uin syarif hidayatullah jakarta isolasi dan...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN KARAKTERISASI

BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR

RENDAMAN KACANG KEDELAI

SKRIPSI

ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH

1112102000026

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS 2016

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN KARAKTERISASI

BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR

RENDAMAN KACANG KEDELAI

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH

1112102000026

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

AGUSTUS 2016

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Zakiyah Zahra Nur Amaliah

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari

Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai

Tempe adalah makanan tradisional Indonesia, dimana dalam

pembuatannya terdapat limbah cair yang tidak dimanfaatkan kembali yaitu air

rendaman kedelai. Bakteri Asam Laktat (BAL) diketahui terdapat pada setiap

tahap pembuatan tempe termasuk pada saat perendaman kedelai. Penelitian ini

bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL yang terdapat pada

limbah cair air rendaman kacang kedelai. Setelah dilakukan pengenceran sampai

10-7

, limbah cair air rendaman kacang kedelai diinokulasikan ke dalam MRSA

tersuplementasi CaCO3 1%. Diperoleh delapan isolat dengan zona bening

disekitar koloninya dengan morfologi koloni berbeda-beda yang diduga sebagai

BAL. Kemudian dilakukan karakterisasi morfologi, biokimia, serta fisologi.

Kedelapan isolat memiliki karakteristik tidak membentuk spora, non motil,

katalase negatif, dapat tumbuh pada suhu 37° dan 45°C serta NaCl konsentrasi 4%

dan 6,5%. Hasil dari uji keamanan menunjukkan kedelapan isolat negatif untuk uji

aktivitas hemolisis. Tujuh dari delapan isolat merupakan Gram positif, sedangkan

satu adalah Gram negatif. Tetapi hanya bakteri Gram positif yang dipilih karena

memenuhi karakteristik BAL. Tujuh isolat yang memenuhi persyaratan BAL,

diduga termasuk ke dalam genus Lactobacillus dengan tipe fermentasi

heterofermentatif. Pada penelitian ini digunakan Lactobacillus casei ATCC 393

sebagai strain acuan.

Kata Kunci: Air rendaman kacang kedelai, bakteri asam laktat, isolasi,

karakterisasi

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Zakiyah Zahra Nur Amaliah

Major : Pharmacy

Title : Isolation and Characterization Lactic Acid Bacteria from Soybean

Soaking Water Liquid Waste

Tempeh is an Indonesia traditional food, which in the manufacturers have

a liquid waste that no use again namely soybean soaking water. Lactic Acid

Bacteria (LAB) has been known at every stage of tempeh production, included at

soaking soybeans. This study aimed to isolate and characterize LAB contained in

soybean soaking water liquid waste. After serial dilution to 10-7

, soybean soaking

water liquid waste was inoculated on the MRSA contained 1% CaCO3. After

incubation, there are 8 isolates which produce clear zone around their colonies

with different colony morphology suspected as LAB. Morphological,

physiological and biochemical characteristics were employed to identify LAB. All

isolates were non-spore forming, non-motile, catalase negative, grow well at 37°

and 45°C, could be able to grow in the presence of 4% and 6.5% sodium chloride.

The results of safety test showed all isolates negative for hemolytic activity. Seven

of eight isolates are Gram-positive, while one is a Gram-negative. But only Gram-

positive were chosen as they represent the LAB characteristic. Seven isolates were

identified as Lactobacillus with heterofermentative as the type fermentation. In

this study, Lactobacillus casei ATCC 393 used as reference strain.

Keywords: Characterization, isolation, lactic acid bacteria, soybean soaking water

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kepada Allah SWT

yang telah melimpahkan rahmat, dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Shalawat serta salam

senantiasa penulis curahkan kepada Nabi Besar Muhammad SAW beserta

keluarga, para sahabat serta para pengikut di jalan yang diridhoi-Nya.

Skripsi yang berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat

dari Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai” disusun dalam rangka

memenuhi persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta. Penulis menyadari bahwa dalam penelitian sampai penyusunan skripsi ini

tidak akan terwujud tanpa adanya bantuan, bimbingan, dan dukungan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis tidak lupa

mengucapkan terima kasih banyak kepada:

1. Dr. Arief Sumantri, S. KM., M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si, Apt selaku Ketua dan Ibu Nelly Suryani, Ph.D, Apt

selaku Sekretaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Puteri Amelia, M. Farm., Apt selaku pembimbing I dan bapak Saiful

Bahri, M. Si selaku pembimbing II yang telah tulus ikhlas membimbing,

memberi masukan, ilmu, nasihat, serta semangat kepada penulis.

4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt. selaku dosen penasehat akademik yang telah

membimbing dan banyak membantu penulis dari awal perkuliahan.

5. Seluruh dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta atas ilmu yang telah diberikan

selama penulis menempuh pendidikan.

6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Muhammad Yazid dan Ibunda Ida Farida

yang selalu memberikan dukungan baik moril maupun materil, semangat,

kasih sayang, dan doa yang tidak ada hentinya mengiringi setiap langkah

penulis.

7. Adik-adik tersayang Putra Faris Syafiq Yasir dan Nawra Nurkamila Ghaniya,

serta seluruh keluarga besar atas semangat, dukungan, dan doa kepada penulis.

8. Teman yang selalu mendengarkan keluh kesah, mendampingi, dan memberi

semangat dalam menyelesaikan penelitian ini, Teungku Ahmad Shalahuddin.

9. Sahabat seperjuangan sejak putih abu-abu yang selalu menjadi tempat berbagi

tangis dan tawa, Anindita Putri Hariyani Wimala dan Amanda Terrena Putri

yang juga sedang menyelesaikan tesisnya.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

10. Kawan seperjuangan penelitian, Santi Susilawati atas bantuan, kesabaran,

masukan, dan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.

11. Azmi, Moethia, Afina, Endang, Risha, Nisa Utami, Annissa Fadillah, Dian

Aulia, Ade Rachma, Fenny, Nurul, Putri Wulandari, Khorunnisak, Dwi Putri,

Rakha, Gadis, Safizah, Apriliana Nur, Vesty yang telah memberi semangat

dan bantuan baik selama perkuliahan maupun penelitian hingga skripsi ini

dapat selesai.

12. Laila, Ummi Habibah, Wida, Lilis, Eha, Noni, Zulfa, Vano, dan teman-teman

mikrobiologi lainnya, terima kasih atas kerja sama serta suka duka selama

penelitian berlangsung.

13. Laboran Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Mba Rani, Kak Tiwi, Kak

Lisna, Kak Eris, Kak Walid, Kak Yaenap, dan Kak Rahmadi serta Mba Puji

laboran PLT yang banyak membantu selama penulis melakukan penelitian.

14. Keluarga besar pengurus HMPS Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

periode 2014-2015 atas pengalaman dan pelajaran kepada penulis.

15. Teman-teman Farmasi 2012 khususnya kelas AC atas kebersamaan, suka

duka, dan motivasi selama perkuliahan.

16. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan

skripsi ini baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya tak

dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna

dan banyak kekurangan. Oleh karena itu saran serta kritik yang membangun

sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan pada umumnya dan bagi ilmu farmasi pada khususnya. Amin Ya

Robbal’alamin.

Jakarta, Agustus 2016

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii

HALAMAN PERSYARATAN ORISINALITAS ......................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ......................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................ vi

ABSTRACT ...................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ...................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................. x

DAFTAR ISI ..................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv

BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1. Latar Belakang ............................................................................................. 1

1.2. Rumusan Masalah ........................................................................................ 3

1.3. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 3

1.4. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 4

2.1. Probiotik ...................................................................................................... 4

2.2. Strain Bakteri Asam Laktat ......................................................................... 5

2.3. Efek Menguntungkan Probiotik .................................................................. 7

2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat ............................................................. 11

2.5. Produksi Asam Organik .............................................................................. 14

2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ........................................................... 15

2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme ................................................ 16

2.7.1. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Langsung ...................... 16

2.7.2. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Tidak Langsung ........... 17

BAB III. METODE PENELITIAN ................................................................. 18

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian ....................................................................... 18

3.2. Alat dan Bahan ............................................................................................. 18

3.2.1. Alat .................................................................................................... 18

3.2.2. Bahan ................................................................................................. 18

3.3. Prosedur Kerja .............................................................................................. 18

3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan ...................................... 18

3.3.1.1. Preparasi Alat ....................................................................... 18

3.3.1.2. Preparasi Sampel .................................................................. 19

3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar) 19

3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat .............................................................. 19

3.3.3. Pemurnian ......................................................................................... 20

3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................... 20

3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat ...................... 20

3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat .. 21

3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ....................................... 21

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 22

4.1. Hasil ............................................................................................................. 22

4.1.1. Isolasi Bakteri Asam Laktat .............................................................. 22

4.1.2. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................... 22

4.1.2.1. Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat ................................ 23

4.1.2.2. Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat ............ 23

4.1.3. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ....................................... 23

4.4 Pembahasan ................................................................................................ 24

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 36

5.1. Kesimpulan ................................................................................................. 36

5.2. Saran ............................................................................................................ 36

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 37

LAMPIRAN ...................................................................................................... 42

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik .......................................................... 7

Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat ............................................................. 22

Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan ............................... 24

Tabel 4.3 Identifikasi Tingkat Genus (Generic Assignment) ..................... 33

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Jalur Metabolisme Homofermentatif .......................................... 12

Gambar 2.2 Jalur Metabolisme Heterofermentatif ......................................... 13

Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL ....................................................................... 25

Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri ........................ 26

Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora ....................................................... 27

Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas ...................................................................... 28

Gambar 4.5 Hasil Uji Katalase ...................................................................... 29

Gambar 4.6 Hasil Uji Produksi Gas ............................................................... 30

Gambar 4.7 Hasil Uji Aktivitas Hemolisis .................................................... 34

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian ........................................................................... 42

Lampiran 2. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Agar ........................ 43

Lampiran 3. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Broth ....................... 45

Lampiran 4. Hasil Isolasi BAL dari Limbah Cair Tempe .............................. 46

Lampiran 5. Hasil Perhitungan Total Plate Count (TPC) .............................. 47

Lampiran 6. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel ..................................... 48

Lampiran 7. Hasil Pewarnaan Endospora ....................................................... 49

Lampiran 8. Hasil Uji Katalase ...................................................................... 50

Lampiran 9. Hasil Uji Motilitas ...................................................................... 51

Lampiran 10. Hasil Uji Produksi Gas ............................................................... 52

Lampiran 11. Hasil Uji Ketahanan Suhu .......................................................... 53

Lampiran 12. Hasil Uji Ketahanan NaCl .......................................................... 55

Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Hemolisis .................................................... 57

Lampiran 14. Alat dan Bahan yang Digunakan ................................................ 58

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Proses fermentasi merupakan salah satu metode pengawetan yang dapat

dideskripsikan sebagai suatu proses perubahan secara biokimia pada bahan

pangan oleh aktivitas mikroorganisme (Hidayat dan Sri, 2006). Fermentasi telah

digunakan secara luas oleh masyarakat tidak hanya untuk mengawetkan pangan,

tetapi juga digunakan untuk memproduksi berbagai produk pangan yang

diinginkan dari susu, daging, ikan, telur, biji-bijian, buah, dan sayuran.

Fermentasi pangan melibatkan proses konversi bahan dasar menjadi

pangan fermentasi, oleh pertumbuhan dan aktivitas metabolisme mikroorganisme

yang diinginkan. Mikroorganisme tersebut memanfaatkan beberapa komponen

bahan dasar pangan sebagai substrat untuk menghasilkan energi dan komponen

seluler, meningkatkan populasi, dan menghasilkan beberapa produk yang tidak

digunakan sebagai produk akhir yang disekresikan ke lingkungan. Proses

fermentasi dapat meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah, yang

merupakan suatu cara untuk menghilangkan zat antinutrisi dan racun yang

terkandung dalam suatu bahan makanan (Sopandi dan Wardah, 2014).

Sejak ditemukannya teknologi fermentasi pangan, produk hasil fermentasi

tidak hanya mempunyai daya awet yang tinggi dengan kualitas sesuai dengan

yang diharapkan, tetapi juga mempunyai efek menyehatkan khususnya terhadap

kesehatan saluran cerna (Sopandi dan Wardah, 2014). Saluran pencernaan

manusia mengandung lebih dari 10 x 1014

mikroorganisme yang berpengaruh

terhadap kesehatan manusia, sebab aktif melakukan bermacam-macam

metabolisme. Sekitar 1.000 spesies bakteri terdapat dalam saluran pencernaan

(Ray, 2004). Berbagai kompartemen dalam saluran pencernaan dihuni oleh

populasi mikroorganisme. Dalam usus besar terdapat populasi dominan yang

penting dan dapat bersimbiosis secara baik dengan inang, sehingga berperan

penting dalam kesehatan (Roberfroid, et al., 2010).

Probiotik merupakan mikroorganisme yang bila dikonsumsi per oral akan

memberikan dampak positif bagi kesehatan manusia (Firmansyah, 2001). Bakteri

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

probiotik dapat menghasilkan berbagai macam senyawa seperti asam laktat, asam

asetat, bakteriosin, dan reuterin yang dapat menghambat pertumbuhan patogen.

Asam organik (asam laktat dan asam asetat) tersebut berfungsi menurunkan pH

sehingga mempengaruhi pertumbuhan patogen serta menjadi racun untuk mikroba

(Sopandi dan Wardah, 2014). Secara tradisional, Bakteri Asam Laktat (BAL)

digunakan sebagai probiotik.

Pangan yang diperoleh dari proses fermentasi banyak berasal dari biji-

bijian, salah satu diantaranya kacang kedelai yang banyak digunakan sebagai

bahan dasar dari pangan fermentasi seperti tempe, kecap, dan tauco. Tempe

adalah makanan hasil fermentasi tradisional Indonesia yang telah mendunia,

dimana telah banyak berada di luaran sebab kandungannya yang sangat bagus

untuk kesehatan. Banyak penelitian dan review telah dilakukan mengenai tempe

serta keberadaan dari BAL pada tempe pun telah dilaporkan (Kormin, et al., 2001;

Moreno, et al., 2002). Seperti yang telah dipaparkan diatas, BAL memiliki

kemampuan dalam menghambat pertumbuhan patogen saat proses fermentasi

tempe.

Pada tahun 2013, Pisol, et al. mengisolasi BAL dari tempe, dimana

dilakukan tidak hanya pada produk tempe namun pada tiap langkah pembuatan

tempe. Didapatkan hasil kandungan BAL tertinggi terdapat pada air rendaman

kedelai, yakni Lactobacillus heterofermentatif. Pada tahun 2015, Pisol, et al.

melakukan isolasi BAL kembali namun didapatkan hasil yang berbeda, dimana

pada air rendaman diisolasi Enterococcus faecium, Leuconostoc lactis, serta

Leuconostoc sp.

Pada proses pembuatan tempe di pabrik, dilakukan terlebih dahulu

perebusan kacang kedelai lalu didiamkan selama semalaman, setelah itu baru

dilakukan proses pembuatan tempe selanjutnya. Air rendaman tersebut biasanya

tidak digunakan kembali sehingga akan dibuang begitu saja atau terkadang

digunakan juga sebagai pakan cair ternak.

Melihat ketersediaannya yang banyak serta tidak dimanfaatkan kembali,

air rendaman kedelai tersebut atau limbah cair ini dapat diteliti lebih lanjut

mengenai kandungan BAL didalamnya. Dari hasil penelitian sebelumnya yang

menyatakan hasil isolasi BAL yang berbeda juga dapat mendasari penelitian ini.

3


Apakah akan didapatkan isolat yang berbeda pula, mengingat tempat pengambilan

sampel yang juga berbeda. Berdasarkan uraian diatas, maka dapat dilakukan

isolasi dan identifikasi BAL dari limbah cair rendaman kedelai pada produsen

tempe.

1.2. Rumusan Masalah

1. Apakah isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dapat diperoleh dari limbah cair

rendaman kacang kedelai?

2. Bagaimanakah karakteristik isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) yang telah

diperoleh dari limbah cair rendaman kacang kedelai?

1.3. Tujuan Penelitian

1. Untuk memperoleh isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair

rendaman kacang kedelai.

2. Untuk mengetahui karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) yang diperoleh

dari limbah cair rendaman kacang kedelai.

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai keberadaan

dan karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair rendaman kacang

kedelai pada produsen tempe.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Probiotik

Istilah probiotik berasal dari bahasa Yunani, yang berarti ―untuk

kehidupan‖. Para ahli dari Food and Agriculture Organization (FAO) dan World

Health Organization (WHO) mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme

yang hidup, dimana saat diadministrasikan dalam jumlah yang adekuat akan

memberikan keuntungan di sisi kesehatan pada host-nya. Berdasarkan definisi

tersebut, probiotik tidak seharusnya ditunjuk sebagai agen bioterapeutik (Reid, et

al., 2003).

Probiotik adalah spesies mikroba yang dikonsumsi dengan tujuan

mengubah flora gastrointestinal, dimana akan memberikan manfaat untuk

kesehatan. Penggunaan mikroba dimulai secara tidak sengaja berabad-abad yang

lalu ketika orang mencatat pertama kalinya terdapat efek menguntungkan untuk

kesehatan dari mengkonsumsi makanan fermentasi (Gogineni, et al., 2013).

Probiotik memiliki sejarah yang panjang, dimulai dari pencatatan pertama

dikonsumsinya minuman berbakteri oleh manusia yakni lebih dari 2000 tahun

yang lalu. Awal dari peradaban probiotik ditetapkan secara ilmiah oleh

Metchnikoff pada Pasteur Institue di Paris. Metchnikoff (1907) mengamati umur

petani Bulgarian yang panjang dan dihubungkan dengan tingginya konsumsi susu

asam. Selama penelitian ini, beliau berhipotesis bahwa mikroflora normal usus

dapat memberikan efek samping pada host dan konsumsi beberapa bakteri dapat

memberikan efek sebaliknya. Metchnikoff melakukan pengobatan dengan

menggunakan sesuatu yang sekarang ini dikenal sebagai Lactobacillus delbruckeii

subsp. bulgaricus yang dimana dengan Streptococcus salivarius subsp.

thermopillus digunakan untuk memfermentasi susu pada produksi yogurt

tradisional (Desai, 2008).

Penelitian selanjutnya dilakukan langsung dengan bakteri yang diisolasi

dari usus sebagai probiotik. Setelah itu banyak spesies mikroorganisme yang

digunakan, yaitu bakteri yang memproduksi asam laktat (lactobacilli, streptococci,

enterococci, lactococci, bifidobacteria) dan juga Bacillus spp. serta fungi seperti

5


Saccharomyces spp. dan Aspergillus spp (Desai, 2008). Bakteri asam laktat

(BAL), bakteri non-asam laktat, dan jamur dapat dikatakan sebagai probiotik.

Bakteri asam laktat merupakan probiotik yang paling penting dan paling

memberikan efek yang menguntukan terhadap saluran pencernaan manusia

(Holzapfel, et al., 2001). Berdasarkan Guidelines on Probiotics and Prebiotics,

karakteristik probiotik dapat dijelaskan sebagai berikut (Malago, et al., 2011):

1. Tidak kehilangan sifat aslinya selama masa penyimpanan.

2. Secara normal berada di saluran pencernaan manusia.

3. Harus dapat bertahan hidup, dapat melawan pertahanan barrier

lambung, tahan terhadap kerja pencernaan dari getah lambung, enzim

pencernaan, dan garam empedu, serta harus berkoloni di dalam usus.

4. Harus bisa melekat dan berkoloni dengan sel intestinal. Struktur

membran bakteri berperan dalam mekanisme perlekatan dan

berpasangan langsung dengan mukosa, permukaan protein, dan

mungkin dengan beberapa lainnya yang berlendir.

5. Harus menimbulkan fungsi metabolik pada pencernaan, yang

bermanfaat bagi kesehatan manusia, dan antagonis mikroorganisme

patogen dengan memproduksi zat anti-mikroba.

6. Tidak boleh menyebabkan reaksi berbahaya dan aman terhadap sistem

imun (dinyatakan aman atau status GRAS).

7. Resistensi terhadap antibiotik.

8. Harus dikelola dalam dosis yang adekuat dan memiliki rasio efikasi

biaya yang tepat dan seimbang.

2.2. Strain Bakteri Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam

filum Firmicute. Bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera,

Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissella (Jay, 1992). Kelompok bakteri ini

termasuk bakteri Gram positif, tidak berspora, tidak berpigmen mesofil, serta

6


berbentuk kokus dan batang. Bakteri ini dapat hidup pada temperatur antara 5-

50ºC dan bersifat katalase negatif (Perry, et al., 1997).

Nama bakteri asam laktat diperoleh dari kemampuannya dalam

memfermentasi gula menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat juga terdapat dalam

tubuh manusia sebagai flora normal tubuh (Prescott, et al., 2002). Bakteri yang

termasuk ke dalam Bifidobacterium dan Lactobacillus secara luas digunakan

sebagai probiotik, dimana terbagi menjadi dua kelompok yakni yang berasal dari

usus dan vagina. Bifidobacteria merupakan kelompok penting dalam kultur

probiotik yang biasanya digunakan dalam produk olahan susu fermentasi.

Bifidobacterium adalah bakteri Gram positif, anaerobik, tidak motil, dan tidak

dapat membentuk spora. Mereka mungkin memiliki beberapa bentuk, seperti

batang yang melengkung pendek, batang berbentuk stik, dan batang berbentuk Y.

Untuk pertumbuhan Bifidobacteria, pH optimumya adalah 6,0-7,0 dan tidak akan

tumbuh pada pH kurang dari 4,5 dan lebih dari 8,5. Temperatur optimum untuk

tumbuh 37-41°C, minimum 25-28°C, dan maksimum 43-45°C. Kultur

Bifidobacterium yang digunakan sebagai probiotik diantaranya B. adolescentis, B.

longum, B. infantis,dan B. breve (Ozyurt, et al., 2014).

Bakteri asam laktat (BAL) biasanya dideskripsikan sebagai

mikroorganisme Gram positif, tidak memiliki sitokrom, menyukai keadaan

anaerob tetapi aerotolerant, tahan asam, dan dapat menyebabkan peragian. Genus

yang sangat penting saat ini diantaranya: Lactobacillus, Lactococcus,

Enterocococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, dan Bifidobacterium

(Ozyurt, et al., 2014)

Pertumbuhan dari L. acidophilus terjadi pada temperatur 45°C, atau

optimum antara 35 dan 40°C. Organisme ini akan tumbuh pada media yang

sedikit asam yaitu pada pH 6,4-4,5, tetapi pertumbuhan akan terhenti pada pH 4,0-

3,6, dengan pH optimum 5,5-6,0. L. rhamnosus adalah BAL dengan kemampuan

probiotik. Aktivitas petumbuhan BAL dipengaruhi oleh kondisi fermentasi,

seperti pH, temperatur, komposisi medium, dan faktor lainnya (Ozyurt, et al.,

2014).

7


Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik

Spesies Lactobacillus Spesies Bifidobacterium

L. acidophilus

L. amylovorus

L. casei

L. crispatus

L. delbrueckii

subsp. Bulgaricus

L. gallinarum

L. gasseri

L. johnsonii

L. paracasei

L. plantarum

L. reuteri

L. rhamnosus

B. adolescentis

B. animalis

B. bifidum

B. breve

B. infantis

B. lactis

B. longum

BAL lainnya Non BAL

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Lactococcus lactis

Leuconstoc mesenteroides

Pediococcus acidilactici

Sporolactobacillus inulinus

Streptococcus thermophilus

Bacillus cereus var. toyoi

Escherichia coli strain nissle

Propionibacterium freudenreichii

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces boulardii

(Sumber: Holzapfel, et al., 2001)

2.3. Efek Menguntungkan Bakteri Asam Laktat

Dalam beberapa tahun terakhir berbagai aplikasi dari produk

farmaseutikal dan medisinal telah diidentifikasi, dan probiotik diselidiki lebih

lanjut mengenai efek menguntungkannya untuk kesehatan. Pada dasarnya

karakteristik mikroba berbeda-beda, berbagai bentuk formulasi telah

dikembangkan untuk kondisi klinis yang berbeda-beda pula. Dimana spesies

8


dengan karakteristik yang beragam diindikasikan untuk kondisi klinis yang

berbeda (Aron, et al., 2015).

Efek menguntungkan dari mengkonsumsi sel hidup adalah kemampuan

sel hidup bakteri yang dapat memberi perlindungan terhadap patogen enterik,

memberi enzim yang membantu proses metabolisme beberapa nutrisi pangan

seperti laktase yang menghidrolisis laktosa, detoksifikasi komponen pangan yang

merugikan, menstimulasi sistem imun, dan mengembangkan aktivitas peristaltik

usus. Keuntungan lain dari mengkonsumsi sel hidup bakteri yakni hidrolisis

laktosa dan penurunan kadar kolesterol serum, kanker kolon, gangguan usus,

penyakit alergi, serta modulasi respon imun (Sopandi dan Wardah, 2014).

Berdasarkan karakteristik mikroba, spesies, dan formulasi yang berbeda-

beda, probiotik dapat digunakan diantaranya untuk kondisi sebagai berikut:

a. Penyakit kulit

Kulit adalah organ terluas dan yang kontak langsung dengan lingkungan

luar, dimana secara konstan terekspos dengan mikroorganisme dan bisa menjadi

tempat hidupnya. Mikroba tersebut dapat berinteraksi dengan mikroba lainnya, sel

manusia, serta sistem imun sel yang bisa menimbulkan resiko penyakit kulit

seperti jerawat, dermatitis atropik, dan eczema. Salah satu dari efek

menguntungkan probiotik adalah menekan inflamasi pada jerawat. Setelah

mengkonsumsi Lactobacillus spp. selama 12 minggu, pasien mengalami

kemajuan yang signifikan ditinjau dari lesi pada jerawat. Begitu pula pada

penggunaan L. plantarum, B. lactis Bb-12, dan L. rhamnosus GG (LGG) dalam

pengobatan dermatitis atropik (Aron, et al., 2015).

b. Penyakit saluran cerna

Berbagai penyakit dapat terjadi saluran cerna mulai dari ulser peptic,

diare, konstipasi, dan lain-lain. Beberapa strain BAL dapat mengontrol infeksi H.

pylori (penyebab ulser peptik) jika diberikan bersamaan dengan perawatan medis

(Iqbal, et al., 2014). Strain tertentu dari Lactobacillus dan Bifidobacterium secara

in vitro memiliki efek melawan H. pylori melalui pelepasan bakteriosin atau

produksi asam organik, dan/atau menghambat adhesi ke sel epitel (Vandenplas, et

al., 2014). Probiotik juga diketahui dapat menjadi agen pencahar dengan cara

memodulasi flora normal usus dan mempengaruhi fungsi utama usus yaitu

9


motilitas usus. Modulasi flora normal usus juga mengubah aktivitas metabolisme

usus, seperti produksi gas dan asam lemak rantai pendek. Dimana asam lemak

rantai pendek ini mempunyai korelasi dengan waktu transit usus (Lee dan

Salminen, 2009 dalam Utami, 2013).

c. Kanker

Probiotik memainkan peran protektif dalam mengikat dan/atau degradasi

karsinogen, awalnya ini didapat dari tipe diet barat, banyak dalam daging merah

yang dipanggang. Banyak penelitian dalam mencit mengindikasikan bahwa

penggunaan beberapa lactobacilli mengurangi ambilan kembali mutagen oleh

jaringan berbeda. Setelah dilakukan pengamatan dengan manusia, menunjukkan

konsumsi olahan yang mengandung lactobacilli dapat mengurangi ekskresi

senyawa mutagen baik pada urin maupun pada feses (Aron, et al., 2015).

Dari hasil uji in vitro dan in vivo, baik pada hewan uji maupun uji klinis

pada manusia, B. lactis Bb12 dan Lb. rhamnosus GG dan kombinasi keduanya

(sinbiotik) diinkubasi dengan campuran prebiotik oligofruktosa dan inulin.

Supernatan dari fermentasi mengandung kuantitas yang besar dari butirat dan

ditempatkan dalam tabung dengan sel kanker HT2 manusia. Sel tumor yang masih

hidup kondisinya lemah dan proliferasi sel dihambat. Tikus dengan kanker kolon

dan diberi makan dengan inulin tipe fruktan menunjukkan penurunan insiden

kanker kolon. Manusia dengan polip pada kolon yang diberikan regimen sinbiotik

menunjukkan penurunan yang nyata pada sel DNA yang rusak (Aron, et al.,

2015).

d. Penurunan kadar kolestrol serum

Konsumsi susu yang mengandung mikroorganisme dan konsumsi sel

hidup bakteri dalam jumlah tinggi yang menguntungkan usus, diketahui berkaitan

dengan kadar kolestrol serum yang rendah pada manusia. Penurunan kadar

kolestrol tersebut diduga disebabkan oleh dua faktor. Faktor pertama, kemampuan

beberapa Lactobacillus dalam usus untuk memetabollisme kolestrol yang berasal

dari pangan, sehingga mengurangi jumlah kolestrol yang diabsorpsi dalam darah.

Dan faktor kedua, beberapa Lactobacillus dapat melakukan dekonjugasi garam

empedu dan mencegah reabsorpsi kolestrol dalam hati, yang pada gilirannya hati

menggunakan lebih banyak kolesterol serum untuk mensistesis garam empedu

10


dan secara tidak langsung menurunkan kadar kolesterol dalam serum (Guarner, et

al., 1998 dan Lee, et al., 1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014).

e. Memodulasi respon imun

Mikroorganisme usus dianggap dapat bertindak sebagai penghalang,

membantu sistem regulasi, dan respons imun lokal. Regulasi immunofisiologis

dalam usus bergantung pada pembentukan mikroflora indigenous (Isolauri, et al.,

2001). Sifat atau fungsi mikroorganisme usus tersebut lebih efektif pada usia

muda, selama terjadi perkembangan jaringan limfoid dalam usus. Mikroflora

normal yang berada dalam saluran pencernaan pada usia muda, dapat membantu

pengembangan imunitas melalui pemberian antigen yang berkaitan dengan reaksi

inflamasi dalam usus (Guarner, et al., 1998; Lee, et al., 1999; Ray, 2004 dalam

Sopandi dan Wardah, 2014). Pemberian probiotik secara oral juga dapat

membantu mengatasi permasalahan respon imun, disebabkan oleh mikroflora

yang tidak menguntungkan usus. Efek yang menguntungkan dari probiotik

tersebut diduga dihasilkan oleh perubahan permeabilitas usus, perubahan

mikroflora usus, pengembangan fungsi penghalang imunologi usus, dan

menghambat respons inflamasi usus (Ray, 2004).

f. Bacterial Vaginitis (BV)

Lactobacillus spp, adalah unsur mikroba yang dominan dalam mengatur

keberadaaan, pertumbuhan, kolonisasi, dan persisten mikroorganisme non-

endogen di vagina. Seiring dengan naiknya jumlah Lactobacillus spp., maka

proteksi terhadap uropathogen pun ikut meningkat. Dinyatakan pula bahwa

lactobacilli memproduksi biofilm yang melindungi sel urogenital. Terdapat

penelitian dengan 40 wanita yang mengalami Bacterial Vaginitis (BV), dan

diberikan secara acak pengobatan kapsul mengandung L. rhamnosus GR-1 dan L.

reuteri RC-14 selama 5 hari atau gel metronidazole 0,75% dua kali sehari. Dan

hasilnya menunjukkan terdapat kesembuhan yang signifikan pada subjek yang

menerima probiotik lactobacilli dibandingkan metronidazole (Aron, et al., 2015).

g. Penurunan penyakit alergi

Keberadaan mikroflora normal usus sejak lahir sampai dewasa, dapat

berperan penting dalam menghambat beberapa respon imun spesifik. Mikroflora

normal dalam saluran pencernaan masuk ke dalam tubuh melalui makanan, air,

11


udara, dan sumber lingkungan lain (Guarner dan Schaafma, 1998 dan Lee, et al.,

1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014). Pemeliharaan bayi dalam lingkungan

yang sangat steril dan pemberian pangan olahan yang semisteril, dapat

mengganggu pembentukan atau keberadaan mikroflora normal dalam saluran

pencernaan. Hal tersebut menyebabkan sistem imun bayi mengembangkan respon

inflamasi terhadap beberapa antigen pangan. Probiotik mengandung bakteri usus

yang menguntungkan dapat mempunyai efek penekan terhadap reaksi tersebut,

dengan menstimulasi produk sitokin antiinflamasi dan menurunkan reaksi alergi

dalam individu yang sensitif (Ray, 2004).

2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat

Energi seluler BAL diperoleh dari fermentasi karbohidrat, untuk

menghasilkan asam organik sebagai produknya. Perolehan energi seluler oleh

BAL dilakukan melalui dua jalur yang berbeda. BAL dibagi menjadi dua

kelompok berdasarkan metabolisme karbohidratnya yaitu homofermentatif dan

heterofermentatif (Ozyurt, et al., 2014).

Bakteri homofermentatif hanya menghasilkan laktat sebagai produk

utama dari fermentasi glukosa. Bakteri homofermentatif melakukan jalur

glikolisis Emden-Meyerhof-Parnas (EMP), pada molekul 6 karbon glukosa

difosforilasi dan diisomerisasi sebelum didegradasi oleh enzim aldolase menjadi

gliseraldehid-3-fosfat, kemudian diubah menjadi piruvat. Selama proses

fosforilasi, dihasilkan 2 molekul ATP untuk setiap molekul glukosa yang

difermentasi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok homofermentatif terdiri dari

Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, dan beberapa

lactobacilli (Vasiljevic and Shah 2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).

Sedangkan, bakteri heterofermentatif menghasilkan asam laktat, etanol

atau asetat, dan karbon dioksida dari glukosa. Heterofermentatif tidak mempunyai

enzim aldolase dan mengubah heksosa, glukosa menjadi pentosa melalui

serangkaian reaksi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok heterofermentatif

terdiri dari Leuconostoc, Weissella, dan beberapa lactobacilli (Vasiljevic and Shah

2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).

12


Gambar 2.1 Jalur metabolisme homofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009)

Fruktosa Glukosa

Fruktosa-6-fosfat

ATP

ADP

Glukosa-6-fosfat

ATP

ADP

2 Gliseraldehid-3-fosfat

ATP

ADP

2-piruvat

2-Laktat

4 ATP

4 ADP

2 Pi

2 NAD+

2 NADH

4 ATP

4 ADP

2 NAD+

2 NADH

13


Gambar 2.2 Jalur metabolisme heterofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009)

Glukosa

Glukosa-6-fosfat

ATP

ADP

Fruktosa-6-fosfat

ATP

ADP

6-fosfoglukonat

2 NAD+

2 NADH

Ribulosa-5-fosfat

2 NAD+

2 NADH CO2

Xilulosa-5-fosfat

Gliseraldehid-3-fosfat Asetil fosfat Asetat

ATP ADP

Piruvat

Laktat

NAD+

NADH 2 ADP

2 ATP

2 Pi

NADH

NAD+

CoA

Pi

Etanol

NADH

NAD+

Asetil CoA

Asetaldehid

NADH

NAD+

Fruktosa

14


2.5. Produksi Asam Organik

Fermentasi mikroorganisme biasanya menghasilkan asam organik seperti

asam asetat, asam glukonat, asam sitrat, asam itakonat, asam giberelat, dan asam

laktat (Pratiwi, 2008). Asam-asam organik dari produk fermentasi merupakan

hasil hidrolisis asam lemak dan juga sebagai hasil aktivitas pertumbuhan bakteri.

Penentuan kuantitatif asam organik pada produk fermentasi adalah penting untuk

mempelajari kontribusi bagi aroma sebagian besar produk fermentasi, alasan gizi,

dan sebagai indikator aktivitas bakteri (Bevilacqua & Califano, 1989 dalam Nur,

2005).

a) Asam glukonat, asam ini diproduksi oleh berbagai bakteri termasuk spesies

Acetobacter dan oleh beberapa fungi seperti Penicillium dan Aspergillus.

Aspergillus niger mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat dalam reaksi

enzimatik tunggal oleh enzim glukosa oksidase. Asam glukonat memiliki

beberapa kegunaan, seperti kalsium glukonat yang merupakan produk farmasi

untuk menyuplai kalsium dalam tubuh (Pratiwi, 2008).

b) Asam sitrat diproduksi oleh Aspergillus niger dengan molasses sebagai

substrat fermentasinya. Transformasi asam sitrat oleh Aspergillus terreus

dapat digunakan untuk mempoduksi asam itakonat dalam dua langkah reaksi.

Langkah pertama yaitu perubahan asam sitrat menjadi asam cis-akonitat

melalui proses hidroksilasi dan langkah kedua yaitu langkah karboksilasi asam

cis-akionat menjadi asam itakonat. Proses fermentasi ini memerlukan pH

berkisar pada 2,2 (Pratiwi, 2008).

c) Asam giberelat diproduksi oleh fungi Gibberella fujikoroi (Fusarium

moniliforme). Diperlukan media glukosa-garam mineral pada saat proses

fermentasi, temperatur inkubasi berkisar pada 25°C dengan pH asam (Pratiwi,

2008).

d) Asam laktat diproduksi oleh Lactobacillus delbrueckii, spesies Lactobacillus

lainnya, Streptococcus, dan Leuconostoc. Asam laktat digunakan untuk

mengawetkan makanan pada industri penyamakan kulit dan industri tekstil.

Media yang digunakan dalam fermentasi asam laktat ini memerlukan glukosa

10-15%, kalsium karbonat 10% untuk menetralisasi asam laktat yang

dihasilkan, amonium fosfat, dan sejumlah kecil sumber nitrogen. Gula jagung,

15


pati kentang, dan gandum sering digunakan sebagai sumber karbohidrat.

Temperatur inkubasi antara 45-50°C dengan pH antara 5,5-6,5. Setelah proses

fermentasi 5-7 hari, kurang lebih 90% gula telah diubah menjadi asam laktat,

kalsium karbonat selanjutnya ditambahkan untuk menaikkan pH hingga 10,

kemudian media fermentasi dipanaskan dan disaring. Prosedur ini akan

membunuh bakteri, mengkoagulasi protein, menghilangkan sisa kalsium

karbonat, dan mendekomposisi residu karbohidrat (Pratiwi, 2008).

2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Pertumbuhan adalah pertambahan teratur semua komponen suatu

organisme. Pertumbuhan mikroorganisme ditunjukkan adanya peningkatan

jumlah mikroorganisme, bukan peningkatan ukuran sel individu. Fase

pertumbuhan mikroorganisme terdiri dari empat macam (Pratiwi, 2008):

1) Fase lag (fase adaptasi)

Merupakan fase penyesuaian mikroorganisme pada suatu lingkungan baru.

Ciri dari fase ini yaitu tidak adanya peningkatan jumlah sel, yang ada hanya

peningkatan ukuran sel. Lama fase lag tergantung kondisi dan jumlah awal

mikroorganisme dan media pertumbuhan (Pratiwi, 2008).

2) Fase log (fase eksponensial)

Yakni fase dimana mikroorganisme tumbuh dan membelah pada kecepatan

maksimum, tergantung pada genetika mikroorganisme, sifat media, dan

kondisi pertumbuhan. Terdapat hal yang dapat menghambat laju pertumbuhan,

seperti nutrisi yang terkandung dalam kultur habis sehingga hasil metabolisme

yang bersifat racun tertimbun dan dapat menghambat pertumbuhan (Pratiwi,

2008).

3) Fase stasioner

Saat pertumbuhan mikoorganisme terhenti dan terjadi keseimbangan antara

jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati. Fase ini yaitu fase

dimana terjadinya akumulasi produk buangan yang toksik. Terdapat

kehilangan sel yang lambat karena kematian diimbangi pembentukan sel baru

melalui pertumbuhan dan pembelahan dengan nutrisi yang dilepaskan oleh

sel-sel mati (Pratiwi, 2008).

16


4) Fase kematian

Pada fase ini, jumlah sel yang mati meningkat. Faktor penyebabnya karena

ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk buangan yang toksik (Pratiwi,

2008).

2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme

Parameter pengukuran pertumbuhan mikroorganisme yaitu konsentrasi sel

(jumlah sel per satuan isi kultur) ataupun densitas sel (berat kering sel per satuan

isi kultur). Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme ada dua cara, yakni secara

langsung dan tidak langsung (Pratiwi, 2008)

2.7.1 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Langsung

a) Pengukuran menggunakan bilik hitung (counting chamber)

Pengukuran bakteri digunakan bilik hitung Petroff-Hausser, sedangkan

pengukuran mikroorganisme eukariot digunakan hemositometer. Keuntungan

metode ini yaitu mudah, murah, cepat, dan dapat diperoleh informasi ukuran dam

morfologi mikroorganisme. Sedangkan kerugiannya yaitu populasi

mikroorganisme yang digunakan harus banyak (minimum berkisar 106 CFU/ml),

karena pengukuran dengan volume dalam jumlah sedikit tidak dapat membedakan

antara sel hidup dan sel mati, serta kesulitan menghitung sel yang motil (Pratiwi,

2008).

b) Pengukuran menggunakan electronic counter

Suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil (orifice) dengan

bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur

tahanan listrik (ditandai dengan naiknya tahanan) pada saat bakteri melalui orifice.

Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungannya adalah hasil didapat lebih cepat,

lebih akurat, serta sel dengan ukuran besar dapat terhitung. Namun, metode ini

tidak bisa digunakan untuk menghitung bakteri karena adanya gangguan debris,

filament, dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan sel hidup dan sel mati

(Pratiwi, 2008).

c) Pengukuran dengan plating technique

Merupakan metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan

berdasarkan asumsi bakteri hidup akan tumbuh, membelah, dan memproduksi

17


satu koloni tunggal. Mula-mula dibuat seri pengenceran sampel dan ditumbuhkan

pada media padat. Pengukuran dilakukan pada plate dengan jumlah koloni

berkisar 25-250 atau 30-300 dengan satuan CFU (colony forming unit).

Keuntungannya yakni sederhana, mudah, dan sensitif. Tetapi harus digunakan

media yang sesuai dan penghitungannya kurang akurat karena satu koloni tidak

selalu berasal dari satu individu sel (Pratiwi, 2008).

d) Pengukuran dengan menggunakan teknik filtrasi membran (membrane

filtration technique)

Sampel dialirkan pada suatu sistem filter membran dengan bantuan vacum.

Bakteri yang terperangkap ditumbuhkan pada media yang sesuai dan jumlah

koloninya dihitung. Metode ini memiliki kelebihan dapat menghitung sel hidup

dan sistem peghitungannya langsung, sedangkan kerugiannya adalah tidak

ekonomis (Pratiwi, 2008).

2.7.2 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Tidak Langsung

a) Pengukuran kekeruhan/turbidity

Bakteri yang bermultiplikasi pada media cair akan menyebabkan media

menjadi keruh. Spektrofotometer atau kalorimeter digunakan dengan

membandingkan densitas optik antara media tanpa pertumbuhan dengan yang

terdapat pertumbuhan bakteri (Pratiwi, 2008).

b) Pengukuran aktivitas metabolik

Berdasarkan jumlah produk metabolik tertentu, seperti asam atau CO2

yang menunjukkan jumlah mikroorganisme terdapat didalam media (Pratiwi,

2008).

c) Pengukuran berat sel kering (BSK)

Merupakan metode yang umum digunakan untuk mengukur pertumbuhan

fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai

berat kotor. Selanjutnya miselium dicuci dan dikeringkan dengan desikator dan

ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat konstan yang dihitung sebagai

berat sel kering (Pratiwi, 2008).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2016 di

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Formulasi Sediaan

Steril Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Peralatan yang digunakan pada penelitian adalah kapas, kain kasa, tisu,

kaca objek, jarum ose, batang spreader, spatula, pembakar spirtus, alumunium

foil, plastic wrap, kertas saring, pipet tetes, kaca objek, tabung reaksi, rak tabung

reaksi, beaker glass, erlenmeyer, cawan petri, mikropipet (Thermo Scientific),

tabung eppendorf, termometer, vortex, timbangan analitik (Ogawa Seiki),

anaerobic jar (Oxoid), mikroskop optik, pH meter (Horiba, Jepang), autoklaf

digital (Ogawa Seiki), inkubator (France Etuves), laminar air flow, lemari

pendingin (GEA), dan oven (Memmert).

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan antara lain sampel limbah cair air rendaman

kacang kedelai dari satu produsen tempe yang berlokasi di Cikoko, Pancoran,

Jakarta Selatan, NaCl, kalsium karbonat (CaCO3), media MRS Agar (Merck),

media MRS broth (Conda pronadisa), media SIM (Merck), pepton water (Merck),

media blood agar, kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin, malakit hijau,

aquadest, hidrogen peroksida (H2O2) 3%, minyak imersi, dan alkohol 70%

3.3. Prosedur Kerja

3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan

3.3.1.1. Preparasi Alat

Peralatan gelas seperti cawan petri, batang spreader, batang pengaduk,

erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi masing-masing dibungkus dengan kertas

19


hvs dan kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf digital pada suhu

121°C selama 15 menit.

3.3.1.2. Preparasi Sampel

Sampel berupa air rendaman kacang kedelai selama satu malam. Sampel

yang diambil yaitu pada tahapan awal pembuatan tempe. Pembuatan tempe

dimulai dari perebusan bahan baku kacang kedelai impor seberat kurang lebih 120

kg selama 2 jam menggunakan air sumur dilanjutkan dengan perendaman

menggunakan air perebusnya selama 24 jam. Kedelai yang telah direndam

ditiriskan dengan pengayak berlubang besar untuk selanjutnya dikupas

menggunakan mesin penggiling dan dicuci dengan air mengalir. Kedelai yang

telah dingin ditaburi dengan ragi kemudian dicetak dan dikemas menggunakan

daun atau plastik.

3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar)

Sejumlah 68,2 gram serbuk MRS ditimbang, media ini disuplementasi

dengan CaCO3 sebanyak 1% dan kemudian dilarutkan dalam 1 liter air destilasi

dan dipanaskan hingga mendidih. Lalu media disterilisasi menggunakan autoklaf

pada suhu 121°C selama 15 menit.

3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat

Sebanyak 1 mL dari sampel secara aseptis ditambahkan ke dalam 9 mL

larutan pengencer yaitu pepton water steril (0,1%, b/v) dan dihomogenkan yang

merupakan pengenceran ke-1. Kemudian, dilakukan pengenceran bertingkat

sampai pengenceran ke-7. Diambil 0,1 mL cuplikan dari tiga seri pengenceran

terakhir dan dikulturkan pada agar de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA)

tersuplementasi CaCO3 1% menggunakan metode spread plate. Diinkubasi

selama 48 jam pada inkubator suhu 37°C. Koloni yang tumbuh dihitung dan

jumlah totalnya dihitung menggunakan metode total plate count (TPC).

20


3.3.3. Pemurnian

Koloni yang tumbuh dengan zona bening disekelilingnya dilakukan

pemurnian sel dengan cara menggoreskan pada media MRSA tersuplementasi

CaCO3 1% dengan metode kuadran diinkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu

37°C agar diperoleh koloni tunggal untuk selanjutnya disubkultur kembali sebagai

isolat tunggal murni.

3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat

3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat

Pengamatan morfologi dari bakteri asam laktat (BAL) meliputi:

a) Pewarnaaan Gram: diteteskan NaCl fisiologis pada kaca ojek isolat lalu

diambil satu ose isolat dari agar miring. Isolat tersebut disebarkan pada kaca

objek lalu difiksasi. Gentian violet diteteskan diatas preparat dan biarkan

selama 1 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Cairan lugol diteteskan

pada preparat kemudian dibiarkan kembali selama 1 menit. Preparat dicuci

dan diteteskan dengan alkohol 96% selama 30 detik. Preparat dicuci dengan

air mengalir. Terakhir, preparat diteteskan dengan safranin dan dibiarkan

selama 45-60 detik. Preparat dicuci dan dikeringkan untuk diamati dibawah

mikroskop. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram

negatif berwarna merah.

b) Pewarnaan endospora: Preparat yang telah difiksasi diletakkan diatas

penangas air lalu ditutup dengan kertas saring. Malakit hijau diteteskan dan

dibiarkan selama 5 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Dilakukan

kembali pewarnaan dengan safranin kemudian biarkan selama 60 detik.

Preparat dicuci, hasilnya diamati dibawah mikroskop. Endospora akan

berwarna hijau sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (Harley, 2005)

c) Uji motilitas dilakukan dengan media setengah padat, diambil sebanyak satu

ose isolat bakteri dan diinokulasikan secara vertikal pada media SIM (Sulfida

Indol Motility). Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37° C. Hasil

uji motilitas bakteri positif dapat dilihat dengan adanya pertumbuhan bakteri

pada permukaan media atau tidak hanya bekas pada tusukan, sedangkan

bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan (Harley, 2005).

21


3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat

Pengamatan fisiologi dan biokimia dari bakteri asam laktat (BAL)

meliputi:

a) Uji katalase dilakukan dengan menggunakan hidrogen peroksida (H2O2) 3%.

Isolat diambil dari stok kultur dan diletakkan pada kaca objek. Satu sampai

dua tetes H2O2 3% ditambahkan ke isolat. Jika terbentuk gelembung

mengindikasikan bakteri positif katalase, dan jika tidak maka mengindikasikan

bakteri negatif katalase (Harley, 2005).

b) Uji produksi gas dilakukan dengan menumbuhkan kultur isolat dalam media

MRS broth dalam tabung reaksi yang diberi tabung durham dengan keadaan

terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan. Lalu diinkubasi selama 2 hari

pada suhu 37° C (Romadhon, et al., 2012).

c) Ditumbuhkan pada temperatur yang berbeda-beda dengan menggunakan MRS

broth kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan seri temperatur 10°C,

37°C, dan 45°C. Adanya pertumbuhan diamati dengan adanya kekeruhan

dalam tabung (Anastiawan, 2014).

d) Untuk pertumbuhan pada konsentrasi garam 4% dan 6.5%, satu ose kultur

dimasukkan ke dalam MRS broth yang tersuplementasi NaCl masing-masing

berkonsentrasi 4% dan 6.5%. Lalu diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24

jam. Kekeruhan menandakan adanya pertumbuhan (Thakkar, et al., 2015).

3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat

Isolat BAL diuji keamanannya dengan blood agar yang mengandung 5%

darah domba. Isolat dari agar miring diambil satu ose lalu diinokulasi ke media

blood agar. Media tersebut kemudian diinkubasi secara anaerob pada suhu 37°C

selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap koloni yang tumbuh, jika terdapat

zona jernih disekitar koloni maka menunjukkan reaksi positif beta hemolisis. Pada

uji ini, Staphylococcus aureus digunakan sebagai kontrol positif (Thakkar, et al.,

2015).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat

Pada tahap awal isolasi, sampel berupa air rendaman kacang kedelai

dilakukan inokulasi ke dalam media MRSA tersuplementasi CaCO3 1%.

Didapatkan data total plate count (TPC) keseluruhan bakteri yang tumbuh

sebanyak koloni/mL sedangkan TPC BAL sebanyak

koloni/mL. Dari keseluruhan kultur bakteri yang tumbuh terpilih delapan isolat

BAL yang memiliki karakteristik secara makroskopik berbeda, yaitu:

Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat

Isolat Morfologi Koloni

Bentuk Warna Elevasi Tepian Diameter Koloni

ARK 5.1.a Bulat Krem Konveks Halus 3 mm

ARK 5.3.b Bulat Krem Konveks Halus 1 mm

ARK 6.1.c Bulat Putih pudar Rata Halus 4 mm

ARK 6.1.d Bulat Putih pucat Rata Halus 3 mm

ARK 6.2.e Bulat Putih pudar Rata Halus 3 mm

ARK 6.3.f Bulat Putih tulang Rata Halus 3 mm

ARK 7.2.g Bulat Krem Rata Halus 3 mm

ARK 7.3.h Bulat Putih Rata Halus 4 mm

4.1.2 Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat

Dalam mengkarakterisasi suatu mikroorganisme perlu mengetahui terlebih

dahulu ciri utamanya yang meliputi ciri morfologi, susunan kimiawi dari sel, sifat

biakan, metabolisme, sifat genetik dan patogenisitas. Untuk menentukan ciri

tersebut, maka diperlukan beberapa uji morfologi, fisiologi, serta aktivitas

biokimia (Lay dan Hastowo, 1992 dalam Candra, 2006). Pada pengujian ini

digunakan Lactobacillus casei ATCC 393 sebagai strain acuan.

23


4.1.2.1 Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat

Kedelapan isolat yang diuji, memiliki karakteristik morfologi sel yang

serupa yaitu berbentuk sel batang, tidak membentuk spora, dan tidak motil.

Namun, hasil pewarnaan Gram menunjukan isolat ARK 6.2.e adalah Gram

negatif, sedangkan tujuh isolat lainnya adalah Gram positif. Persyaratan BAL

adalah bakteri Gram positif sehingga isolat ARK 6.2.e tidak dilakukan uji

selanjutnya. Untuk strain acuan, memiliki morfologi yang serupa yakni berbentuk

sel batang, Gram positif, tidak membentuk spora, serta tidak motil.

4.1.2.2 Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat

Uji katalase yang dilakukan menunjukkan kedelapan isolat tidak

menghasilkan enzim katalase dengan tidak terbentuknya gelembung setelah

diteteskan H2O2. Untuk menentukan tipe fermentasi bakteri maka dilakukan uji

produksi gas, tabung durham yang terbalik di dalam tabung berisi media akan

menangkap gas yang dihasilkan. Dari uji produksi gas didapatkan hasil tujuh

isolat yaitu ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK

7.2.g, dan ARK 7.3.h menghasilkan gas, sedangkan Lactobacillus casei tidak

menghasilkan gas. Uji fisiologis meliputi ketahanan pada suhu dan konsentrasi

NaCl berbeda-beda menunjukkan hasil yang seragam, baik ketujuh isolat maupun

Lactobacillus casei tumbuh pada suhu 37° C dan 45° C serta konsentrasi NaCl 4%

dan 6,5%. Namun, pada suhu 10°C ketujuh isolat serta Lactobacillus casei tidak

terdapat pertumbuhan.

4.1.3 Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat

Untuk melihat keamanan dari isolat dilakukan uji aktivitas hemolisis

dengan Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif, ketujuh isolat serta

Lactobacillus casei tidak menghasilkan zona disekitar koloni atau dapat dikatakan

γ (gamma) hemolisis.

24


Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan

Pengamatan

Isolat

L. casei ARK

5.1.a

ARK

5.3.b

ARK

6.1.c

ARK

6.1.d

ARK

6.3.f

ARK

7.2.g

ARK

7.3.h

Morfologi Sel

Pewarnaan Gram + + + + + + + +

Bentuk Sel B B B B B B B B

Pewarnaan Endospora - - - - - - - -

Motilitas - - - - - - - -

Biokimia

Katalase - - - - - - - -

Tipe Fermentasi Ho He He He He He He He

Fisiologis

Suhu:

- 10°C - - - - - - - -

- 37°C + + + + + + + +

- 45°C + + + + + + + +

NaCl:

- 4% + + + + + + + +

- 6,5% + + + + + + + + Keterangan:

+ : menunjukkan hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri

- : menunjukkan hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri

B: Batang

Ho: Homofermentatif

He: Heterofermentatif

4.2 Pembahasan

Tahap awal penelitian adalah dengan pengambilan sampel, dimana sampel

yang diambil adalah air rendaman kacang kedelai selama semalaman. Sampel

berupa cairan berwarna kekuningan dengan tekstur lengket dan bau asam. Sampel

diencerkan beberapa kali untuk mengurangi populasi mikroba sehingga

didapatkan koloni terpisah pada cawan yang memudahkan dalam proses

penghitungan koloni (Harley, 2005). Jumlah koloni yang digunakan yaitu 30-30

koloni (Khedid, et al., 2006).

Pengenceran dilakukan sampai 10-7

dengan menggunakan pepton water

0,1% yang berfungsi untuk menjaga mikroba tetap hidup dengan nutrisi tetap

tersedia. Tiga tingkat pengenceran terakhir yakni 10-5

, 10-6

, dan 10-7

diinokulasikan ke dalam media MRSA yang tersuplementasi CaCO3 1%

25


menggunakan metode spread plate, metode ini dipilih untuk memudahkan baik

dalam penghitungan jumlah koloni, pengamatan, serta pengambilan koloni.

Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni pada penelitian

ini mempunyai prinsip jika sel bakteri hidup ditumbuhkan pada media yang

cocok, maka sel bakteri akan berkembang dan membentuk koloni yang dapat

dilihat langsung oleh mata sehingga bisa langsung dihitung (Collin, et al., 2004).

Jumlah koloni yang tumbuh terbanyak terdapat pada pengenceran 10-5

dan

pada pengenceran 10-7

jumlah koloni yang tumbuh semakin sedikit. Setelah

diamati secara makroskopik, dipilihlah delapan isolat yang memiliki karakteristik

berbeda baik bentuk, ukuran, maupun warna yaitu isolat dengan kode ARK 5.1.a,

ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK

7.3.h.

Isolat yang dipilih merupakan isolat yang memiliki zona bening disekitar

koloni seperti ditunjukkan pada Gambar 4.1, zona tersebut terbentuk karena

produksi asam organik dari bakteri sehingga CaCO3 pada media MRSA

terhidrolisis (Sun, et al., 2014; Pisol, et al., 2015). Kedelapan isolat ini

dimurnikan terlebih dahulu dengan goresan kuadran untuk mendapatkan koloni

murni yang terpisah sebanyak dua kali pemurnian. Koloni murni yang terpisah

kemudian diinokulasi ke dalam media MRSA agar miring dengan luas permukaan

yang lebih kecil sehingga kemungkinan kontaminasi lebih rendah untuk disimpan

sebagai stok kultur.

Koloni Bakteri

Zona bening

Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL (Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)

26


Setelah didapatkan stok kultur, kedelapan isolat serta strain acuan

dikarakterisasi dimana BAL memiliki ciri-ciri katalase negatif, Gram positif, non

motil, dan tidak membentuk spora (Bulut, 2003; Surono, 2004; Sun, et al., 2014).

Pengamatan secara mikroskopik dilakukan terhadap bentuk dan struktur sel, salah

satunya dengan pewarnaan Gram. Dalam hal ini, bakteri Gram positif ditandai

dengan warna ungu pada sel bakteri karena mempunyai kandungan lipid yang

lebih rendah, sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah terdehidrasi akibat

perlakuan dengan alkohol 96%. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan

ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitasnya berkurang, sehingga

zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari

sel dan sel akan tetap berwarna ungu (Pelczar dan Chan, 2008).

ARK 6.1.d ARK 6.2.e

Lactobacillus casei

Keterangan:

ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: Gram positif berbentuk batang

ARK 6.2.e: Gram negatif berbentuk batang

Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)

Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri (Sumber: Dokumen

pribadi, 2016)

27


Bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah karena kehilangan pewarna

kristal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol 96%, namun mampu

menyerap pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Gram negatif mengandung

lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi dari pada

yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih

tipis dari pada dinding sel bakteri Gram positif (Pelczar dan Chan, 2008).

Berdasarkan hasil dari pewarnaan Gram kedelapan isolat beserta strain acuan

menunjukkan karakteristik bakteri bentuk sel batang. Tujuh isolat serta strain

acuan merupakan Gram positif dan satu isolat, ARK 6.2.e, merupakan Gram

negatif.

Hasil uji pewarnaan spora menunjukkan ketujuh isolat bakteri serta strain

acuan tidak membentuk spora. Spora bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan

ekstrim dan adanya bahan kimia beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri

yang termasuk dalam genera Clostridium dan Bacillus untuk mengatasi

lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri.

ARK 6.1.d Lactobacillus casei

Keterangan:

ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: tidak membentuk spora

Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)

Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagi endospora

dan dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora. Jika sel semakin tua, maka sel

vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas dari sel dan membentuk

28


spora bebas. Spora juga lebih tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi sulit untuk

melepaskan zat warna yang telah terserap ke dalamnya, sehingga tidak dapat

mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya (counterstain). Prinsip

pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif (Fardiaz,

1987 dalam Candra, 2006).

Endospora memiliki selubung yang kompak sehingga menyebabkan zat

warna sulit untuk berpenetrasi ke dalam dinding endospora, maka diperlukan

pemanasan pada saat dilakukan pewarnaan. Metode pewarnaan yang umum untuk

mewarnai endospora bakteri adalah pewarnaan Schaeffer-Fulton, dengan malakit

hijau sebagai pewarna utama dan setelah dilakukan pembilasan dengan air

digunakan safranin sebagai counterstain (Pratiwi, 2008). Dimana akan

menghasilkan warna hijau pada bakteri dengan endospora dan akan berwarna

merah untuk sel vegetatif.

Ketujuh isolat dan strain acuan memberikan hasil uji motilitas yaitu non

motil, yang berarti bakteri tidak memiliki flagela. Hasil ini dapat dilihat dari tidak

menyebarnya pertumbuhan bakteri pada media SIM, melainkan hanya tumbuh

pada bekas tusukan jarum inokulum saja. Flagela merupakan filamen yang

mencuat dari sel bakteri dan berfungsi untuk pergerakan bakteri. Flagela

berbentuk panjang dan ramping. Gerakan flagela ini memungkinkan bakteri

mendekati atau menjauhi rangsang (Pratiwi, 2008).

Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Katalase merupakan enzim yang dapat mengkatalisasi penguraian

hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2) dan pada reaksi ini

Bakteri tumbuh di

bekas tusukan jarum

inokulum

ARK 6.1.d Lactobacillus casei

29


dapat diamati terbentuknya gelembung gas. Dengan terbentuknya gas

mengindikasikan terdapat enzim katalase tersebut (Bulut, 2003). Hidrogen

peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktifkan enzim

dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga

mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob pasti menguraikan bahan

tersebut (Lay, 1994 dalam Dewi, 2013). Umumnya semua BAL tumbuh pada

kondisi anaerob, namun tidak pada kondisi anaerob seperti biasanya, mereka

tumbuh dengan adanya oksigen (O2) sebagai anaerob aerotoleran (Bulut, 2003).

Koloni

bakteri

Galembung

gas

Koloni

bakteri

Keterangan:

A1 & A2: Isolat ARK 5.1.a tidak menghasilkan gelembung gas

(+): Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif katalase menghasilkan gelembung gas

L. casei: tidak menghasilkan gelembung gas

Gambar 4.5 Hasil Uji Katalase (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada

isolat bakteri. Hasil uji katalase menunjukkan hasil yang negatif pada kedelapan

isolat dan strain acuan, dimana tidak terdapatnya gelembung gas yang terbentuk.

Pada uji ini digunakan Staphylococcus aureus yang sudah diketahui memiliki

enzim katalase sebagai kontrol positif, hasil uji katalase pada bakteri ini

menunjukkan terbentuknya gelembung gas setelah diteteskan H2O2 3% (Dewi,

2013).

30


Uji produksi gas dilakukan untuk melihat aktivitas metabolisme BAL,

dimana dikelompokkan menjadi dua sub grup yaitu homofermentatif dan

heterofermentatif. BAL homofermentatif melibatkan jalur Embden Meyerhof,

yaitu glikolisis yang menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari 1 molekul

glukosa/heksosa dalam kondisi normal, tidak menghasilkan CO2 dan

menghasilkan biomassa sel dua kali lebih banyak dari pada BAL

heterofermentatif.

BAL heterofermentatif melalui jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase, selain

menghasilkan asam laktat, juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, dan

mannitol serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase

(Surono, 2004). Dapat disimpulkan bahwa karbon dioksida (CO2) hanya

diproduksi oleh BAL heterofermentatif.

Dari hasil uji didapatkan strain acuan tidak memproduksi gas yang berarti

memiliki tipe fermentasi homofermentatif. Sedangkan, tujuh isolat uji lainnya

yakni ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan

ARK 7.3.h memproduksi gas atau termasuk ke dalam tipe fermentasi

heterofermentatif.

Gas

terperangkap

pada tabung

durham

Tidak ada gas

ARK 5.3.b Kontrol negatif Lactobacillus casei

Keterangan:

ARK 5.3.b:Heterofermentatif; L. casei: Homofermentatif

Gambar 4.6 Hasil Uji Produksi Gas (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

Uji fisiologis selanjutnya adalah uji ketahanan hidup bakteri pada suhu

yang berbeda-beda yaitu 10°, 37°, dan 45°C, didapatkan data yang seragam yakni

tidak adanya pertumbuhan pada suhu 10°C dan tumbuh pada suhu 37° serta 45°C.

31


Setiap spesies mikroba memiliki rentang suhu pertumbuhan sendiri yang dapat

ditentukan oleh sensitivitas panas dari enzim, membran, ribosom, dan komponen

lainnya. Akibatnya, pertumbuhan mikroba memiliki karakteristik suhu yang

berbeda-beda tergantung suhu umumnya, seperti suhu minimum, maksimum, dan

optimum (Harley, 2005).

Suhu minimum pertumbuhan merupakan suhu terendah adanya

pertumbuhan, suhu maksimum merupakan suhu tertinggi adanya pertumbuhan,

dan suhu optimum adalah suhu saat laju reproduksi sel terjadi secara cepat. Suhu

optimum pertumbuhan memiliki hubungan dengan suhu normal habitat

mikroorganisme tersebut. Berdasarkan suhu, bakteri umumnya dapat dibagi

menjadi tiga kelompok yaitu psikrofilik, mesofilik, dan thermofilik (Harley,

2005).

Berdasarkan suhu optimum pertumbuhannya, BAL dapat dikelompokkan

menjadi dua grup, yaitu mesofilik dan thermofilik. Bakteri mesofilik memiliki

suhu optimum untuk pertumbuhan 25°C dan suhu maksimum 37°-40°C. Bakteri

thermofilik memiliki suhu optimum untuk pertumbuhan antara 37°-45°C dan suhu

maksimum antara 45°-52°C (Surono, 2004). Berdasarkan hasil pengamatan,

ketujuh isolat beserta strain acuan masih dapat tumbuh pada suhu 45°C sehingga

dapat disimpulkan ketujuh isolat beserta strain acuan merupakan bakteri

thermofilik.

Uji ketahanan hidup bakteri pada konsentrasi garam berbeda-beda

dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri pada kondisi lingkungan dengan

konsentrasi NaCl 4% dan 6,5%. Hasil yang didapatkan pada uji ini pun seragam

yaitu ketujuh isolat serta strain acuan dapat hidup pada kedua konsentrasi

tersebut.

Membran plasma selektif permeabel memisahkan antara bakteri dengan

lingkungan sekitarnya yang menyebabkan membran ini dapat dipengaruhi oleh

perubahan tekanan osmotik. Tekanan osmotik adalah tekanan yang terjadi karena

difusi air melaui membran yang permeabel secara differensial dari suatu tempat

berkonsentrasi tinggi ke tempat berkonsentrasi rendah. Jika bakteri berada pada

larutan hipotonik yaitu larutan dengan konsentrasi zat terlarut lebih rendah

32


(tekanan osmotik lebih rendah) akan menyebabkan air bergerak ke dalam sel dan

sel akan pecah (Harley, 2005).

Ketika bakteri ditempatkan pada larutan hipertonik yaitu larutan dengan

konsentrasi zat terlarut lebih tinggi (tekanan osmotik yang lebih tinggi) dari pada

yang lain maka air akan bergerak ke luar sel dan sel akan kehilangan air. Apabila

kehilangan air itu cukup besar, maka ada kemungkinan bahwa volume sel akan

menurun demikian besarnya sehingga tidak dapat mengisi seluruh ruangan yang

dibentuk oleh dinding sel. Membran dan sitoplasma akan terlepas dari dinding sel,

keadaan ini dinamakan plasmolisis. Saat bakteri ada pada larutan isotonis yaitu

suatu larutan yang mempunyai konsentrasi zat terlarut yang sama (tekanan

osmotik yang sama) seperti larutan yang lain, sehingga tidak ada pergerakan air.

Pada kondisi ini tidak akan mengalami perubahan volume (Harley, 2005).

Kategori taksonomi bagi bakteri dimulai dari kingdom, divisi, kelas, order,

famili, tribe, genus, spesies, dan subspesies. Meskipun spesies umumnya

diberikan setelah nama genus merupakan bagian dari kesatuan taksonomi, tetapi

strain mempunyai arti penting yang membedakan antara satu sama lain. Metode

taksonomi untuk identifikasi BAL berdasarkan sifat morfologi, yaitu bentuk sel,

pewarnaan gram, uji katalase, dan fisiologi secara umum hanya mampu

mengelompokkan sampai dengan taraf genus dan tidak dapat mengidentifikasi

sampai tingkat spesies (Surono, 2004)

Pada penelitian ini, kedelapan isolat yang diperoleh diharapkan memiliki

karakteristik bakteri Gram positif, katalase negatif, tidak membentuk spora, dan

tidak motil. Isolat ARK 6.2.e tidak memenuhi syarat pada hasil pewarnaan Gram.

Dimana pada hasil pewarnaan Gram satu isolat memiliki hasil negatif, sedangkan

tujuh isolat lainnya memenuhi karakteristik dari bakteri asam laktat.

Berdasarkan hasil pengujian sifat morfologi dan fisiologi bakteri yang

diisolasi dari limbah cair rendaman kacang kedelai, diduga jenis bakteri yang

terdapat di dalamnya merupakan bakteri asam laktat. Dengan melakukan

penelusuran pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, ketujuh

isolat tersebut merupakan genus Lactobacillus, seperti dapat dilihat pada Tabel

4.3.

33


Hasil penelitian ini, sama seperti pada penelitian sebelumnya yang

dilakukan oleh Pisol, et al. pada tahun 2013 yakni isolat yang diisolasi dari air

rendaman kacang kedelai adalah Lactobacillus heterofermentatif. Sedangkan pada

penelitian Pisol, et al. pada tahun 2015, isolat yang didapatkan adalah

Enterococcus faecium, Leuconoctos lactis, dan Leuconostoc sp.

Selain perbedaan tempat pengambilan sampel atau produsen tempe pada

kedua penelitian tersebut juga terdapat perbedaan cara pembuatan tempe, yang

diduga menyebabkan hasil isolat berbeda. Dimana pada penelitian Pisol, et al.

tahun 2013 hanya melalui satu kali perendaman selama 24 jam, sedangkan

penelitian Pisol, et al. tahun 2015 melalui dua kali perendaman yaitu setelah

perendaman 24 jam, kacang kedelai direbus dan direndam kembali selama 24 jam.

Pada penelitian kali ini, memiliki cara pembuatan yang hampir sama dengan

penelitian yang dilakukan pada tahun 2013, sehingga bisa didapatkan isolat

dengan karakteristik yang sama.

Tabel 4.3 Identifikasi Tingkat Genus (Generic Assignment)

Karakteristik Lactobacillus ARK

5.1.a

ARK

5.3.b

ARK

6.1.c

ARK

6.1.d

ARK

6.3.f

ARK

7.2.g

ARK

7.3.h

Bentuk sel: batang + + + + + + + +

Pewarnaan Gram + + + + + + + +

Endospora - - - - - - - -

Katalase - - - - - - - -

Motilitas - - - - - - - -

Tipe Fermentasi Ho/He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho

Pertumbuhan pada

45°C +/- + + + + + + +

Pertumbuhan pada

NaCl 6,5% +/- + + + + + + +

Keterangan:

+ : menunjukkan bentuk batang/hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri

- : menunjukkan hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri

Ho: Homofermentatif

He: Heterofermentatif

Isolat bakteri yang didapatkan ini juga dipengaruhi oleh suhu saat

perendaman kedelai (sampel). Pada suhu 20°C mikroba yang dominan adalah

Lactobacillus casei dan Staphylococcus epidermidis dan pada suhu 30°C mikroba

34


yang dominan adalah Lactobacillus casei, Streptococcus faecium, Strep.

dysgalactiae, dan Staph. epidermidis (Mulyowidarso, et al., 1989 dalam Ashenafi

dan Busse, 1990). Pada penelitian lainnya, dinyatakan lain yaitu suhu 19° dan

25°C didominasi oleh Lact. Plantarum dan suhu 37°C oleh Pedicoccus spp.

(Nout, et al., 1987 dalam Ashenafi dan Busse, 1990).

Seperti yang disyaratkan oleh FAO/WHO pada tahun 2002, probiotik tidak

boleh menyebabkan reaksi berbahaya dan aman terhadap sistem imun (dinyatakan

aman atau status GRAS). Salah satu cara untuk melihat kemanan dari isolat BAL

ini dengan melakukan uji aktivitas hemolisis menggunakan media blood agar.

Lapisan mukosa merupakan target yang dilewati untuk pertukaran zat-zat

penting secara fisiologis. Aktivitas hemolisis dapat menyebabkan pecahnya

lapisan epitel. Kerusakan tersebut dapat mengganggu fungsi normal lapisan

tersebut dan bisa menyebabkan terjadinya infeksi (Thakkar et al, 2015). Pada uji

aktivitas hemolisis digunakan Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif,

dengan hasil terdapat zona bening di sekitar koloni.

Zona bening yang terbentuk merupakan tanda adanya hemolisin, yaitu

enzim yang bersifat toksik, dapat melisiskan sel darah merah, berperan dalam

meningkatkan permeabilitas sel, sehingga sel lebih rentan terhadap agen infeksi

(Khusnan et al., 2002).

Koloni

bakteri

yang

tumbuh

Zona

bening

ARK 7.3.h Staphylococcus aureus

Keterangan:

ARK 6.3.f: warna kekuningan merupakan koloni bakteri yang tumbuh dilihat dengan cara

mengarahkan cawan petri ke cahaya

S. aureus: zona bening terdapat disekitar koloni

Gambar 4.7 Hasil Uji Aktivitas Hemolisis (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)

35


Pada S. aureus, hemolisin memiliki peran sebagai faktor patogenisitas dan

merupakan salah satu toksin penting yang dibentuk (Park et al., 2003). Blood agar

dapat memperlihatkan sifat hemolisis dari isolat, yang dapat dibedakan menjadi

alfa hemolisis, beta hemolisis, dan gamma hemolisis. S. aureus termasuk ke

dalam beta hemolisis yaitu terjadinya lisis sel darah merah dilengkapi kerusakan

dan penggunaan hemoglobin oleh mikroorganisme sehingga menghasilkan zona

bening disekitar koloni (Kusnadi, 2003). Pada penelitian ini, kedelapan isolat

BAL tidak menunjukkan terjadinya hemolisis, baik terjadi perubahan warna

media maupun terbentuk zona bening di sekitar koloni yang menandakan isolat

BAL termasuk gamma hemolisis atau merupakan bakteri non patogen.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat diambil beberapa

kesimpulan, diantaranya :

1. Diperoleh delapan isolat yang berhasil diisolasi dari limbah cair

rendaman kacang kedelai, yaitu ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c,

ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h, tujuh

diantaranya teridentifikasi sebagai BAL yakni isolat ARK 5.1.a, ARK

5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h

yang diduga sebagai anggota genus Lactobacillus.

2. Dari hasil karakterisasi, karakteristik ketujuh isolat BAL seragam yaitu

berbentuk batang, Gram positif, tidak membentuk spora, tidak motil,

tidak dapat tumbuh pada suhu 10°C, dan dapat tumbuh pada suhu 37°

dan 45° C serta konsentrasi NaCl 4% dan 6,5%. Isolat yang diperoleh

aman berdasarkan hasil uji aktivitas hemolisis.

5.2 Saran

Identifikasi BAL yang diisolasi dari limbah cair tempe masih bersifat

dugaan, sehingga disarankan untuk melakukan uji fisiologi dan biokimia lebih

lanjut yang belum dilakukan pada penelitian ini agar dapat mengidentifikasi BAL

sampai ke tingkat spesies.

37


DAFTAR PUSTAKA

Anastiawan. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari

Usus Itik Pedaging Anas domesticus. Skripsi: Universitas Hasanudin

Makassar.

Aron, Nicoleta Maftei, Monica (Găureanu) Boev, dan Gabriela Bahrim. 2015.

Probiotics and Therapeutic Effect in Clinical Practice – Review. Romanian

Biotechnological Letters, Vol. 20, No. 1.

Ashenafi, M. dan M. Busse. 1991. The Microflora of Soak Water During Tempeh

Production from Various Beans. Journal of Applied Bacteriology, 70: 334-

338.

Breed, Robert S., E.G.D. Murray, dan Nathan R. Smith. 1957. Bergeys’s Manual

of Determinative Bacteriology Seventh Edition. United States of America:

The Williams & Wilkins Company.

Bulut, Çisem. 2003. Isolation and Molecular Characterization of Lactic Acid

Bacteria From Cheese. Tesis: Biotechnology and Bioengineering, İzmir

Institute of Technology Turkey.

Candra, Joddi Iryadi. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari

Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi: Teknologi Hasil

Perikanan IPB.

Collin and Lyne’s. 2004. Microbial Methods Eight Edition. Arnold, a member of

the Hodder Headline Group, 338 Euston Road, London NW1 3BH.

Desai, Ankur. 2008. Strain Identification, Viability and Probiotics Properties of

Lactobacillus casei. Tesis: School of Biomedical and Health Sciences

Victoria University Australia.

Dewi, Amalia Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi, dan Uji Sensitivitas

Staphylococcus aureus terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing

38


Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo,

Kulonprogo, Yogyakarta. Jurnal Sain Veteriner 31 (2), ISSN: 0126-0421.

Firmansyah, Agus. 2001. Terapi Probiotik dan Prebiotik pada Penyakit Saluran

Cerna Anak. Sari Pediatri, Vol. 2, No. 4: 210-214.

Fitriyani, Ida. 2010. Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat

(BAL) dari Buah Matang yang Berpotensi Menghasilkan Antimikroba.

Skripsi: Biologi UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta

Gogineni, Vijaya K, Lee E Morrow, dan Philip J Gregory, dan Mark A Malesker.

2013. Probiotics: History and Evolution. Journal of Ancient Diseases &

Preventive Remedies Vol1, No 2: 107. doi:10.4172/2329-8731.1000107.

Harrigan W.F. and McCance M.E. 1976. Laboratory methods in food and dairy

microbiology 1st Ed. London: Acad Press, 25-29.

Harley, John P. 2005. Laboratory Exercises in Microbiology, Sixth Edition. New

York: The McGraw-Hill Companies, Inc

Hidayat, Nur dan Sri Suhartini. 2006. Mikrobiologi Industri. Teknik Industri

Pertanian FTP Universitas Brawijaya Malang.

Holzapfel, Wilhelm H, Petra Haberer, Rolf Geisen, Johanna Björkroth, and Ulrich

Schillinger. 2001. Taxonomy and important features of probiotic

microorganisms in food and nutrition. The American Society for Clinical

Nutrition. Am J Clin Nutr;73(suppl):365S–73S.

Isolauri, Erika, Yelda Sütas, Pasi Kankaanpää, Heikki Arvilommi, and Seppo

Salminen. 2001. Probiotics: effects on immunity. The American Joournal

of Clinical Nutrition;73(suppl):444S–50S.

Jay, M.J. 1992. Modern Food Microbiology, Fermented foods related products of

fermentation. Fourth edition. Chapman & Hall. London, UK, pp. 372-403.

Khedid, K., M.Faid, A.Mokhtari, A.Soulaymani, A.Zinedine. 2006.

Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from The One Humped

39


Camel Milk Produced in Morocco. Microbiological Research 164 81—91

doi:10.1016/j.micres.10.008.

Khusnan, Wahyu Prihtiyantoro, dan Mitra Slipranata. 2012. Identifikasi dan

Karakterisasi Fenotipe Staphylococcus aureus Asal Kasus Bumblefoot dan

Arthritis pada Broiler. Jurnal Kedokteran Hewan Vol. 6 No. 2, September

2012 ISSN: 1978-225X.

Kormin, Salasiah, Gulam Rusul, Son Radu, and Foo Hooi Ling. 2001.

Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional

Fermented Food. Malaysian Journal of Medical Sciences, Vol. 8, No. 1,

Januari (63-68).

Kusnadi. 2003. Mikrobiologi. Bandung: JICA IMSTEP.

Kusuma, Sri Agung Fitri. 2009. Bakteri Asam Laktat. Karya Ilmiah: Fakultas

Farmasi Universitas Padjajaran.

Malago, J.J. 2011. Probiotic Bacteria and Enteric Infections-Cytoprotection by

Probiotic Bacteria. London New York: Springer.

Moreno, M.R.F, J.J. Leisner, L.K. Tee, C. Ley, S. Radu, G. Rusul, M.

Vancanneyt, and L. De Vuyst. 2002. Microbial Analysis of Malaysian

Tempeh, and Characterization of Two Bacteriocins Produced by Isolates

of Enterococcus faecium. Journal of Applied Microbiology, 92, 147-157

Neha, Aurora, Singh Kamaljit, Bilandi Ajay, dan Garg Tarun. 2012. Probiotic: As

Effective Treatment of Diseases. International Research Journal of

Pharmacy, 3 (1) ISSN 2230-8407

Nur, Hasrul Satria. 2005. Pembentukan Asam Organik oleh Isolat Bakteri Asam

Laktat pada Media Ekstrak Daging Buah Durian (Durio zibethinus Murr.).

BIOSCIENTIAE Vol 2, No 1: 15-24.

Ozyurt, V. Hazal dan Semih Ötles. 2014. Properties of Probiotics and

Encapsulated Probiotics in Food. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 13(4),

413-424.

40


Park, Pyong Woo, Timothy J. Foster, Eiichiro Nishi, Sheila J. Duncan, Michael

Klagsbrun, and Ye Chen. 2003. Activation of Syndecan-1 Ectodomain

Shedding by Stapyhlococcus aureus α-Toxin and β-Toxin. The Journal Of

Biological Chemistry Vol. 279, No. 1, DOI 10.1074/jbc.M308537200

Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit

Universitas Indonesia (UI-Press)

Pisol, Balqis, Lilis Nuraida, Noriham Abdullah, Suliantari, dan Khalilah Abdul

Khalil. 2013. Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria from

Indonesian Soybean Tempe. 4th International Conference on Biology,

Environment and Chemistry IPCBEE vol.58 DOI: 10.7763/IPCBEE.

V58.7

Pisol, Balqis, Noriham Abdullah, Khalillah Abdul Khalil, dan Lilis Nuraida. 2015.

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Different Stages

of Traditional Malaysian Tempeh production. Malaysian Journal of

Microbiology, Vol. 11(4),pp. 358-364

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga

Prescott LM, Harley JP, and Kelin DA. 2002. Microbiology Bacteria: The Low

G+ C Gram Positive 5th

edition. Boston: McGraw Hill: 529-530

Ray, B. 2004. Fundamental Food Microbiology. CRC Press: Boca Raton London.

Reid, Gregor, Jana Jass, M. Tom Sebulsky, dan John K. McCormick. 2003.

Potential Uses of Probiotics in Clinical Practice. Clinical Microbiology

Reviews, Vol. 16, No. 4 p. 658–672.

Roberfroid, M., G. R. Gibson, L. Hoyles, A.L. McCartney, R. Rastall, I. Rowland,

D. Wolvers, B. Watzl, H. Szajewska, B. Stahl, F. Gyarner, F. Respondek,

K. Whelan, V. Coxam, M.J. Davicco, L. Léotoing, Y. Wittrant, N.M.

Delzenne, P.D Cani, A.M. Neyrinck, dan A. Meheust. 2010. Probiotic

Effect: Metabolic and Health Benefits. British Journal of Nutrition. Vol

104:2:61-63. DOI: 10.1017/S0007114510003363.

41


Romadhon, Subagiyo, Sebastian Margino. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri

Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin Sebagai Agen

Antibakteria Pada Produk-Produk Hasil Perikanan. Jurnal Saintek

Perikanan Vol. 8. No. 1.

Sopandi, Tatang dan Wardah. 2014. Mikrobiologi Pangan – Teori dan Praktik.

Yogyakarta: Penerbit ANDI.

Sun, Yalian, Xiuyu Lou, Xuan Zhu, Han Jiang, Qing Gu. 2014. Isolation and

Characterization of Lactic Acid Bacteria Producing Bacteriocin from

Newborn Infants Feces. Journal of Bacteriology and Mycology.Vol 1 (2)

ISSN : 2471-0172

Surono, Ingrid.S. 2004. Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. Jakarta: PT.

Tri Cipta Karya (TRICK)

Syafiq, A, Sauriasari R, Fikawati S, Amelia P, Soemijati A, Christy M, dan

Saragih F. 2015. Effect of Inulin Supplemented UHT Milk Consumption

on Faecal Bifidobacterium sp. And Lactobacillus sp. Of Healthy Children

in Depok, Indonesia. Malaysian Journal of Nutrition 21 (2):219 – 230.

Syarief, R., J. Hermanianto, P. Haryadi, S. Wiraatmadja, Suliantari, D. Syah, N.

E. Suyatna, dan Y. P. Saragih. 1999. Wacana Tempe Indonesia. Univ.

Katolik Widya Mandala, Surabaya.

Thakkar, Pooja, H.A. Modi, dan J.B. Prajapati. 2015. Isolation, Characterization,

and Safety Assessment of Lactic Acid Bacterial Isolates from Fermented

Food Products. International Journal of Current Microbiology and

Applied Science Vol 4, No 4: 713-725 ISSN: 2319-7706

Utami, Fauziah. 2013. Pengaruh Suhu Terhadap Daya Tahan Hidup Bakteri Pada

Sediaan Probiotik. Skripsi:Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah

Vandenplas, Yvan, Geert Huys, dan Georges Daube. 2014. Prebiotics: an update.

Sociedade Brasileira de Pediatria J Pediatr (Rio J). 91:6-21

42


LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Penelitian

\

Preparasi Alat

Isolasi BAL

Identifikasi Makroskopis:

- Bentuk koloni

- Bentuk tepian koloni

- Warna koloni

Air rendaman kacang kedelai selama semalam

Pemurnian dan peremajaan isolat

Stok kultur

Sterilisasi dengan

autoklaf

Uji aktivitas

hemolisis

Karakterisasi Morfologi Karakterisasi Fisilogi dan

Biokimia

Uji Keamanan

Pewarnaan Endospora

Pewarnaan Gram

Uji Motilitas

Uji Katalase

Uji Ketahanan Suhu

Uji Ketahanan NaCl

Uji Produksi gas

43


Lampiran 2. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Agar

44


45


Lampiran 3. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Broth

46


Lampiran 4. Hasil Isolasi BAL dari Limbah Cair Air Rendaman Kacang Kedelai

Pengenceran 10-5

Pengenceran 10-6

Pengenceran 10-7

Keterangan:

Hasil tiga pengenceran terakhir diinokuasikan ke media MRSA tersuplementasi

CaCO3 1% yang dilakukan secara triplo

(Sumber: Dokumentasi prbadi, 2016)

47


Lampiran 5. Hasil Perhitungan Total Plate Count (TPC)

Keseluruhan Bakteri:

Koloni/mL koloni/mL

koloni/mL

Bakteri Asam Laktat:

Pengenceran Jumlah koloni Rata-Rata Koloni Jumlah Koloni

10-5

107 133,67

163

131

10-6

55 78,34

63

117

10-7

14 16,33 -

17

18

Koloni/mL BAL koloni/mL

koloni/mL

Pengenceran Jumlah koloni Rata-Rata Koloni Jumlah Koloni

10-5

314 354,67 -

354

396

10-6

143 189,67

186

240

10-7

33 31

24

36

48


Lampiran 6. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel

ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c

ARK 6.1.d ARK 6.2.e ARK 6.3.f

ARK 7.2.g ARK 7.3.h Lactobacillus casei

Keterangan:

- Isolat yang diuji berumur 24 jam dengan perbesaran (100x10)

- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, ARK

7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri Gram positif ditandai

dengan warna ungu

- ARK 6.2.e merupakan bakteri Gram negatif ditandai dengan warna merah

Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016

49


Lampiran 7. Hasil Pewarnaan Endospora


ARK 6.1.d ARK 6.3.f ARK 7.2.g

ARK 7.3.h Lactobacillus casei

Keterangan:

- Isolat yang diuji berumur 24 jam dengan perbesaran (100x10)


7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri non-spora ditandai dengan

warna merah

(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)

50


Lampiran 8. Hasil Uji Katalase

ARK 5.1.a ARK 5.3.b

ARK 6.1.c ARK 6.1.d

ARK 6.2.e ARK 6.3.f

ARK 7.2.g ARK 7.3.h

Lactobacillus casei

Keterangan:

- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK

7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri katalase negatif

ditandai dengan tidak terbentuk gelembung gas

- Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif katalase menghasilkan

gelembung gas


51


Lampiran 9. Hasil Uji Motilitas

ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c ARK 6.1.d

ARK 6.3.f ARK 7.2.g ARK 7.3.h L.casei

Keterangan:


7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri non motil ditandai dengan

pertumbuhan hanya tempat penusukan inoculum


52


Lampiran 10. Hasil Uji Produksi Gas

ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c ARK 6.1.d

ARK 6.3.f ARK 7.2.g ARK 7.3.h L.casei

Keterangan:

- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan

ARK 7.3.h merupakan bakteri heterofermentatif ditandai dengan adanya gas

pada tabung durham

- Lactobacillus casei merupakan bakteri homofermentatif ditandai dengan tidak

adanya gas pada tabung durham


53


Lampiran 11. Hasil Uji Ketahanan Suhu

Isolat Suhu

10° C 37° C 45° C

L. casei

ARK 5.1.a

ARK 5.3.b

ARK 6.1.c

ARK 6.1.d

54


ARK 6.3.f

ARK 7.2.g

ARK 7.3.h

Keterangan:

- Pada suhu 10° C ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,

ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei tidak terdapat pertumbuhan

ditandai dengan tidak adanya kekeruhan


ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei terdapat pertumbuhan

ditandai dengan adanya kekeruhan





55


Lampiran 12. Hasil Uji Ketahanan NaCl

Isolat Konsentrasi NaCl

4% 6,5%

L. casei

ARK 5.1.a

ARK 5.3.b

ARK 6.1.c

ARK 6.1.d

56


ARK 6.3.f

ARK 7.2.g

ARK 7.3.h

Keterangan:

- Pada NaCl 4% ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,



- Pada NaCl 6,5% ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,




57


Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Hemolisis


ARK 6.1.d ARK 6.3.f ARK 7.2.g

ARK 7.3.h Lactobacillus casei Staphylococcus aureus

(Kontrol +)

Keterangan:


7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri yang aman ditandai dengan

tidak adanya zona bening disekitar koloni

- Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif menghasilkan zona bening

disekitar koloni


58


Lampiran 14. Alat dan Bahan yang Digunakan


Alat gelas Autoklaf manual Autoklaf digital Inkubator

Laminar Air Flow Refrigerator Oven Batang L & Ose

Pewarna Gram Pewarna

Endospora Timbangan analitik Mikropipet & tip

Media MRSB Media MRSA Pepton water Media SIM

Hot plate Bunsen Anaerobic jar

uin syarif hidayatullah jakarta isolasi dan...

Documents