BAB I

SPEKTROSKOPI FLUOROMETRI

A. Latar Belakang

Spektroskopi adalah ilmu yang mempelajari materi dan atributnya

berdasarkan cahaya, partikel yang dipancarkan, diserap atau dipantulkan oleh

materi tersebut. Pada abad pertengahan 19 kimiawan Jerman Robert Wilhelm

Bunsen (1811-1899) dan fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-

1887) berkerjasama mengembangkan spektrometer, mereka menemukan

unsur yaitu rubidium dan cesium. Spektroskopi ng banyak berperan penting

dalam penemuan gas mulia.

Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan

spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari

spektrofotometer dan fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan

untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan,

direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.

Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang

gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya

yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi.

Metode dengan bantuan spektrometer adalah spektroskopi. Spektometer

terdiri dari sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor dan pencatat. Fungsi

prisma adalah untuk memisahkan sinar polimkromatis di sumber cahaya

menjadi sinar monokromatis. Dalam spektrometer modern, sinar yang datang

pada sampel diubah panjang gelombangnya secara kontinyu. Hasil percobaan

diungkapkan dalam spektrum dengan absisnya menyatakan panjang

gelombang (atau bilangan gelombang atau frekuensi) sinar datang dan

ordinatnya menyatakan energi yang diserap sampel. Radiasi cahaya atau

elektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang. Beberapa sifat fisika

cahaya paling baik diterangkan dengan ciri gelombangnya, sedangkan sifat

lain diterangkan dengan sifat partikel. Jadi cahaya dapat bersifat ganda.

Diagram suatu gelombang yang ditandai dengan cirri yang penting dapat

dilihat dalam gambar berikut :

λ = panjang gelombang, yaitu jarak yang ditempuh oleh gelombang selama

satu siklus (Cycle), dengan satuan : satuan panjang/ siklus A = amplitude

gelombang, yaitu perpindahan maksimum dari poros horizontal, satuan :

satuan panjang T = periode, waktu yang dibutuhkan untuk satu siklus

sempurna, satuan : detik/ siklus Ʋ = frekuensi osilasi, jumlah siklus dalam

tiap detik, satuan : siklus/detik atau Hertz.

BAB II

A. Teori Spektroskopi Fluorometri

Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi

setelah tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi

karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom

tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali keadaan semula

dengan melepaskan energi yang berupa cahaya (de-eksitasi). Fluoresensi

merupakan proses perpindahan tingkat energi dari keadaan atom tereksitasi

(S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses fluoresensi

berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi

berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.

Teknik analisis spektrofluorometri adalah termasuk salah satu tenik analisis

instrumental disamping teknik kromatografi dan elektroanalisis kimia. Teknik

tersebut memanfaatkan fenomena interaksi materi dengan gelombang

elektromagnetik seperti sinar-x, ultraviolet, cahaya tampak dan inframerah.

Fenomena interaksi bersifat spesifik baik absorpsi maupun emisi. Interaksi

tersebut menghasilkan signal-signal yang disadap sebagai alat analisis

kualitatif dan kuantitatif. Contoh teknik spektroflourometri absorpsi adalah

UV/VIS, inframerah (FT-IR) dan absorpsi atom (AAS). Sedang contoh

spektrofluorometri emisi adalah spektrofluorometri nyala dan inductively

coupled plasma (ICP), yang merupakan alat ampuh dalam analisis logam.

Masih banyak teknik lain yang didasarkan pada hamburan atau difraksi

cahaya seperti turbidimetri dan sinar-x.

B.  Prinsip Dasar Spektroskopi Flourmetri

Prinsip-prinsip umum dapat diilustrasikan dengan diagram Jablonski (Veberg,

2006), seperti yang ditunjukkan pada Gambar di bawah. Menurut diagram

Jablonski energi emisi lebih rendah dibandingkandengan eksitasi. Ini berarti

bahwa emisi fluoresensi yang lebih tinggi terjadi pada panjang gelombang

dari penyerapan (eksitasi). Perbedaan antara eksitasi dan panjang gelombang

emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.

Langkah pertama (i) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh

molekul,yang ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti

bahwa sebuahelektron bergerak dari keadaan dasar singlet, S0, ke keadaan

singlet tereksitasiS‟1. Inidiikuti dengan relaksasi getaran atau konversi

internal (ii), dimana molekul inimengalami transisi dari elektronik atas ke

yang lebih rendahS „1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya, emisi terjadi (iii),

biasanya 10 - 8 detik setelah eksitasi, ketika  kembali elektron kekeadaan

dasar lebih stabil, S0, memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang

sesuaidengan perbedaan energi antara kedua negara elektronik.

Dalam molekul, masing-masing kondisi elektronik memiliki beberapa

kondisibagian getaran terkait. Dalam keadaan dasar, hampir semua molekul

menempatitingkat vibrasi terendah. Dengan eksitasi dengan sinar UV atau

terlihat, adalahmungkin untuk mempromosikan molekul yang tertarik ke

salah satu tingkat getaranbeberapa tingkat tereksitasi secara elektronik yang

diberikan. Ini berarti bahwa emisifluoresensi tidak hanya terjadi pada satu

panjang gelombang tunggal, melainkanmelalui distribusi panjang gelombang

yang sesuai untuk transisi vibrasi beberapasebagai komponen dari transisi

elektronik tunggal. Inilah sebabnya mengapa eksitasidan spektrum emisi

diperoleh untuk menggambarkan secara rinci karakteristik molekul

fluoresensi

1. Luminesensi.

Yaitu emisi fotons dari keadaan tereksitasi elektronik. Terdapat dua tipe si

antara lain : a. Relaksasi dari keadaan eksitasi singlet excited. b. Relaksasi

dari keadaan eksitasi triplet.

2. Keadaan singlet dan triplet stated.

Yaitu keadaan dasar dua elektron perorbital. Keadaan eksitasi singlet :

elektron pada orbital tinggi memiliki arah spin berlawanan relative

terhadap elektron dalam orbital lebih rendah.

Keadaan eksitasi triplet : elektron valence tereksitasi secara spontan

berbalik arah spinnya. Proses ini disebut intersystem crossing. Elektron

dalam kedua orbital sekarang memiliki arah spin yang sama.

3. Jenis emisi

Dimana fluoresensi kembali dari keadaan eksitasi singlet ke keadaan dasar,

tidak memerlukan perubahan arah spin. Fosforesensi yaitu kembali dari

keadaan eksitasi triplet ke keadaan dasar, elektron perlu perubahan arah

spin. Laju emisi fluoresensi beberapa tingkat lebih cepat dari pada

fosforesensi.

Proses fluorosensi dalam keadaan tereksitasi, elektron akan di promosikan

ke orbital anti-bonding menjadikan atom dalam ikatan kurang kuat terikat

sehingga bergeser ke kanan kurva energi potensial S1 akibatnya elektron

terpromosikan ke level energi vibrational eksitasi S1 lebih tinggi dari pada

level vibrational dalam keadaan dasar. Deteksi vibrational berlangsung

lewat tabrakan intermolekul pada skala waktu 10-12s (lebih cepat dari pada

proses fluoresensi).

C.     Absorbsi

Ketika suatu atom atau molekul mengabsorbsi energi cahaya sebesar hνA

maka  elektron-elektron pada kondisi dasar (ground sate) S0akan

berpindah ke tingkat energi yang lebih tinggi ke tinggat S1 atau S2. Waktu

yang dibutuhkan untuk proses tersebut kurang dari 1piko detik.

Atom akan mengalami konversi internal atau relaksasi pada kondisi S1

dalam waktu yang sangat singkat sekitar 10-1ns, kemudian atom tersebut

akan melepaskan sejumlah energi sebesar hνfyang berupa cahaya.

Karenanya energi atom semakin lama semakin berkurang dan akan

kembali menuju ke tingkat energi dasar S0  untuk mencapai keadaan suhu

yang setimbang (thermally equilibrium). Emisi fluoresensi dalam bentuk

spektrum yang lebar terjadi akibat perpindahan tingkat energi S1 menuju

ke sub-tingkat energi S0 yang berbeda-beda yang menunjukan tingkat

keadaan energi dasar vibrasi atom 0, 1, dan 2 berdasarkan prinsip Frank-

Condon.

D.    Instrumen

Pengukuran intensitas fluoresensi dapat dilakukan dengan suatu fluorometer

filter sederhana. Fluorometri adalah suatu metode analisis yang erat

hubungannya dengan spektrofluorometri. Energi yang di serap oleh molekul

untuk transisi elektronik ke level energi yang lebih tinggi harus dilepaskan

kembali pada waktu kembali ke level energi terendah. Energi yang dilepaskan

ini dapat berupa panas dan untuk beberapa molekul tertentu sebagian dari

energi yang diserap dipancarkan kembali berupa cahaya (fluoresensi).

E .       Penerapan dari Spektroskopi Fluoresensi

Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah

ionuranil, UO22+. Umumnya alanisis fluorometrik melibatkan molekul

organik. Adabeberapa senyawa kelat logam yang berpendar yang

memberikan metode yang pekauntuk beberapa ion logam. Seringkali kelat

logam diekstraksi dari dalam larutanberair menjadi suatu pelarut organik

sebelum pengukuran, suatu proses dan sekaligusmemisahkannya dari ion-ion

pengganggu dan mengkonsentrasikan spesies yangberpendar. Misalnya,

banyak terdapat reagensia flourometrik untuk aluminium danberilium.

Logam-logam yang lebih berat seperti Fe2+, Co2+, Ni2+dan Cu2+

sebaliknyacenderung mematikan flourosens yang diperagakan oleh banyak

zat pengkelat itusendiri, hadinya logam itu dalam kompleks mendorong

dibuangnya energi yangdiserap secara tak radiantif.Kadang suatu analit yang

tidak berpendar dapat diubah menjadi suatu molekulyang berpendar kuat,

dengan suatu reaksi yang cepat dan kuantitatif, yang denganmuadah

digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik keseluruhan. Misalnya,hormon

epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin. Dalam larutan

basa,anion folat dari adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi 360 nm;

pancaran 530nm). Pasien dengan tumor tertentu pada kelenjar adrenalin dan

juga beberapa  penderita tekanan darah tinggi menunjukkan kadar efinefrina

yang meningkat dalamair seninya. Hormon yang terdapat pada kadar yang

sangat rendah dapat dipekatkandari dalam volume besar air seni dengan suatu

prosedur penukar ion pada suatu pHdimana nitrogen amino diprotonkan

untuk membentuk suatu kation RNH2-CH2,dielusi dalam sedikit volume

dengan ditukar-ganti dengan H+dan diolah seperti diatas untuk membentuk

flourofor itu.

Beberapa vitamin dapat ditetapkan secara fluorometrik. Oksidasi

lembuttiamina (vitamin B1) oleh Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan

suatu produk yangdisebut tiokrom yang memperagakan fluoresens biru pada

kondisi yang tepat. Jikapancaran pendaran itu diukur terhadap dua porsi

sampel, satu diolah denganferisianida dan yang lain tidak, orang dapat

mengurangi kontribusi pengganggu non-tiamina yang berpendar untuk

meningkatkan selektivitas. Riboflavin (vitamin B1) danpiridoksin (B6)

merupakan vitamin lain yang dapat ditetapkan oleh fluoresensi.Meskipun

kebanyakan asam amino tidak berpendar, tetapi mudah bereaksidengan

reagen fluoresamina untuk membentuk senyawa yang sangat berpendar

yangtelah digunakan dalam biokimia untuk mendeteksi kuantitas.Metode

fluoresensi sangat baik untuk menetapkan beberapa hidrokarbon aromatik

polisiklik yang telah dikelompokkan sebagai “polutan prioritas” oleh Jawatan

Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat (EPA), yang mengatakan

bahwafluoresens memberi deteksi yang sangat peka terhadap komponen-

komponen sampeltertentu dalam kromatografi cairan. Misalnya pada produk

Susu :Produk-produk susu mengandung beberapa fluorophores intrinsik.

Misalnya asamamino aromatik dan asam nukleat, triptofan, tirosin dan

fenilalanin dalam protein,vitamin A dan B2, Nikotinamida adenin

dinukleotida (NADH) dan klorofil, danberbagai senyawa lainnya yang dapat

ditemukan pada konsentrasi rendah atau sangatrendah di produk makanan.