UJIAN AKHIR SEMESTER VI TEKNIK LABORATORIUM KIMI ORGANIK

ISOLASI KUMARIN MONOTERPEN BARU DARI DAUN MICROMELUM MINUTUM DAN AKTIVITAS SITOTOKSINYA TERHADAP LHEISMANIA MAJOR DAN SEL KANKER

OLEHNAMA : LAILATUL ANNABP: 1210411013

DOSEN : SURYATI, M.Si

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS ANDALASPADANG2015

Isolation of new monoterpene coumarins from Micromelum minutum leaves and their cytotoxic activity against Leishmania major and cancer cells

A. Sakunpak, K. Matsunami, H. Otsuka, P.Panichayupakaranat

I. TUJUANMengisolasi kumarin monoterpen baru dari daun Micromelum Minitum dan menguji aktivitas sitosoksiknya terutama terhadap Leishmenia dan sel kanker.II. METODA EKSTRAKSIPada jurnal metoda ekstraksi yang digunakan adalah metoda refluks. Ekstraksi dengan refluks ini adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dengan jumlah pelarut yang konstan. Dimana bubuk kering dari daun Micromelum Minitum sebanyak 1 kg diekstrak 3 kali dengan metanol (3L x 3) selama 1 jam.Pengekstrakan dilakukan sebanyak 3 kali agar proses ekstraksi sempurna. Ekstrak tersebut dipekatkan menghasilkan ekstrak metanol mentah sebanyak 250 g.III. METODA ISOLASIMetoda isolasi yang digunakan adalah kromatografi vakum dengan fasa diam silika gel (polar). Ekstrak ini terlebih dahulu di pre-adsorbsi dengan silika gel. Hal ini dilakukan agar sampel dapat terserap pada silika gel dengan baik dan proses isolasi berjalan dengan baik sehingga pemisahan senyawa pada sampel juga baik.. Kolom yang digunakan adalah kolom terbaik (id 13 cm dan tinggi 6 cm). Kolom selanjutnya dielusi dengan 500 mL larutan dengan bantuan pompa vakum. Eluen yang digunakan adalah campuran heksana dan etil asetat menggunakan metoda step-gradient dimulai dari 100% heksana sampai 100% etil asetat. Step-gradien polariti artinya meningkatkan kepolaran eluen secara bertahap dimulai dari eluen non polar (heksana) sampai senyawa polar (etil asetat). Dimana senyawa yang terlebih dahulu keluar adalah senyawa non polar yang mendekati kepolaran heksana dan terakhir adalah senyawa yang mendekati kepolaran etil asetat, karena digunakan fasa diam silika gel yang bersifat polar sehingga senyawa yang polar akan tertahan pada silika gel menyebabkan senyawa tersebut lebih lama keluar dari kolom. Selanjutnya dengan 100% etil asetat sampai 100% metanol. Berdasarkan hasil KLT kromatografi di hasilkan 15 fraksi yang sama dan kemudian diuji dengan leishmanicidal. Dimana fraksi yang aktif yaitu fraksi 4 dan 5 kemudian dimurnikan.Untuk purifikasi hasil isolasi tersebut digunakan berbgai metoda untuk kedua fraksi tersebut :1. Fraksi 4Dimurnikan dengan kromatografi fasa terbalik. Teknik pemisahan dengan kromatogrfai ini adalah pemisahan senyawa dengan menggunakan fasa diam yang bersifat non polar dan fasa gerak yang bersifat polar. Pada jurnal digunakan fasa diam yang bersifat non polar yaitu ODS dan fasa gerak eluen polar yaitu campuran air dan metanol. Proses elusi digunakan metoda step-gradient yaitu dengan meningkatkan kepolaran eluen dimulai dari eluen polar 10% metanol sampai eluen yang tingkat kepolarannya rendah 100% metanol. Hal ini dilakukan karena fasa diam yang digunakan adalah bersifat nonpolar. Senyawa yang terlebih dahulu keluar yaitu senyawa polar kemudian diikuti oleh senyawa non polar karena senyawa nonpolar akan tertahan pada kolom yang disebabkan kepolaran senyawa dan kolom mendekat (nonpolar) atau sama. Dari proses ini dihasilkan 10 fraksi yang memiliki nilai rf yang sama sehingga bisa digabung dan selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap lheisaminicidal. Berdasarkan hasil ujinya didapatkan fraksi yang aktiv yaitu fraksi 7, dan fraksi ini dimurnikan dengan semi-preparative Rp-C18 HPLC dengan campuran air dan metanol sebagai eluent (35:65 v/v). Dari hasil pemurnian ini dihasilkan dua senyawa dengan Rf senyawa 1 = 40 dan senyawa 2 = 42. Artinya senayawa satu terlebih dahulu keluar karena kurang tertahan pada kolom HPLC sedangkan senyawa 2 tertahan lebih lama pada kolom HPLC karena sifatnya lebih mendekati sifat kepolaran fasa diam.

2. Fraksi 5Pada fraksi 5 dihasilkan 2 senyawa yaitu senyawa 3 dan 4, 5, 6. Fraksi 5 ini dipurifikasi dengan reserve-phase ODS colom dengan elusi sistem step-gradien menggunkan eluent dengan campuran air dan metanol dimulai dari 10% metanol sampai 100% metanol. Sehingga menghasilkan 13 fraksi (A-M). Senyawa 3 diperoleh dari fraksi D setelih dipurifikasi dengan HPLC semi preparatif C-18 dengan eluent air : asetone (68;38 v/v) dengan rf 30 min. Sedangkan senyawa 4, 5 dan 6 diperoleh dari fraksi E setelah dipurifikasi dengan eluen air:aseton (60:40). Dengan rf senyawa 4, 5, dan 6 berturut-turut 30,35,40 min. Dari rf tersebut dapat diketahui bahwa senyawa 4 kepolarannya lebih besar dari senyawa 4 dan 5 karena senyawa 4 kurang tertahan dikolom, sedangkan senyawa 6 memiliki kepolaran yang rendah (lebih non polar) atau mendekati kepolaran fasa diam pada kolom sehingga dia akan tertahan pada kolom dan keluar lebih lama.

IV. IDENTIFIKASI SENYAWASenyawa yang di identifikasi hanya dua senyawa yaitu senyawa 1 dan senyawa 2, karena senyawa 1 dan 2 belum diketahui strukturnya. Sedangkan untuk senyawa 3,4,5 dan 6 merupakan senyawa kumarin yang sudah diketahui.Senyawa 1 dan 2 berwarna kuning dalam bentuk bubuk, diidentifikasi dengan UV max (EtOAc) 251 dan 324 nm, IR vmax (KBr), dan High Resolution mass spektrum (HRESIMS) dengan menggunakan pelarut CDCl3, pelarut yaang digunakan tidak mengandung H karena jika ada H maka H dari pelarut tersebut juga akan terdeteksi pada spektrum sehingga akan menganggu proses penentuan struktur.Berdasarkan proses identifkasi tersebut didapatkan senyawa 1 sebagai minutin A atau 5-(7-peroxyl-3,7-dimetyl-5-octaenyloxy)-7-hydroxycoumarin, dengan formula C19H22O6.Sedangkan senyawa 2 diidentifikasi sebagai minutin B dengan formula C19H23O6.Senyawa 3-6 adalah senyawa kumarin yang sudah diktehaui sebelumnya yaitu :Senyawa 3 : 8,4-dihydroxy-3,4-dihydrocapnolactone-2,3diolSenyawa 4 : 8-hydroxyisocapnolactone-2,3-diolSenyawa 5 : 8-hydroxy-3,4-dihydroxcapnolactone-2,3-diolSenyawa 6 : clauslactone EStruktur senyawa

V. UJI AKTIVITAS Dilakukan 2 uji aktivitas ekstrak metanol dari daun Micromelum minitum yaitu :1. Aktivitas anti-leishmaniaPengujiannya aktivitasnya terhadap promastigotes ditentukan oleh pengujian viabilitas kolorimetri sel MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), menggunakan DMSO sebagai kontrol negativ dan amphotericin B sebagai kontrol positif.Besarnya aktivitas anti-leishmania ditentukan dengan pengukuran besarnya pengurangan serapan warna yang dihasilkan pada 540 nm. % inhibisi = [1-(A test A blank)/(A kontrol A blank)]Berdasarkan hasil ujinya, senyawa yang active terhadap Leishmania adalah minutin A (1), minutin B (2), senyawa 4 dan senyawa 6. Artinya senyawa kumarin yang diisolasi pada daun micromelum minitum dapat menghambat Leishmania. Sedangkan senyawa 3 dan 5 tidak aktiv.2. Aktivitas sitotoksik terhadap adenokarsinoma paru-paru dan sel leukemia.Sel adenokarsinoma paru-paru yang diuji yaitu : A549, SBC3, dan untuk sel leukimia yaitu K562, dan K562/ADM. Pengujiannya ditentukan oleh pengujian viabilitas kolorimetri sel MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), dengan DMSO sebagai kontrol negatif dan dexoribicin sebagai kontrol positif.Besarnya aktivitas sitotoksik ditentukan dengan pengukuran besarnya pengurangan serapan warna yang dihasilkan pada 540 nm. Berdasarkan hasil uji tersebut, ada 3 senyawa yang aktiv terhadap semua sel kanker yang diuji yaitu senyawa 6 (clauslactone E), senyawa 2 (minutin B) dan senyawa 4. Artinya senyawa tersebut dapat menghamabat pertumbuhan sel kanker.VI. KESIMPULANBerdasasrkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil beberapa kesimpulan yaitu :1. Eksrtak metanol daun Micromelum minitum memilik aktivitas terhadap lesihmania dan sel kanker.2. Berdasrkan hasil isolasi dan identifikasi Ekstrak metanol daun Micromelum minitum menghasilkan 6 senyawa golongan kumarin yang diantaranya 2 kumarin monoterpen baru dan 4 diantaranya sudah diketahui.3. Senyawa yang aktiv terhadap Leishmania adalah senyawa 1,2, 4 dan 6, sedangkan senyawa yang aktiv terhadap sel kanker (adenocarcinoma paru-paru) dan sel leukimia adalah senyawa 6, 2 dan 4. Dan senyawa yang tidak aktiv terhadap dua pengujian tersebut adalah senyawa 3, dan 5.

VII. RINGKASAN Pada jurnal digunakan beberapa metoda dalam mengisolasi senyawa golongan kumarin dari daun micromelum minutum. Metoda ekstraksi yang digunakan adalah metoda refluks yaitu metoda ekstraksi senyawa organik dengan pelarut pada temperatur titik didihnya dengan jumlah pelarut ang konstan selama waktu tertentu.Untuk metoda isolasi digunakan kromatografi fasa normal dengan bantuan vakum untuk mengelusi sampel. Metoda ini digunakan untuk memisahkan senyawa organi berdasarkan interaksi antara fasa diam yang bersifat polar dengan fasa gerak (eluent) yang bersifat non polar. Pengelusian dimulai dari senyawa non polar sampai senyawa polar, sehingga senyawa yang terlebih dahulu keluar (rf) rendah adalah senyawa non-polar karena kurang tertarik pada fasa diam sedangkan senyawa yang lama keluar adalah senyawa polar atau mendekati kepolaran fasa diam karena akan tertahan lebih lama pada kolom.Proses pemurnian digunakan kromatografi fasa terbalik dan HPLC . Pada kromatografi fasa terbailik digunakan senyawa non polar sebagai fasa diam dan senyawa polar sebagai eluen. Dan HPLC merupakan kromatografi menggunakan tekanan tinggi untuk mengelusi sampel.Dari proses isolasi tersebut dihasilkan 6 senyawa dari daun Micromelum minutum yang diantaranya 2 senyawa kumarin monoterpen baru dan 4 senyawa kumarin yang telah diketahui. Dari ke 6 senyawa tersebut hanya 4 yang aktiv terhadap Leishmania dan sel kanker yaitu senyawa 1,2,4,dan 6.