BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Protein merupakan suatu polipeptida yang memiliki struktur primer, sekunder, tersier dan

kuartener. Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin digunakan dalam kerja

Biokimia. Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi

preotein, yaitu metode Biuret, Lowry, dan lain sebagainya. Masing-masing metode mempunyai

kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran

bergantung pada beberapa faktor seperti misalnya, banyaknya material atau sampel yang

tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia

(VIS atau UV).

Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu telah

digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal

dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana reagen folin ciocalteu apat

mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tersebut

mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen

folin ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi ini

menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin

ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu

(Hermansyah, 2012).

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2

reaksi.Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret,yang dalam

suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen

Folin-Ciocalteu,kompleks phosphomolibdat phosphotungstat (phosphomolybdotungstate),

menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai

samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi

secara kolorimetri.

3

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-

Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini

menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm, tergantung sensitivitas

yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk

menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang

dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih

sensitif untuk protein konsentrasi rendah dibanding metode biuret (Soeharsono, 2006).

4

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Teori Dasar

Reagen pendeteksi gugus fenolik seperti reagen Folin-Ciocalteu telah digunakan oleh

Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metode Lowry. Reagen Folin-Ciocalteu dapat

mendeteksi residu tirosin dalam protein karena kandungan fenolik residu tersebut mampu

mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat yang merupakan konstituen utama reagen folin-

ciocalteu menjadi tungsten dan molybdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi menunjukkan

puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah dari spektrum sinar tampak 600-800nm.

Gambar 1 Kompleks antara Cu2+ dengan peptida

Sensitivitas metode Lowry ini akan lebih baik jika digabung dengan ion-ion Cu.

Kompleks Cu-protein yang dihasilkan dari reagen biuret akan mereduksi 75% reagen Folin-

Ciocalteu, sementara residu-residu tirosin dan triptofan mereduksi 25% sisanya. Reagen Folin

Ciocalteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan cara pemanasan dan

refluks senyawa Na-tungstat dan Na-molibdat dengan asam orthofosfat.

Intensitas warna yang didapat kemudian dianalisis dan membandingkannya dengan data

standar, konsentrasi protein dalam sampel dapat diketahui. Pengukuran intensitas dilakukan

secara spektrofotometri sinar tampak. Pengukuran pada panjang gelombang 700 nm akan

memberikan absorbansi maksimum (komplemen warna biru) sehingga meminimalkan kesalahan

dalam pengukuran.

5

Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur jumlah penyerapan zat

suatu senyawa.  Penyerapan cahaya pada senyawa larutan tersebut, dalam spektrofotometri dapat

digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi larutan atau senyawa secara

kuantitatif. .  Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan

tyrosine-nya.  Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret

2.2 Metode Analisa

Protein dengan asam fosfotungsat-fosfomolibdad pada suasana alkalis akan memberikan

warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Untuk

mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu dibuat kurva standar yang

melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity (OD).

Gugus fenolik pada protein bertindak sebagai reduktor yang dapat menreduksi

fosfotungstat dan fosfomolibdat menjadi tungstat dan molibdenum yang merupakan ion

kompleks berwarna biru, juga Cu1+ pada kompleks protein bereaksi mereduksi fosfomolibdat

dan fosfotungstat membentuk larutan berwarna biru. Ion Molibdenum, Tungstat hasil reduksi

dari kompleks Cu-protein, juga dari tirosin dan triptofan berwarna biru, sehingga larutan akhir

berwarna biru pula.

Larutan diinkubasi terlebih dahulu 10 menit setelah penambahan reagen biuret agar

terjadi reaksi pembentukan Cu-protein dahulu sebelum direaksikan dengan reagen Folin-

Ciocalteu. Larutan diinkubasi lagi pada 30 menit agar bereaksi dulu dengan reagen Folin-

Ciocalteu. Pada setiap penambahan reagen Folin-ciocalteu diberi jarak 1 menit karena reaksi

Folin-Ciocalteu dengan protein membutuhkan waktu, dan konsentrasi warna biru yang

dihasilkan bergantung pada waktu reaksi terjadi. Agar setiap larutan protein dapat dibandingkan

dengan akurat, maka lama reaksi yang sudah terjadi pada tiap tabung harus sama pada saat

pengukuran pada spektrofotometer. Perbedaan waktu pengukuran tiap tabung pada

spektrofotometer diperkirakan adalah 1 menit, maka jarak pada penambahan reagen Folin-

ciocalteu pun seperti itu.Jika diukur pada waktu yang tidak tepat, maka hasil yang terbaca tidak

akan akurat karena waktu reaksi yang telah terjadinya berbeda-beda. Pembacaan

spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 700 nm dengan tabung 1 sebagai blanko.

Panjang gelombang 700 nm adalah panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi paling

6

tinggi, yang menyebabkan pengukuran lebih akurat pada panjang gelombang tersebut. Panjang

gelombang 700nm juga merupakan panjang gelombang untuk sinar tampak berwarna biru.

Dalam metode ini terlibat 2 reaksi.  Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk

sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion

Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat

phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat

reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan

warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.

Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini,

diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris,

senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium,

dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens

tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi.

Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan

penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein.

3.2 Kelebihan dan Kekurangan Metode Lowry

Kelebihan :

1. Sangat sensitive (100x lebih sensitive daripada metode biuret,20x lebih sensitive dari UV

absorption method)

2. Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel

3. Lebih spesifik

4. Sederhana, dapat dilakukan 1 –  1,5 jam

Kekurangan :

1. Warna bervariasi dihasilkan pada protein yang berbeda.

2. Warna tidak terbatas pada konsentrasi protein dan dengan senyawa fenol dapat

membentukwarna biru sehingga bisa menganggu hasil penetapan

3. Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer phosphate, monosakarida dan

heksoamin,Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan

7

interferens tersebut.Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi

absorbansi. Interferensiyang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat

dieliminasi dengan penambahanSDS atau melakukan preparasi sampel dengan

pengendapan protein

8

BAB III

PENUTUP

Kesimpulan

Bahan makanan yang mengandung protein jika ditetesi dengan larutan biuret akan

berubah wana menjadi biru

Protein dengan asam fosfotungsat-fosfomolibdad pada suasana alkalis akan

memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein

yang ditera.

Larutan biuret merupakan reaksi atau metode yang digunakan untuk mengetahui

atau membuktikan keberadaan ikatan peptida pada suatu larutan.

Pengukuran pada panjang gelombang 700 nm akan memberikan absorbansi

maksimum (komplemen warna biru) sehingga meminimalkan kesalahan dalam

pengukuran.

9

DAFTAR PUSTAKA

Anwar, F. 1992. Penetapan Zat Gizi Dalam Makanan. Bogor: IPB 

Hermansyah, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Biokimia. Inderalaya: MIPA UNSRI

Kristiani. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia. Salatiga: UKSW

Lehninger. 1998. Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga

Poedjiadi, Anna. 2007. Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta: UGM Press

Sudarmaji. 1996. Analisa Bahan. Yogyakarta: Liberty

10