran.1 Kerangka Konsep........................................................................

Lampiran 2. Tabel Komposisi Kit Ekstraksi DNA Roche..Lampiran 3. Membuat Larutan Primer dan Probe dan Natrium Asetat..

Lampiran 4. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

Lampiran 5. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA.

Lampiran 6. Hasil BLAST Berdasarkan Informasi NCBI.

Lampiran 7. Gambar alat-alat dalam penelitian.

Lampiran 8. COA Gelatin Babi..

Lampiran 9. COA Gelatin Sapi..

45

4647

48

49

50

51

52

53


16/70

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FAM : Fluorescein Amidite

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

mtDNA : mitochondria DNA

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

pb : Pasang Basa

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma

RNA : Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

SNI : Standar Nasional Indonesia

Tm : Temperature Melting

Ta : Temperature Annealing


17/70

xvii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta


18/70

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.

Latar Belakang

Food supplement atau disebut sebagai makanan tambahan pada

aneka produk kesehatan yang mengandung satu atau lebih zat bersifat nutrisi

dan obat. Nutrisi yang terkandung dalamfood supplement meliputi vitamin,

mineral dan asam amino, sedangkan food supplement yang bersifat obat

umumnya diambil dari tanaman atau jaringan tubuh hewan yang berkhasiat

sebagai obat (Yuliarti, 2009). Dalam pemenuhan nutrisi bagi anak-anak,

terutama pada pemberian vitamin, maka industri farmasi mulai memproduksi

sediaan vitamin dalam bentuk gummy. Alasan pemilihan bentuk gummy

tersebut, karena bentuk sediaan gummy seperti permen jelly dan mudah

dikunyah sehingga anak-anak lebih menyukaigummydaripada bentuk tablet.

Bahan-bahan untuk membuat gummy diantaranya adalah sukrosa, glukosa,

asam sitrat serta bahan basisgummyyaitu gelatin. (Lanelli, 2014).

Gelatin merupakan protein yang berasal dari hidrolisis kolagen

jaringan ikat dan tulang dengan perlakuan asam dan basa. Gelatin memiliki

sifat sebagai gelling agent, thickening agent, zat penstabil, dan emulsifier.

Oleh karena itu gelatin digunakan dalam produk makanan seperti

marshmallow, permengummy, daging olahan, es krim. Selain itu, gelatin juga

digunakan dalam industri farmasi sebagai bahan untuk membuat kapsul keras

dan kapsul lunak, tablet, salep untuk mukosa membran mulut, dan suplemen

gummy(Hui et al.,2011; Nhari et al.,2012).

Globalisasi dalam semua aspek kehidupan telah membawakonsekuensi banyak pada makanan produk lokal maupun produk impor, baik

produk yang halal atau produk yang haram. Hal ini jelas sangat

mengkhawatirkan karena sebagian besar penduduk Indonesia beragama

Islam. LPPOM MUI sudah meluncurkan sistem jaminan halal sebagai

pedoman yang diwujudkan dalam bentuk sertifikasi halal, tetapi masih banyak

kendala. Salah satu kendala yang dihadapi adalah belum terdapat metode yang

valid untuk menganalisa adanya zat non halal pada produk makanan. Salah


19/70

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

satu produk pangan yang masih diragukan kehalalannya yaitu produk

makanan yang berbasis gelatin. Gelatin diekstraksi dari kulit, jaringan ikat

putih dan tulang yang bersumber dari babi dan sapi. (Hermanto, Sumarlin,

and Fatimah, 2013). Presentase produksi gelatin di dunia pada tahun 2006,

masih didominasi oleh gelatin babi, dengan jumlah 45,8 % berasal dari kulit

babi dan 28,4% berasal dari kulit sapi ( Phillips & William, 2009). Sementara

itu, Al-Qur'an surat Al-Maidah: 3, menjelaskan bahwa umat Islam dilarang

untuk mengkonsumsi produk babi dan hewan yang tidak disembelih

berdasarkan hukum Islam. Hal ini jelas bahwa umat Islam dilarang untuk

mengkonsumsi makanan diklasifikasikan sebagai bangkai (maytah), darah,

daging babi dan daging yang didedikasikan untuk selain Allah (Raraswati et

al., 2009).

Banyak kajian yang telah dilakukan mengenai sifat, aplikasi dan

struktur gelatin, mengingat luasnya penggunaan gelatin itu sendiri. Namun

gelatin dari sumber yang berbeda bisa jadi sangat mirip ditinjau dari segi sifat

fisika dan kimianya. Hal ini membuat sulit untuk membedakan antara gelatin

yang haram dan gelatin halal (Nemati et al., 2004).

Pada penentuan spesies hewan dapat dilakukan dengan analisis

protein dan DNA. Pada analisis penentuan spesies hewan berbasis protein

sering digunakan metode ELISA, HPLC, dan Spektrofotometri massa.

Analisis penentuan spesies hewan berbasis DNA digunakan metodePCRatau

Real Time PCR. Metode penentuan spesies hewan berbasis protein memiliki

kekurangan yaitu protein terjadi denaturasi progresif yang disebabkan oleh

perubahan suhu dan pH sehingga kehilangan heterogenitas dan stabilitas

protein. Metode berbasis DNA memiliki kelebihan dibandingkan metodeberbasis protein yaitu metode real time PCRmenggunakan primer spesifik

dengan jenis DNA hewan dan proses deteksi lebih sensitif dan cepat (Cai et

al., 2012).

Analisa kandungan babi dalam suatu produk dapat dilakukan

melalui amplifikasi DNA dengan metodePolymerase Chain Reaction (PCR).

Hal ini telah banyak dilakukan seperti pemeriksaan daging babi dalam produk

olahan (Walker et al, 2003) dan pengujian pencemaran daging babi pada


20/70

3


produk bakso (Ridwan dan Margawati, 2010). Selain pada produk makanan,

PCR dapat digunakan dalam identifikasi DNA babi dan sapi yang terkandung

dalam gelatin pada sediaan kapsul dan gummyseperti yang telah dilakukan

Demirhan et al. (2012) dan Cai et al. (2012).

Penelitian ini dilakukan berdasarkan beberapa permasalahan, di

antaranya adalah masih banyak obat-obatan di Indonesia yang belum

mencantumkan label halal atau mendapatkan sertifikat halal dari lembaga

yang berwenang. Sekitar 30 ribu obat dari 206 perusahaan hanya 34 produk

yang bersertifikat halal, dengan rincian, obat sebanyak 4 produk, jamu

sebanyak 17 produk dan suplemen sebanyak 13 produk. Sedangkan

pemasaran gelatin di dunia didominasi oleh gelatin yang bersumber dari babi

sehingga kemungkinan besar gelatin yang digunakan dalam pembuatan obat

bentuk sediaangummyadalah gelatin yang tidak halal (LPPOM MUI, 2013).

Tujuan dari penelitian untuk membedakan amplifikasi DNA gelatin

sapi dan gelatin babi pada sampel simulasi gummy vitamin C dengan

menggunakan instrumen real timePCR. Sampel simulasigummyvitamin C

dibuat dengan campuran antara gelatin sapi dan gelatin babi dalam berbagai

konsentrasi.

1.2. Rumusan Masalah

1. Bagaimana kondisi optimal pada proses isolasi DNA sehingga

didapatkan isolat DNA ?

2.

Apakah DNA gelatin babi dan gelatin sapi serta simulasigummy vitamin

C dapat teramplifikasi dengan alat real-time PCR ?

1.3. Hipotesis

1.

Isolasi DNA dapat dilakukan pada produk gelatin2. Real-time PCRdapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan gelatin babi

menggunakan primer spesifik babi dan sapi

1.4. Tujuan Penelitian

1. Menentukan kondisi optimal proses isolasi DNA dalam simulasigummy

vitamin C

2. Mendeteksi DNA gelatin babi dan gelatin sapi pada simulasigummy

vitamin C melalui amplifikasi DNA menggunakan real-time PCR


21/70

4


1.5. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah memberikan

informasi tentang metode deteksi DNA pada gelatin babi dan gelatin sapi

yang dibuat dalam simulasigummyvitamin C dengan instrumenReal-Time

PCR sehingga dapat dijadikan dasar penelitian selanjutnya pada sampel

berbasis gelatin dalam produk obat di pasaran.


22/70


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Gummy Candy

Gummy Candy yaitu permen lunak yang diproses dengan

penambahan komponen hidrokoloid seperti agar, gum, pektin, pati,

karagenan, gelatin, dan lain-lain digunakan untuk modifikasi tekstur sehingga

menghasilkan produk yang kenyal, harus dicetak dan diproses aging sebelum

pengemasan (SNI, 2008).

Gummy candy adalah permen unik berasal dari gelatin sebagai

gelling agent, dan terjadi penyerapan air pada saat pengunyahan di mulut.

Gelatin dalam industri gula tidak hanya digunakan untuk gel termoversibel,

tetapi juga untuk pembentukan busa, busa yang dihasilkan untuk

menstabilkan, mengikat, dan pengemulsi kualitas serta untuk mengontrol

kristalisasi. Bahan dasar dari gummy candy terdiri dari empat bahan dasar,

yaitu sirup glukosa, sukrosa, gelatin, dan air. (Schreiber, 2007).

Gambar.1. Gummy candy(Sumber: GMIA, 2012)

2.2. Vitamin C

Vitamin adalah senyawa organik yang termasuk bahan makanan esensial

diperlukan oleh tubuh, tetapi tubuh sendiri mensintesis vitamin yang mana


23/70

6


laju sintesis vitaminnya kurang dari yang dibutuhkan oleh tubuh untuk tetap

sehat. Vitamin dalam tubuh berfungsi sebagai zat untuk pertumbuhan dan

pemeliharaan jaringan melalui peranannya. Vitamin dikenal sebagai

mikronutrien karena dibutuhkan pada manusia hanya dalam jumlah miligram

atau mikrogram per hari, jumlah vitamin yang sangat kecil sudah mencukupi

dari sekitar 0,01 mg hingga 100 mg per hari tergantung pada jenis vitamin

tetapi defisiensi vitamin dapat menyebabkan permasalahan berat. Kelebihan

salah satu vitamin pada tubuh dalam jumlah yang banyak dikenal dengan

istilah hipervitaminosis. Hiperavitaminosis vitamin yang larut dalam air tidak

dapat menimbulkan masalah karena vitamin ini pada umumnya dibuang

melalui urine, berbeda halnya dengan vitamin larut lemak dapat menimbulkan

masalah. Secara klasik vitamin diklasifikasikan atas dasar kelarutannya, yaitu

golongan vitamin yang larut dalam lemak (A,D,E,K) dan golongan vitamin

larut dalam air yaitu vitamin C dan B-kompleks. Vitamin yang larut dalam

lemak tidak diekskresikan tetapi didepositkan dalam lemak tubuh, sehingga

kelebihan dosis bisa mengakibatkan akumulasi senyawa hingga kadar

mencapai toksik (Sumardjo, 2006; Campbell, 2004 ).

Vitamin C merupakan suatu zat yang berbentuk serbuk kristal putih, tidak

berbau dan memiliki rasa asam. Kelarutan vitamin C yaitu mudah larut dalam

air, sedikit larut dalam etanol dan praktis tidak larut dalam dietil eter. Vitamin

C diperlukan dalam sintesis jaringan ikat.Vitamin E bersama dengan vitamin

C melindungi fosfolipid dalam membran dari oksidasi. Dosis harian untuk

dewasa yang digunakan yaitu 30-100 mg perhari (Japanese Pharmacopeia

edisi ke-15; Martindale edisi ke-36 ).

2.3.

Gelatin2.3.1.Definisi Gelatin

Gelatin berasal dari kata gelatus yang berarti pekat. Gelatin adalah

suatu zat yang diperoleh dari hidrolisa parsial kolagen berasal dari kulit,

jaringan ikat putih dan tulang hewan. Gelatin yang berasal dari prekusor yang

diasamkan dikenal dengan gelatin tipe A dan yang berasal dari prekusor yang

dibasakan dikenal sebagai gelatin tipe B (Farmakope IV,1995). Gelatin tipe

A berasal dari kulit babi dan gelatin tipe B berasal dari kulit sapi. Gelatin yang


24/70

7


berasal dari mamalia lebih banyak digunakan dalam produksi makanan karena

memiliki sifat-sifat yaitu titik leleh tinggi, gelling agent yang bagus serta

termo reversible (Hafidz, 2011).

Gelatin tersusun dari 18 asam amino yang saling terikat, terdiri dari

asam aspartat, asam glutamat, serin, valin, tirosin, lisin, treonin, arginin,

glisin, histidin, hidroksiprolin, isoleusin, leusin, hidroksilisin, fenilalanin,

prolin, alanin dan metionin. Susunan asam amino gelatin berupa triplet

peptida, yaitu Glisin-X-Y, dimana X umumnya adalah asam amino prolin dan

Y umumnya adalah asam amino hidroksiprolin. Senyawa gelatin merupakan

suatu polimer linier yang tersusun oleh satuan terulang asam amino glisin-

prolin-prolin dan glisin-prolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk

rangkaian polipeptida (Suryani, Sulistiawati,Fajriani, 2009).

Aplikasi gelatin dalam makanan maupun produk farmasi digunakan

untuk memproduksi permen berbasis gelatin seperti gummy, emulsifier,

thickener,dan aplikasi dalam farmasi seperti cangkang hard capsuledansoft

capsul, mikroenkapsulasi dan lain sebagainya (GMIA, 2012).

Tabel 1. Aplikasi Gelatin(Sumber: GMIA, 2012)

2.3.2.Sifat Kimia dan Fisika Gelatin

Gelatin berbentuk serbuk kasar berwarna kuning samar tidak berbau

dan tidak berasa. Dengan kelarutan praktis tidak larut dalam aseton,

kloroform, etanol (95%), eter dan metanol. Larut dalam gliserin, larutan asam,

larutan basa, dan air pada suhu di atas 40C. Gelatin kering stabil dengan

udara berbeda dengan larutan gelatin yang stabil dalam penyimpanan lama


25/70

8


pada kondisi dingin tetapi substansi gelatin terdegradasi oleh bakteri. Pada

suhu di atas 50C larutan gelatin mengalami perlambatan proses

depolimerisasi dan penurunan kekuatan gellingnya, tetapi pada suhu di atas

65C proses depolimerisasi menjadi lebih cepat daripada dibawah suhu 65C.

Tingkat dan luasnya proses depolimerisasi gelatin tergantung pada berat

molekul. Pada berat molekul yang lebih rendah lebih cepat mengalami

penguraian dibandingkan dengan berat molekul yang tinggi. Pada

penyimpanan gelatin disimpan pada ruangan yang kering dalam wadah kedap

udara (Handbook of Pharmaceutical Excipient,edisi ke-6).

Gelatin bersifat amfoter, yaitu dapat stabil dalam asam dan basa.

Dalam larutan asam gelatin bermuatan positif dan bermigrasi sebagai kation

dalam medan listrik. Dalam larutan alkali gelatin bermuatan negtaif dan

bermigrasi sebagai anion dalam medan listrik. pH isoelektrik gelatin tipe A

yaitu pada pH 7 sampai pH 9, sedangkan pada tipe B memiliki pH isoelektrik

pada pH 4,7 hingga 5,4 (GMIA, 2012).

2.3.3.Sumber Gelatin

Gelatin merupakan produk yang diperoleh dari bahan baku kolagen,

sifat-sifat gelatin tergantung pada sumber dan jenis kolagen, biasanya kolagen

diproduksi dari kulit dan tulang sapi, babi dan ikan (Wangtueai and

Noomhorm, 2009). Gelatin diekstrak dari jaringan hewan kaya kolagen

seperti kulit, urat, dan tulang. Zat asing seperti mineral, lemak dan albuminoid

dipisahkan secara kimiawi atau fisika untuk mendapatkan kolagen yang murni

( GMIA, 2012). Pada proses pre treatment,jaringan hewan didihkan terlebih

dahulu dengan air yang mendidih selanjutnya akan dicampurkan asam ataubasa untuk memperoleh gelatin tipe A atau tipe B. Proses pembuatan gelatin

tipe A diperoleh dari tulang lunak ossein atau tulang tanpa mineral, otot, kulit

babi, kulit sapi dan kulit ikan. Hal yang dilakukan dalam pembuatan gelatin

yaitu pemotongan bahan-bahan dan pencucian dengan air dingin selama

beberapa jam untuk menghilangkan lemak, kemudian penambahan larutan

asam seperti HCl atau H2SO4 pada pH 1-3 dengan suhu 15- 20C hingga

bahan tersebut terlihat membesar. Proses ini terjadi selama 24 jam, setelah


26/70

9


terlihat pembesaran atau pembengkakan bahan tersebut dicuci dengan air

untuk menghilangkan kelebihan asam. Dan pH disesuaikan menjadi pH 3,5-4

(kulit babi dan kulit ikan), pH 2-3,5 (semua jaringan) untuk konversi pada

proses ekstraksi gelatin dengan air panas. Ekstraksi hidrolitik dilakukan pada

suhu 50 0C - 75 0C selanjutnya larutan gelatin disaring dengan menggunakan

bantalan selulosa yang disterilkan, kemudian deionisasikan hingga mencapai

konstentrasi 20-25 % w/v kemudian disterilisasi dengan flashingpada suhu

1380C selama 4 detik. Dan kemudian gelatin kering akan terbentuk dengan

mendinginkan larutan gelatin untuk membentuk gel selanjutnya dipanaskan

pada oven dengan suhu terkontrol (Handbook of Pharmaceutical Excipient,

edisi ke-6).

Proses pembuatan gelatin tipe B atau disebut proses pengapuran,

bahan yang digunakan yaitu tulang demineralisasi atau kulit sapi. Proses

pembuatan gelatin tipe B diawali dengan mencampur bahan dengan kalium

hidroksida selama 2- 4 bulan pada suhu 140C-180C. Pada akhir proses

pengapuran, bahan dicuci dengan air dingin selama 24 jam untuk menghapus

larutan kapur yang masih ada di dalam bahan tersebut. kemudian bahan

dinetralkan dengan asam HCl, H2SO4, atau H3PO4. Dan proses ekstraksi

gelatin sama dengan cara ekstraksi gelatin tipe A (Handbook of

Pharmaceutical Excipient,edisi ke-6).

2.4. Sel

Sel adalah unit kehidupan struktural dan fungsional terkecil dari

tubuh. Sebagian besar reaksi kimia untuk mempertahankan kehidupan

berlangsung dalam sel. Sel dan zat intraseluler membentuk keseluruhanjaringan tubuh. (Sloane Ethel, 1995).

Hampir semua sel memiliki empat karakter sebagai berikut :

1.

Dikelilingi oleh membran

2. Sebuah cairan tebal berada di dalam membran bersama yang berisi

beberapa komponen sel (organel) disebut protoplasma

3. Organel, yang terletak di dalam protoplasma (eukariot) yang melakukan

fungsi seluler tertentu


27/70

10


4. Sebuah pusat pengontrol yang disebut inti atau nukleus (pada eukariot)

atau nukleoid (pada prokariot) yang berisi DNA materi herediter

(Alters,2000)

Berdasarkan sitologi, organisme dapat dikategorikan menjadi dua

kelompok, yaitu prokariotik dan eukariotik. Sel prokariotik merupakan suatu

jenis sel dengan inti yang tidak jelas hanya ada di dalam sitoplasma tampak

adanya bagian berwarna terang yang mengandung bahan DNA. Sel yang

termasuk jenis sel prokariotik yaitu jenis sel bakteri, virus, ganggang biru, dan

ganggang hijau. Sedangkan sel eukariotik berbeda dengan sel prokariotik,

yaitu sel eukariot memiliki inti sel yang jelas karena inti sel ini memiliki

dinding atau membran inti. Yang termasuk dari jenis eukariotik yaitu sel

manusia, sel hewan, dan sel tumbuhan ( Juwono dan Juniarto Zulfa Ahmad,

2000).

Gambar 2. Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik(Sumber: Alters,2000)

Sel Prokariotik Sel Eukariotik


28/70

11


Tabel.2. Perbedaan sel eukariotik dan sel prokariotik (Sumber: Black, 2008)

Karakteristik Prokariotik Euokariotik

Struktur Genetik

DNA Kromosom sirkular

tunggal

Kromosom

berpasangan

Lokasi informasi genetik nukleoid Membran nukleus

Nukleus Tidak ada Ada

Histon Tidak ada Ada

DNA ekstrakromosal Di plasmid Di organel sel seperti,

mitokondria,

kloroplas,dan plasmid

Struktur Intraseluler

Benang mitosis Tidak ada Terdapat selama

pembelahan sel

Membran dalam Hanya terdapat pada

fotosintesis organisme

Terdapat pada organel

yang tertutup

membran

Retikulum endoplasma Tidak ada Ada

Kloroplas Tidak ada Ada

Aparatus golgi Tidak ada Ada

Lisosom Tidak ada Ada

Peroksisom Tidak ada Ada

Ribosom 70s 80s terdapat pada

sitoplasma dan

retikulumendoplasma, dan 70s

terdapat pada organel

lainnya

Sitoskelesion Tidak ada Ada

Sel Ekstraseluler

Dinding sel Peptidoglikan terdapat

pada kebanyakan sel

Selulosa, kitin. Atau

keduanya terdapat


29/70

12


pada tanaman dan

jamur

Pemukaan lapisan flagella Kapsul atau lapisan

yang berlendir ketika

mengandung fibril

atau flagelin

Ketika terlihat seperti

memiliki kandungan

membran yang

tertutup oleh

mikrotubuli

2.5.DNA

Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi

genetik dalam sel. Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA

(asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan

informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu,

yang akan diwariskan ke generasi berikutnya. (Ghaffar,2009).

DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida-

nukleotida dalam DNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan

fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu

nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat

dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan karbon

pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan karbon

kelima dari gula yang sama (Stryer, 1988).

2.5.1.Struktur DNA

DNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari

subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiridari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau

ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.1). Basa yang

ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan

basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U) (Gambar 3). Monomer

nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3, gugus fosfat

pada posisi karbon 5 dan basa pada posisi karbon 1 molekul gula.


30/70

13


Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester

antara gugus 5fosfat dengan gugus 3hidroksil (Ghaffar, 2007).

Gambar.3. Struktur nukleotida(Sumber: Ghaffar, 2009)

Struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang

memutar ke kanan. Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang

sama dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara

basa-basanya. Basa guanin berpasangan dengan basa cytosin, sedangkan basa

adenin berpasangan dengan basa tymin. Antara basa guanin dan basa cytosin

terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenin dan tymin terbentuk

dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan

selalu sama dengan jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian

jumlah basa purin (A + G) akan sama dengan jumlah basa pyrimidin (C + T).

Kedua untai DNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya

dengan arah antiparalel (berlawanan 5 3 vs 35), ujung yang

mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5 sedangkan pada ujung

lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut ujung 3. Kedua

untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk struktur heliks ganda.

Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang punggung

(backbone) molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang

melekat pada molekul gula.


31/70

14


Gambar.4. Struktur DNA(Sumber: Black, 2008)

Untai heliks DNA dapat memisah menjadi struktur untai tunggal

dengan adanya pemanasan dengan suhu tinggi (> 90C), peristiwa ini sering

dikenal dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible. Proses

pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi

disebut renaturasi. Proses renaturasi dapat berjalan jika suhu mendekati suhu

subdenaturasi (mendekati 60C) (Yuwono, 2009). Selain itu derajat

keasaman pH yang ekstrim (pH 10) dapat menyebabkan DNA

terdenaturasi (Fatiyach et al, 2011).

2.5.2.Isolasi DNA

Pada proses analisis atau proses yang berkaitan dengan DNA

dibutuhkan proses isolasi dan purifikasi DNA yang mana DNA terbungkus

di dalam sel. Sebuah teknik yang ideal harus mengoptimalkan hasil DNA,

meminimalkan degradasi DNA, dan efisiensi dalam biaya, waktu dan tenaga

(Cheng Hon et al., 2010 ). Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA

kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.Ada tiga

langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis),

pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise,

atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk

membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan

protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi


32/70

15


untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya

ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90C untuk menginaktifasi enzim

yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi

dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Ghaffar, 2007; Ardiana,

2009). Salah satu cara untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA dengan

menggunakan larutan EDTA, larutan tersebut mengandung ion pengkelat

Mg2+ dikombinasi dengan enzim pendegradasi membran sel yaitu enzim

lisozim. Setelah DNA terlepas dari sel maka selanjutnya dilakukan eliminasi

RNA dengan enzim Rnase. (Rapley dan Walker, 2000). RNAse merupakan

endoribonuklease yang secara khusus mendegradasi C dan U pada untai

tunggal RNA. RNase memotong rantai fosfodiester antara 5-ribosa pada

nukleotida dan kelompok fosfat pada 3- ribosa pirimidin yang saling

berdekatan (Blackburn & Moore, 1982; Raines, 1998). Adanya garam

(NaCl) dengan konsentrasi tinggi dapat mengendapkan protein karena

adanya fenomena salting-out (Kurniati, 2009).

Purifikasi DNA bertujuan untuk menghilangkan kontaminan

(protein) selain DNA. Salah satu metode purifikasi DNA hasil ekstraksi

adalah metode ekstraksi fenol-kloroform. Campuran fenol dan kloroform

merupakan campuran yang homogen (Sambrook dan Russell, 2001).

Cara ini menghilangkan protein dengan penambahan fenol atau campuran

fenol: kloroform : isoamil alkohol (50:49:1). Larutan organik ini

mengendapkan protein yang akan menggumpal pada batas antara fase air dan

fase organik. Fungsi isoamil alkohol untuk mencegah terjadinya emulsi

(Sudjadi, 2008).

Metode pengendapan DNA paling banyak dilakukan dengan etanolyang mengandung natrium klorida pada suhu -200C. Pada preparasi sampel

DNA, setelah pengendapan dengan etanol, DNA disentrifugasi kemudian

dilarutkan kembali dalam buffer TE. DNA plasmid dapat dimurnikan lebih

lanjut dengan sesium klorida. Sedangkan preparasi DNA kromosom,

endapan DNA akan berbentuk kabut putih berisi molekul DNA dalam bentuk

benang panjang yang dapat diambil dengan batang pengaduk (Sudjadi,

2008).


33/70

16


Pada zaman modern ini, telah dilakukan pengembangan dan

modifikasi proses ekstraksi DNA, salah satunya menggunakanspin coloumn

yang mengandung silicon dioxide. Prinsip dari metode ini adalah

berdasarkan tingginya afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA

terhadap partikel silika yang bermuatan positif.DNA dapat terikat dengan

kuat pada silika dibawah kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl.

Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA

dengan ion hidrogen pada air. DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat

dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni

kemudian dapat dielusi dari silika dengan buffer Tris-EDTA atau Aquabidest

(Chee Tan dan Chin Yiap, 2009).

Untuk mengukur DNA, dapat dilakukan pengukuran konsentrasi

DNA dengan spektrofotometri UV. Kemurnian larutan DNA murni memiliki

rasio A260/A280 adalah 1,8. Jika rasio kurang dari 1,8 menunujukkan

adanya pengotor protein atau fenol, sedangkan jika rasio lebih dari 1,8

menunjukkan adanya RNA (Sudjadi, 2008).

2.5.3.DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel intraseluler dengan ukuran 0,2 m

sampai 0,5 m, berbentuk bulat atau berbentuk tongkat. Mitokondria

diselubungi oleh dua membran yaitu membran luar bersifat licin dan

berhubungan dengan sitoplasma, sedangkan membran dalam berbentuk

lekukan dan lipatan ke dalam disebut dengan krista. Fungsi mitokondria

sebagai tempat respirasi sel, yaitu proses katabolik yang membutuhkan

oksigen dalam produksi adenosin trifosfat (ATP). Di dalam mitokondria

mengandung DNA dan ribosom yang berfungsi melaksanakan proses sintesisprotein (Brensick, 1996).

Ukuran DNA mitokondria pada hewan 15 sampai 20 kb dan

mengandung 37 gen (Boore, 1999). Penggunaan MtDNA dalam analisis

karena memiliki jumlah kopi tinggi menjadikannya mudah diisolasi dan

dipurifikasi untuk keperluan analisis genom (Sholihin, 1994).


34/70

17


Gambar 5. Struktur DNA Mitokondria

(Sumber : Moraes et al, 2002)

2.6. PCR

Polymerase Chain Reaction(PCR) adalah suatu teknik sintesis dan

amplifikasi DNA secara in vitro, dimana setiap fragmen DNA dapat

diamplifikasi dengan cepat tanpa menggunakan sel. DNA diinkubasi dalam

tabung reaksi dengan DNA polimerase jenis khusus, suatu pasokan

nukleotida, dan potongan pendek DNA untai tunggal sintetik yang berfungsi

sebagai primer. (Campbell, Reece Nail, Jane B., Mitchell, Lawrence G.

2002).

PCRmemungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer,

hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel ( in

vivo). Pada prosesPCRdibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagaicetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi)

untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase,

deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida.

Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan

untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen

DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus

hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA


35/70

18


templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer

dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan

nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan

fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang

ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh

enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut

reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan

dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA

templat (Ghaffar, 2007).

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga

tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat,

penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan

pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh

DNA polimerase. (Ghaffar, 2007).

2.6.1.Komponen PCR

Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah

fragmen DNA yang akan diamplifikasi (template DNA), sepasang primer,

yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang

komplementer dengan urutan nukleotida DNA template, dNTPs

(Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, magnesium klorida (MgCl2)

dan enzim polimerase DNA yang tahan panas (Taq polymerase). Semua

komponen PCR dicampur dalam total volume 10 50 L (Muladno, 2010;

Handoyo dan Rudiretna, 2001; Sulistyaningsih, 2007).

1. Taq DNA PolymeraseEnzim ini bersifat termostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus.

Akitivitas polimerisasi DNA dari ujung-5 ke ujunug-3, dan aktivitas

enzimatik ini memiliki waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95 C.

Biasanya untuk setiap 100 uL volume reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 unit

Taq polymerase. Penggunaan enzim ini harus memperhatikan proses

penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20C), dan pada saat


36/70

19


pengambilan tidak boleh terlalu lama di suhu ruang. Hal ini dilakukan

untuk meminimalkan kerusakan enzim akibat pengaruh suhu.

2.

Primer

Merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai

urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang

primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu

diketahui urutan 55 nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer

oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA

synthesizer.

Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 16

30 nukleotida dan mempunyai 40 60 % GC content. Sekuen primer

kurang dari 16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik.

Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming

(penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan menyebabkan

berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan

berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk

panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas

primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan biaya yang lebih

mahal.

Interaksi primer-primer seperti self-homology dan crosshomology

harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya misprimingpada daerah

lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas

primer menjadi rendah di samping itu konsentrasi primer menjadi

berkurang.

Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untaiganda DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena

Tm primer sangat berpengaruh di dalam pemilihan suhu annealingproses

PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara

teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) +

4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 5065C.

3.dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates)


37/70

20


dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP

(deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP

(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam

proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang

diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus

OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer

dengan untai DNA template. Konsentrasi dNTP harus seimbang untuk

meminimalkan kesalahan penggabungan. Konsentrasi dNTP yang rendah

akan mengurangi terjadinya mispriming pada daerah non target dan

menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah, oleh

karena itu spesifitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi

dNTP yang lebih rendah.

4.Buffer PCR dan MgCl2

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh

karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi

buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR

diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2.

MgCl2bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas

DNA polimerase. Adanya MgCl2 akan meningkatkan interaksi primer

dengan template DNA.

5.

DNA Template

Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan

untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul DNA

yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi. Template DNA

dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNAapapun asal di dalam DNA template tersebut mengandung fragmen DNA

target yang dituju. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama

keberhasilan PCR, berapapun panjangnya asal mengandung sekuen yang

diinginkan. Konsentrasi DNA template harus dioptimasi. Jika

konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat

menemukan target, sebaliknya bila terlalu tinggi akan meningkatkan


38/70

21


kemungkinan mispriming. Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian

template karena dapat mempengaruhi hasil reaksi.

2.6.2. Tahapan PCR

1.Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi

dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi

menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang

komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi 53 enzim tidak berjalan,

misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi

biasanya dilakukan antara suhu 90C95C.

2.Penempelan Primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju

daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses

annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan

komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50C

60C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan

hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali

apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 C.

3.Reaksi Polimerisasi

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi

pada suhu 72 C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami

perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang

komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

Gambar.6. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi,

penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya(Sumber: Ghaffar, 2007)


39/70

22


Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh

dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon

yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat

dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah

jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum

siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2

siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan

seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara

eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase

pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu

nukleotida A pada ujung 3 dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga

nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor

yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5-nya. Proses PCR

dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler (Ghaffar,

2007).

2.7. Real-T ime PCR

Real-time PCR adalah suatu metode untuk mendeteksi dan

penghitungan sinyal fluoresensi sebanding dengan dihasilkannya produk

PCR setiap siklus amplifikasi PCR (Dennis Lo et al., 2006). Kuantifikasi

level ekspresi gen dapat menghasilkan petunjuk tentang fungsi gen, sebagai

contoh yaitu pengukuran ekspresi gen dapat membantu mengidentifikasi

jenis sel atau jaringan dimana gen tersebut diekspresikan, selain itu juga

menunjukkan tingkat ekspresi gen keadaan biologis individu seperti jenis

penyakit yang terdapat pada individu tersebut (Fraga et al., 2008).Penggunaan Real-time PCR memiliki beberapa keunggulan yaitu mampu

menganalisis sampel dengan jumlah relatif sedikit, memiliki kemampuan

untuk menghasilkan data cepat dan akurat, dan mampu menganalisis lebih

dari satu gen dalam satu waktu (Fraga et al., 2008).

Dalam penggunaan alat real-time PCR memiliki dua jenis

komponen bahan kimia untuk mendeteksi sampel selama siklus PCR yaitu

pewarna fluoresensi SYBR greendan probe DNA. Pewarna berfluoresensi


40/70

23


menginterkalasi DNA beruntai ganda, sedangkan probe DNA terdiri dari

oligonuklotida yang dihubungkan dengan pewarna fluoresensi dan quencher.

Pada proses pendegradasian melepaskan pewarna fluoresensi dari komponen

yang berfungsi untuk pendegradasi sehingga menghasilkan emisi fluoresensi

yang sebanding dengan jumlah template DNA. Sinyal fluoresensi yang

terbentuk diukur dan digunakan untuk kuantisasi DNA (Hui Chai et al.,

2011).

Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dan mengukur

peningkatan fluoresensi yang dihasilkan dari sintesis DNA. Fluoresensi ini

dihasilkan ketika terjadi peningkatan ikatan double strand DNA dengan

pewarna atau probefluorogenicpada pencampuran amplifikasi. Peningkatan

fluoresensi digambarkan dengan kurva yang terdiri dari tiga buah fasa yaitu

fasa awal atau fasa inisiasi yaitu fase terjadi pada siklus pertama PCR dimana

pancaran fluoresensi belum dapat dibedakan dari baseline, fasa eksponensial

atau fasa puncak merupakan fase peningkatan eksponensial dalam

fluoresensi sebelum fase plateau tercapai, dan fasa plateau atau fasa stabil

yaitu tidak terjadi peningkatan fluoresensi yang diamati (Vaerman, 2004;

Rodriguez, 2013).

Instrumen Real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu

thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi

data, dan software sebagai analisa data. Real-time PCRdapat menganalisa

banyak sampel hingga 96 sampel menggunakan multiwell plates (Rochec,

2008).

Gambar 7. Bentuk KurvaReal- Time PCR

(Sumber :Rodriguez, 2013)


41/70


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Halal Food and Drug

Analysis, Laboratorium Penelitian II, dan Laboratorium MPR Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah, Jakarta. Waktu pelaksanaan dari bulan Januari 2014 hingga

Desember 2014.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril,

mikropipet ukuran 10 L, 200 L, 1000 L [BIO RAD], tips 10 L, 100

L, 1000 L, tube dan mikro tube, high pure filtrationn tube [Roche],

collectiontube [Roche], Spektrofotometer Nano Drop [BioDrop], dan mesin

real-time PCR [LightCycler 480.0-Roche]. Alat gelas yang digunakan

adalah gelas ukur, gelas beaker [Pyrex], batang pengaduk dan cawan

penguap.

3.2.2.Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging

sapi, daging babi, standar gelatin babi dan gelatin sapi pro analisa [Sigma

Aldrich], sukrosa, sirup glukosa, asam sitrat, tartrazine [Sigma Aldrich],

aquadest, aquabidest, gelatin sapi teknis [EMS], Natrium Asetat 3M[Merck], Isopropanol [Merck] satu set High Pure PCR Template

Preparation Kit Roche (meliputi: Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer,

Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution

Buffer),etanol absolut [Merck],isopropanol [Merck], ddH2O [Roche], LC

TaqMan Probe Master [Roche] yang terdiri: FastStart Taq DNA

Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl26,4 mM. Dan primer-probe seperti

pada tabel berikut.


42/70

25


Tabel. 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi (Sumber

: Tanabe et al., 2007 dengan modifikasi)

Babi Forward

Reverse

Probe

5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'

5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3'

Sapi Forward

Reverse

Probe

5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

5'-AATGGGATTTTGCTACGTCTGAGG-3'

5'-(FAM)-CCACCTACTATTCCTCCACGAAACA-(BHQ1)-3'

3.3. Tahapan Penelitian

1.Pembuatan GummySimulasi Vitamin C Dari Gelatin Babi Dan Gelatin

Sapi

2.Isolasi DNA dari Daging, Gelatin, dan GummySimulasi

3.Analisis Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan

Spektrofotometri DNA

4.

Amplifikasi Isolat DNA denganReal-Time PCR

5.Analisis Hasil Amplifikasi

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1.Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi dan Gelatin

Sapi

Sebanyak 0,95 gr sukrosa, 0,9 gr glukosa dan 0,05 gr asam sitrat

dilarutkan dengan 1,4 mL aquadest diatas penangas air pada suhu 65 C

(larutan A). Pada wadah lain 0,5 gr gelatin dilarutkan dengan 1 mL aquadest

di atas penangas air dengan suhu 60 C (Larutan B). Sebanyak 0,075 gr

vitamin C dilarutkan dengan 0,1 ml aquadest diaduk hingga melarut (Larutan

C). Kemudian larutan A dan larutan C dicampur pada larutan B, diadukhingga homogen. Sebanyak 0,025 ml tartrazine dicampurkan ke larutan B

diaduk hingga terlihat warna yang homogen. Massa yang terbentuk disimpan

di dalam refigrator selama 24 jam. Untuk pembuatan sampel simulasigummy

dengan berbagai presentase campuran babi sama perlakuan dengan prosedur

di atas (Schrieber and Gareis, 2007 dengan modifikasi).


43/70

26


Tabel.4. Komposisi Formula Simulasi GummyVitamin C

Bahan

Konsentrasi

%

Penimbangan Bahan

Gummy

Simulasi

Sapi

Gummy

Simulasi

1% Babi

Gummy

Simulasi

25%

Babi

Gummy

Simulasi

50%

Babi

Gummy

Simulasi

75%

Babi

Gummy

Simulasi

Babi

Sukrosa 19 % 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr

Glukosa 18 % 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr

Gelatin

*) Gelatin Sapi

*) Gelatin Babi

10 % 0,5 gr

-

0,495 gr

0,005 gr

0,375 gr

0,125 gr

0,25 gr

0.25 gr

0,375 gr

0,125 gr

-

0,5 gr

Asam sitrat 1 % 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr

Vitamin C 1,5 % 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr

Tartazine 0,5 % 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml

Aquadest 50 % 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

Total 100 % 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr

3.4.2. Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure

PCR Template Preparation Kitdari Roche.

1.Preparasi sampel

a.Daging Segar (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012)

Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi dan daging babi

dipotong halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut

dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube

tersebut masing-masing ditambahkan 200 l Tissue Lysis Bufferdan 40

l larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan

diinkubasi pada suhu 55C selama 24 jam dalam waterbath.

b.Gelatin dan Sampel Simulasi GummyVitamin C (Rochea, 2012; Erwanto

et al., 2012;Sambrook et al, 2001 dengan modifikasi)

Sebanyak 500 mg masing-masing gelatin sapi, gelatin babi dan

sampel simulasi gummy vitamin C dimasukkan ke dalam

microtube,sampelsimulasi gummyvitamin C dileburkan diatas penangas


44/70

27


dengan suhu 60C. Kemudian ditambahkan 500 L natrium asetat 3M

dan 500 L isopropanol (equal volume). Sampel dikocok dengan

membalikkan tube tiga kali hingga homogen.

2.

Proses isolasi DNA (Roche a, 2012; Erwanto et al., 2012)

Sebanyak 600 L sampel yang diambil dari campuran natrium asetat dan

isopropanol dilarutkan dalam 200 uL Tissue Lysis Buffer dan 40 uL

proteinase K kemudian diinkubasi pada suhu 55 C selama 24 jam.

Setelah sampel melebur, ditambahkan 200 uL binding bufferdivortex

selama 2 menit lalu diinkubasi pada suhu 70 C selama 10 menit. Lalu

ditambahkan 200 l isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex

selama 2 menit. Campuran sampel dipipet ke atasHigh Pure Filter Tube

yang telah dipasangkan Collection Tube, kemudian tube ditutup dan

dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit.Filter

tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter

dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali

dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 l Inhibitor

Removal Buffermelalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi

kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube

dilepaskandari collection tubedan cairan yang melewati filter dibuang

bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan

collection tube yang baru. Ditambahkan 500 l Wash Bufferkemudian

sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit.Filter

tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter

dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali

dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 l Wash Buffer

kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1

menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang

melewati filter dibuang.Filter tubedipasang kembali dengan collection

tube dan dilakukan sentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan

maksimum. Hal ini dilakukan agar semua wash buffer tidak tertinggal

pada filter. Collection tube dilepaskan dari Filter tube dan dibuang.

Untuk mengelusi DNA yang terdapat pada filter, pasang Filter tube


45/70

28


tersebut pada 1.5 mlMicrosentrifuge tube yang bersih dan steril.Elution

Bufffer dihangatkan dengan Penangas Air pada suhu 70oC terlebih

dahulu. Kemudian ditambahkan 150 l Elution Buffer yang telah

dihangatkan sebelumnya dan penambahan elution buffer dibagi menjadi

tiga kali dengan volume 50 uL. Sentrifugasi kembali selama 1 menit

dengan kecepatan 8000 rpm. Filter tube dilepaskan. Pada

Microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi yang dapat

disimpan pada suhu 2oC, 8o C, 15o C, dan 25oC untuk dianalisa

selanjutnya.

3.4.3.Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan

Spektrofotometer DNA

Alat spektrofotometer Biodrop dinyalakan, bagian nucleic

acidditekan. Dipilih pathlength 0.5mm. Pedestal dibersihkan terlebih

dahulu dengan tissu kemudian dipipet sebanyak 1 Lblanko elution buffer

dan diteteskan pada pedestal. BagianBLANKpada layar ditekan untuk

pengukuran blanko, setelah selesai pedestal dibersihkan dengan tissue.

Larutan isolat DNA sebanyak 1L dipipet dan dimasukkan ke dalam

pedestal, kemudian klik tombol Measure sehingga layar akan

menampilkan spektrum dan jumlah konsentrasi yang dihitung (Biodrop,

2012).

3.4.4.AmplifikasiReal-T ime PCR

Proses yang dilakukan pada amplifikasi DNA dengan Real Time

PCR adalah sebagai berikut:

Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 M dibuat

dan dimasukkan ke dalam tube.Primer dan probe konsentrasi 10 M yangdibuat dari larutan induk 100 M dan disimpan ke dalam tube yang lain.

Kemudian Master Mix dibuat dengan volume total 20 L yang terdiri dari 5

L template DNA, 1.4 L Aquabidest, 1.6 L primer forwardkonsentrasi

0,8 M, 1.6 L primer reversekonsentrasi 0,8 M, 0.4 L probe konsentrasi

0,2 M, dan 10 L LightCycler 480 probe master (enzim FastStart Taq

DNA Polymerase,dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl2). Masing-masing DNA

template dimasukkan ke well terlebih dahulu kemudian master mix


46/70

29


dimasukkan ke dalam multiwell platepada well yang diinginkan dan ditutup

dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan programLightCycler 480

Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah

campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran

reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plateyang ditutup menggunakan

sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen

Real-Time PCRakan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung

memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva (Rochec,

2008).

Gambar.8. Program AmplifikasiReal-Time PCR

(Sumber : Rochec,2008)


47/70


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.

Pembuatan Simulasi GummyVitamin C

Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C

Pada penelitian ini dilakukan pembuatan simulasigummyvitamin C

yang terdiri dari simulasi gummyvitamin C sapi, simulasigummy vitamin

Cbabi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan

persentase 1% babi, 25% babi, 50% babi, dan 75% babi.Formulasi simulasi

gummy vitamin c yang digunakan adalah sukrosa dan glukosa sebagai

pemanis, gelatin sebagai basis gummy, asam sitrat sebagai agen pengasam

dan tartrazin sebagai pewarna. Formulasi gummy simulasi vitamin C

merupakan modifikasi dari formulasi gummy yang terdapat pada Gelatine

Handbook : Theory and Industrial Practice (Schriber & Gareis, 2007).

Simulasi Gummy vitamin C yang dihasilkan pada penelitian ini

memiliki sifat organoleptis yaitu berwarna oranye, memiliki rasa asam,

kenyal, dan meleleh dalam mulut saat dikunyah. Berat sediaangummyrata-

rata 3,8 gr. Berat sediaan tersebut masih belum memenuhi standar berat

sebenarnya yaitu 5 gr. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal

diantaranya sisa larutan gummymasih ada yang menempel pada dinding

cawan sehingga tidak tertuang keseluruhan.

4.2.Isolasi DNA

Proses isolasi DNA merupakan tahap awal sebelum dilakukannya

analisis sumber DNA pada sediaan gummy simulasi vitamin C. Isolasi DNA

dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari daging sapi, daging babi,


48/70


49/70

32


terlebih dahulu dengan 200 L tissue lysis buffer. Larutan tissue lysis buffer

mengandung EDTA yang merupakanzat yang mengikat ion magnesium

pada dinding sel sehingga memudahkan proses pelisisan dinding sel

(Sudjadi, 2008). Urea 4M merupakan zat kaotropik yang mendenaturasi

protein pada sel. Tris 200 mM sebagai buffer yang menjaga kestabilan pH

DNA efektif pada pH 7-9 (Tan Alex, 2014).

Langkah selanjutnya sampel ditambahkan proteinase K lalu

diinkubasi pada suhu 55C selama 24 jam. Proteinase K berfungsi sebagai

pendegradasi protein yang terikat pada DNA. Proses degradasi protein

diperlukan kondisi yang optimal pada suhu 50-55 C dengan pH 7.5 sampai

8 (Kieleczawa, 2006).

Selanjutnya ditambahkan 200 L binding buffer diinkubasi 10 menit

pada suhu 70 C dan ditambahkan 250 L isopropanol untuk mengikat

DNA pada membran. Larutan sampel kemudian dimasukkan pada filter tube

yang telah terpasang pada collection tube kemudian disentrifugasi. Filter

tubeyang telah digunakan sebelumnya, dipasangkan collection tubebaru

dan ditambahkan inhibitor removal buffer.Tujuan dari penambahan

inhibitor removalbufferini adalah untuk menghilangkan zat-zat pengotor

seperti protein yang menghambat pada amplifikasi PCR. Filter tube

kemudian dipasangkan dengan collection tubebaru dan ditambahkan wash

buffer. Larutanwash bufferberfungsi menghilangkan sisa kotoran protein

dan garam kaotropik yang terikat pada DNA. Setelah dilakukan pencucian,

DNA yang terikat pada matriks silika kemudian dielusi dengan Elution

Buffer yang telah dipanaskan pada suhu 70 C, tujuan pemanasan untuk

pengelusian isolat DNA secara optimal. (Roche, 2012; Kennedy, 2010).Isolat DNA kemudian dianalisis konsentrasi dan kemurniannya dengan

spektrofotometer DNA.


50/70

33


4.3.Analisa Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan

Spektrofotometer DNA

Tabel .5. Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA

Analisa konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometer DNA. Prinsip kerja spektrofotometer DNA

sesuai dengan spektrofotometer UV tetapi pengukuran dilakukan pada

panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian isolat DNA dilihat

dengan rasio A260/A280 adalah 1,8-2 (Sambrook et al, 2001 ; Sudjadi,

2008;Conn, 2012).Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging sapi

sebesar 36,45 ng/L dan daging babi sebesar 46 ng/L. Sedangkan gelatin

sapi sebesar 29,44 ng/L, gelatin babi sebesar 10,36 ng/L, serta gummy

1% babi sebesar13,85 ng/L, gummy 25% babi sebesar 10,23ng/L,

gummy50% babi sebesar 12,06 ng/L, dangummy75% babi sebesar 30,13

ng/L. Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar

dibandingkan DNA gelatin dan DNA sampel gummy. Hal ini dikarenakan

pada daging memiliki jumlah sel yang banyak dan belum mengalami proses

pengolahan sedangkan gelatin merupakan produk hasil hidrolisis dari

kolagen yang menyebabkan denaturasi DNA sehingga DNA yang

NO SAMPEL KONSENTRASI

(ng/L)

KEMURNIAN

(A260/A280)

1 Daging sapi 36,54 1,923

2 Daging babi 46 1,804

3 Gelatin sapi 29,44 1,597

4 Gelatin babi 10,36 1,610

5 Gummysapi 17,18 1,606

6 Gummybabi 18 1,645

7 Gummycampuran babi 1% 13,85 1,565





51/70

34


didapatkan sedikit. Kemurnian DNA daging kisaran 1,9-1,8. Sedangkan

kemurnian gelatin berada pada kisaran 1,6-1,5. Sampel gummy vitamin C

memiliki kemurnian pada kisaran 1,5-1,6. Nilai kemurnian DNA pada

daging termasuk dalam kategori murni karena memenuhi rasio antara 1,8-

2,0. Adapun nilai kemurnian DNA pada gelatin maupun sampel simulasi

gummy vitamin C termasuk dalam kategori belum murni, karena nilai

kemurnian dibawah 1,8. Nilai kemurnian DNA pada sampel gelatin sapi,

gelatin babi, dan simulasi gummy vitamin C rendah disebabkan terdapat

kontaminan protein dimana nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan

persentase protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80% dan 20% selain hal

tersebut sebanyak 92% komposisi gelatin adalah protein maka dari itu

dengan presentase protein yang besar memungkinkan terdapat sisa protein

yang tertinggal dalam isolat DNA (Sambrook et al, 2001; Schrieber, 2007).

4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi Gummy

Vitamin C pada Real T ime PCR

DNA yang berhasil diisolasi kemudian diamplifikasi dengan

menggunakan alatReal-Time PCR. Komponen yang digunakan pada proses

amplifikasi Real Time PCR adalah DNA template, satu pasang primer

spesifik sapi dan babi, hydrolysis probe, dan LC 480probe master.

Proses deteksi dengan alatReal Time PCRmembutuhkan sepasang

primer spesifik dengan spesies DNA sapi dan DNA babi yang diidentifikasi

secara in silicodengan website BLAST NCBI.RegionDNA yang dipakai

terletak pada mitokondria cytB. Selain sepasang primer spesifik, dibutuhkan

juga pewarna fluoresensi probe. Hydrolysis probe merupakanoligonuklotida probe yang dilabel dengan pemancar atau reporter dyepada

bagian 5 eksonuklease dan peredam atau quencher dyepada bagian 3

eksonuklease. Probe pada Real-Time PCR digunakan sebagai pewarna

pendeteksi adanya sinar fluoresen yang ditangkap. Pada proses annealing

setiap siklus, reporter probe akan dipisah dari quencher probe melalui

hibridisasi atau aktifitas nuklease Taq Polimerase(Johansson, 2006).


52/70

35


Campuran reaksi total PCR (Lampiran 5) dibuat dalam volume 20 L

dengan konsentrasi tiap primer forward dan reverse 0,8 M serta untuk

konsentrasi probe adalah 0,2 M. Konsentrasi primer dan probe dibuat dari

larutan induk 10 M (Lampiran 3). Konsentrasi primer untuk PCR

sebaiknya berkisar antara 0,3-1 M dan untuk konsentrasi hydrolysis probe

berkisar antara 0,05-0,2 M (Rocheb, 2008). Konsentrasi primer yang

optimal adalah konsentrasi terendah yang dapat menghasilkan nilai CP awal

dan kurva fluoresensi yang baik, begitu juga dengan probe. Analisa kurva

amplifikasi pada Real Time PCR dapat dilihat pada kenaikan kurva

amplifikasi dan nilai CP (crossing point). Nilai crossing point(CP) yaitu

siklus dimana fluoresensi mencapai ambang batas atau threshold sehingga

terjadi peningkatan signifikan saat pertama kali terdeteksi (Rodriguez,

2013).

Gambar 10. Hasil Amplifikasi pada Uji Spesifitas Primer Sapi

Menggunakan Kontrol Positif Daging Sapi, Gelatin Sapi

dan Simulasi Gummy Vitamin C Sapi

* Keterangan :DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi;

DB = Daging Babi; GMS = Gummy Sapi; GMB =

Gummy babi; NTC = No Template Control; dan CP =

Crossing Point


53/70

36


Gambar 11. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi GummyVitamin

C dengan Primer Sapi

* Keterangan:DS = Da ging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin

Babi; DB = Daging Babi; GMS = GummySapi; GMB

= Gummybabi; NTC =No Template Control; dan CP

= Crossing Point

Sebelum pengujian sampel simulasi gummy, dilakukan pengecekan

spesifitas primer sapi dan babi. Pada uji spesifitas primer sapi dilakukan

dengan 40 siklus dengan suhu annealing61 C. Hasil dari uji terlihat pada

gambar 8 primer dan probe sapi hanya mengamplifikasi daging sapi dengan

nilai CP 18,89, gelatin sapi dengan nilai CP 25,88, dangummysapi dengan

nilai CP 26,19.

Seluruh sampel simulasigummyvitamin C diuji dengan menggunakan

primer sapi dan primer babi. Pada uji ini dilakukan dengan suhu annealing

61 C dan dilakukan sebanyak 40 siklus. Hasil kurva amplifikasi primer sapi

pada gambar 9 terlihat adanya perbedaan kenaikan kurva amplifikasi.

Kontrol positif daging sapi terlihat kenaikan kurva amplifikasi pertama kali

yaitu pada siklus 18,27 dengan konsentrasi DNA 36,54 ng/L. Kurva

amplifikasi yang kedua yaitu padagummykonsentrasi 75% babi pada siklus

24,91 dengan konsentrasi DNA 30,13 ng/L. Kurva ketiga yang muncul

yaitu kontrol positif gelatin sapi pada siklus 25,31 dengan konsentrasi DNA


54/70

37


29,44 ng/L. Kurva keempat yang muncul yaknigummysapi pada siklus

25,49 dengan konsentrasi DNA 17,18 ng/L. Adapun kurva kelima yaitu

gummybabi 50% pada siklus 26,06 dengan konsentrasi 12,06 ng/L. Kurva

keenam muncul gummy babi 25% pada siklus 26,36 dengan konsentrasi

DNA 10,23 ng/L. Secara teoritis, konsentrasi DNA yang tinggi

membutuhkan siklus amplifikasi lebih sedikit untuk mencapai CP, begitu

juga dengan konsentrasi DNA yang rendah membutuhkan siklus amplifikasi

lebih panjang untuk mencapai CP. Data di atas menunjukkan bahwa

semakin besar konsentrasi DNA maka semakin kecil nilai CP, dan

sebaliknya semakin sedikit konsentrasi DNA semakin besar nilai CP

(Rochec, 2008).

Gambar 12. Hasil Amplifikasi Pada Uji Spesifitas Primer Babi

Menggunakan Kontrol Positif Daging Babi, Gelatin Babi, dan

Simulasi Gummy Vitamin C Babi

*Keterangan :DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB

= Daging Babi; GMS = GummySapi; GMB = Gummybabi;

NTC =No Template Control; dan CP = Crossing Point


55/70

38


Gambar 13. Hasil Amplifikasi Sampel Simulasi Gummy Vitamin

C dengan Primer Babi

*Keterangan:DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin

Babi; DB = Daging Babi; GMS = GummySapi; GMB

= Gummybabi; NTC =No Template Control; dan CP= Crossing Point

Pada uji spesifitas primer babi dilakukan dengan 50 siklus lebih

panjang dari siklus uji spesifitas primer sapi dengan suhuannealing60 C.

Hasil pada pengujian ini terlihat pada gambar 10 adapun primer dan probe

babi hanya mengamplifikasi daging babi dengan nilai CP 20,77, gelatin

babi dengan nilai CP 38,40 dangummybabi dengan nilai CP 37,01. Dan

kontrol negatif tidak terjadi kenaikan kurva amplifikasi.

Pada pengujian sampel simulasi gummy dilakukan sebanyak 50

siklus dengan suhu annealing60 C. Hasil kurva amplifikasi dengan primer

babi ditunjukkan pada gambar 11. Berdasarkan hasil tersebut terlihat

kenaikan kurva pertama kali pada kontrol positif daging babi, pada siklus

ke 18,81 dengan konsentrasi DNA 46 ng/L. Kemudian pada kurva

amplifikasi kedua muncul sampel babi konsentrasi 75% pada siklus 37,20


56/70

39


dengan konsentrasi DNA 30,13 ng/L. Pada kurva amplifikasi ketiga

muncul gummy babi pada siklus 37,63 dengan nilai konsentrasi DNA 18

ng/L. Adapun pada kurva amplifikasi keempat muncul gelatin babi pada

siklus 41,62 dengan konsentrasi DNA 10,36 ng/L. Sedangkan pada kurva

kelima muncul sampel gummy 50% babi pada siklus 41,95 dengan nilai

konsentrasi DNA 12,06 ng/L. Pada kurva keenam muncul sampel simulasi

gummy25% babi pada siklus 42,08 dengan konsentrasi DNA 10,23 ng/L.

Sedangkan pada sampel gummy 1% babi tidak terlihat kenaikan kurva

amplifikasi yang disebabkan konsentrasi gelatin dalam sediaan yang relatif

kecil sehingga pada proses ekstraksi tidak didapatkan isolat DNA. Secara

teoritis, konsentrasi DNA yang tinggi membutuhkan siklus amplifikasi

lebih sedikit untuk mencapai CP, begitu juga dengan konsentrasi DNA yang

rendah membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang untuk mencapai CP.

Data di atas menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi DNA maka

semakin kecil nilai CP, dan sebaliknya semakin sedikit konsentrasi DNA

semakin besar nilai CP (Rochec, 2008).


57/70


BAB 5

KESIMPULAN

5.1. Kesimpulan

1.

Kondisi optimal proses isolasi DNA dari gummy dan gelatin diperoleh

melalui metode presipitasi DNA kombinasi natrium asetat dan isopropanol

dengan perbandingan volume 1:1.

2.Amplifikasi DNA dengan primer spesifik sapi dilakukan sebanyak 40

siklus dan kondisi annealingpada suhu 61C. Sedangkan amplifikasi DNA

dengan primer spesifik babi dilakukan sebanyak 50 siklus dengan kondisi

annealingpada suhu 60C.

3.

Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik sapi

menunjukkan bahwa kontrol positif daging sapi, gelatin sapi dan simulasi

gummy sapi teramplifikasi dengan nilai CP 18,27, 25,31, dan 25,49

sedangkan kontrol negatif tidak menunjukkan kurva amplifikasi.

4.Kurva amplifikasi real-time PCR menggunakan primer spesifik babi

menunjukkan bahwa hanya kontrol positif yang teramplifikasi yaitu pada

yanti puspitaningrum-fkik.pdf

Documents