translatedcopyofcloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
TRANSCRIPT
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
1/9
Kloning dan ekspresigen erythropoietin manusia
ABSTRAK
Gen erythropoietin manusia telah diisolasi dari sebuah perpustakaan fag genomric dengan
menggunakan campuran 20-mer dan 17-mer probe oligonukleotida. Seluruh wilayah coding
gen yang terkandung dalam 5!-kilobase "ind###-$am"#l fragmen. Gen berisi empat urutan
inter%ensi &15'2 pasang basa( dan lima ekson &5)2 pasangan basa(. #ni mengkodekan 27-
amino sinyal asam peptida dan asam protein matang 1''-amino dengan *r dihitung dari
1).+,,. Gen erythropoietin ketika diperkenalkan ke dalam sel o%arium hamster ina
menghasilkan erythropoietin yang biologis aktif in %itro dan in %i%o.
epentingan dalam erythropoietin &/( telah didokumentasikan seak pergantian abad &1(.
/po adalah hormon utama yang terlibat dalam regulasi dan pemeliharaan tingkat fisiologis
beredar eritrosit massa &2 +(. "ormon ini diproduksi terutama oleh ginal pada orang dewasa
dan oleh hati selama hidup anin &!-'( dan dipertahankan dalam sirkulasi pada konsentrasi
15-+0 miliunit 3 ml serum &7-,( atau sekitar 001 n* dalam kondisi fisiologis normal.
roduksi /po dirangsang dalam kondisi hipoksia &1 10(. /po diusulkan untuk mengerahkan
efek biologis dengan melampirkan ke situs mengikat tertentu pada sel-sel progenitor eritroid
untuk merangsang diferensiasi mereka menadi eritrosit dewasa &+ 11(. 4amun ketika ada
kerusakan progresif massa ginal seperti pada gagal ginal kronis sebuah hasil anemia karena
penurunan produksi dari /po &12 1+(. 6remik domba anemia dan tikus dengan kadar /podarah menurun menanggapi treament dengan /po &1! 15(. engan demikian peran terapi
untuk /po muncul kemungkinan dalam pengobatan anemia yang berhubungan dengan gagal
ginal. *iyake et al. &1'( dimurnikan /po untuk homogenitas dari urin pasien dengan anemia
aplastik berat. 4amun sudah sulit karena kelangkaan bahan awal untuk mendapatkan
umlah bahan dimurnikan diperlukan untuk menyelidiki memadai sifat biologis dan molekul.
ami elaskan di sini isolasi ofhuman gen /po berdasarkan terbatas asam amino urutan data
dari /po manusia. ua campuran penyelidikan setiap urutan mengandung-12)-
oligonukleotida yang digunakan dalam skrining perpustakaan. Gen ini ika dinyatakan
dalam sel mamalia mengkodekan produksi /po yang sepenuhnya biologis aktif in %itro dan
in %i%o. Sebuah laporan awal dari penelitian ini telah muncul &17(.
BAHAN DAN METODE
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
2/9
*anusia Genomic erpustakaan. Sebuah haron !8 fag-ditanggung manusia hati anin
pustaka genom dipersiapkan sesuai dengan prosedur 9awn et al. &1)( diperoleh dari :om
*aniatis &"ir%ard 6ni%ersity(.
Pemangunan Oligonu!leotide Proe
dimurnikan kemih /poisolated manusia dari urin pasien dengan anemia aplastik &1'( menadi
sasaran pencernaan tryptic. ;ragmen yang dihasilkan diisolasi dan disekuensing dengan
menggunakan 8pplied $iosystems fase gas microse-+2? 8: 7500-)000 i 3 mmol ( &1
i @ +7 G$50 ug dari proteinase per ml larutan buffer yang
mengandung 01 * :ris "l &p" )0( 015 * 4al 10 m* /:8 dan 02E 4aodS!?
selama +0 menit pada 550. rehybridiFation dengan 3 1E larutan 1 * 4al 4aodS!
dilakukan pada 550 selama ! am atau lebih. "ibridisasi penyangga yang terdapat 0025
pmol 3 ml dari masing-masing 12) urutan probe 0, * 4al 3 5 m* /:8 3 50 m* natrium
fosfat p" '5 3 05E 4aodS! 3 100 g t48 ragi per ml. "ibridisasi dilakukan pada
!)0for 20 am dengan menggunakan campuran penyelidikan /H. #ni adalah 2: bawah
terendah suhu disosiasi dihitung &td( &2+( untuk anggota campuran. ada penyelesaianhibridisasi filter dicuci tiga kali dengan 0, * 4al 3 ,0 m* natrium sitrat p" 70 3 0. 1E
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
3/9
4aodS! pada suhu kamar dan dua atau tiga kali dengan 0, * 4al#,0 m* natrium
sitrat p" 70 3 1E 4aodS! pada suhu hibridisasi 10 menit per mencuci. Sebelum
hibridisasi dengan campuran pemeriksaan kedua filter diinkubasi pada 100 di 015 * 4al
15 m* natrium sitrat p" 70 3 01E 4aodS! selama 2 menit untuk menghapus probe
hibridisasi. ;ilter yang lagi prehybridiFed seperti dielaskan di atas dan kemudian hibridisasi
dengan /I probe campuran di !'0 &!A bawah td dihitung termurah untuk campuran ini(
dan dicuci seperti dielaskan di atas.
Ma#elis Ekspresi $e!tor untuk Epo %ene"6ntuk ekspresi langsung dari genom
yang gen /po !)-kilobase &kb( $st/##-$am"# fragmen ofJ"/1 &lihat "asil( yang berisi
seluruh gen /po digunakan. Setelah mengkon%ersi situs $st/## ke situs $am"# dengan
linker sintetis fragmen itu dimasukkan ke dalam situs $am"# unik dari %ektor ekspresi
pSH9 &data tidak dipublikasikan( yang berisi dihydrofolate reduktase &";( minigene
dari p*gl &2!(. lasmid yang dihasilkan pSH9-g"u/ &Gambar. 98( kemudian
digunakan untuk transfect ina hamster o%ary sel &"( ";- &25( dengan metode
kalsium fosfat microprecipitate &2'(. :ransforman dipilih oleh pertumbuhan dalam mediumkurang hipoksantin dan timidin. *edia kultur yang digunakan adalah modifikasi media /agle
ulbecco ini dilengkapi dengan 10E serum anin sapi penisilin streptomisin dan glutamin
&25(.
Epo:es.#n %itro dan in %i%o akti%itas biologis ditentukan dengan menggunakan sel
kultur tulang tikus sumsum &27( dan tikus polycythemic e=hypo=ic &2)( masing-masing. :he
radioimmunoassay untuk /po digunakan antibodi diaukan terhadap 1E murni kemih /po
manusia dan persiapan /po manusia kemih dari 1100 unit 3 mg &8:-1( sebagai standar.
&solasi Epo mRNA"6ntuk memperoleh /po m48 5!-kb "ind###-$am"#
pembatasan fragmen dari J"/1 &lihat "asil( dimasukkan ke dalam %ektor shuttle pSH!S:&data tidak dipublikasikan(. Cang dihasilkan plasmid chimeric pSHg"u/ &Gambar. 1$(
digunakan untuk transfect S-1 sel &8: 91'50( dengan metode kalsium fosfat
microprecipitate &2'(. Setelah budaya selama + hari 48 dibuat dari sel-sel transfected
dengan prosedur guanidinium tiosianat dari hirgwin et al. &2,( dan poli &8( K m48
diisolasi dengan mengikat oligo &d:( -cellulose &+0(.
'DNA 'loning"Sebuah /po c48 $ank dibangun sesuai dengan modifikasi dari
prosedur umum kayama dan $erg &+1( oleh menggunakan poly &8( K m48 yang
dielaskan di atas &data tidak dipublikasikan(.
Southern lotting"*anusia limfosit 48 dicerna sampai selesai oleh berbagaienFim restriksi. Sampel 48 dicerna dielektroforesis pada gel agarosa 07E dan ditransfer
ke GeneScreenlus filter oleh modifikasi dari prosedur Selatan &+2(L setelah gel didenaturasi
dengan 05 * 4a" 3 15 * 4al itu dibilas sebentar dengan air suling dan kemudian
ditransfer dengan 15 * 4al 3 015 * natrium sitrat p" 70. ;ilter ini diselidiki dengan
nicktranslated +2-berlabel manusia clone /po c48 yang berisi wilayah coding dari situs
$st/## ke daerah ekor poli &8( &lihat Gambar. +(.
DNA Se(uen!ing" ;ragmen restriksi diklon ke *1+ %ektor fag oleh menggunakan
/scherichia coli strain M*10+ atau M*10, sebagai tuan rumah &++( dan disekuensing dengan
metode dideoksi dari Sanger et al. &+!(. $eberapa daerah yang diurutkan oleh label kinase
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
4/9
atau akhir-fill label fragmen restriksi diikuti oleh pembelahan kimia seperti yang dielaskan
oleh *a=am dan Gilbert &21(.
HAS&)
#solasi dan arakterisasi /po Gene dari Genomic erpustakaan *anusia. Sebuah hati
anin pustaka genom manusia dalam %ektor bakteriofag haron !8 diputar untuk coding gen
untuk /po. ua kolam renang oligonukleotida sintetik campuran yang digunakan sebagai
probe seperti yang dielaskan dalam $ahan dan *etode. Sebuah perpustakaan 1.500.000 klon
fag diputar secara berurutan dengan kedua campuran penyelidikan. 20-mer campuran
penyelidikan hibridisasi
untuk 272 plak fag dan
17-mer hibridisasi untuk
@ !00I plak. "anya !
plak hibridisasi dengankedua campuran
penyelidikan. 8nalisis
berikutnya Southern blot
dan 48 urutan
menegaskan bahwa tiga
dari empat klon yang
hibridisasi dengan kedua
campuran penyelidikan
mengandung setidaknya
sebagian dari gen /po.Satu klon J"/1 yang
berisi gen /po lengkap
dipilih untuk analisa lebih
lanut.
Gambar. 1. *aelis /po ekspresi plasmid. &8( pSH9g"u/ berisi minigene"; sebagai /co#-st # fragmen dari p*gl &diperoleh dari . Schimke( %irus simian !0
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
5/9
&SH!0( asal replikasi dan awal promotor 3 akhir fragmen "ind###-$am"# SH!0 nukleotida
&nt ( 25+)-2770 di $am"#-$cl aku fragmen p$+22 nt 2!!)-!+'2 &diperoleh dari . :ian(
di fragmen "ind###-/co# dan $st/##-$am"#fragment dari gen /po. :he SH!0 akhir
promotor digunakan untuk mendorong ekspresi gen /po. &$( pSHg"u/ mengandung asal
SH!0 replikasi awal 3 promIters akhir dan sinyal poli awal &8( dalam fragmen /co#-
$am"# p$+22 nt 2!!)-!+'2 dalam fragmen "ind###-/co# dan fragmen "ind###-$am"#
dari gen /po. anah menunukkan orientasi transkripsi. bp $asis pasang.
eta endonuklease restriksi dari gen /po manusia dari klon J"/1 ditunukkan pada
Gambar. 2. protein coding region gen dibagi oleh empat urutan inter%ensi. Seak situs inisiasi
transkripsi m48 untuk /po belum ditentukan karena kurangnya m48 aringan manusia
batas di sisi 5 ekson # tidak terdefinisi. Situs restriksi yang digunakan dalam analisis urutan
uga ditunukkan pada Gambar. 2 seperti segmen yang diurutkan.
Gambar. 2. peta embatasan gen /po manusia. /kson #H ditandai dengan kotak. otak-kotak
padat menunukkan daerah ekson yang diteremahkan. Garis putus-putus di sisi 5 ekson #
menunukkan bahwa situs awal untuk transkripsi tidak diketahui. Situs pengakuan
pembatasan endonucleas disingkat sebagai berikutL $ $G9 ##D "ind###D / $st/##D pn
#D * $am"#D st #D S Sma #D : Sst #D dan J J$8 #. eta arak ditampilkan di kb. anah
bawah peta menunukkan daerah yang diurutkan.
Gambar. + menunukkan urutan nukleotida gen /po manusia. /kson diidentifikasi oleh
perbandingan urutan nukleotida ke urutan asam amino dari /po kemih manusia &data tidakdipublikasikan( dan oleh perbandingan urutan genom untuk urutan c48 yang berasal dari
m48 diisolasi dari sel " memproduksi rekombinan /po. $atas ekson-intron gen /po
sesuai dengan aturan konsensus sambatan &+5(.
Gen /po mengkode protein dari 1,+ asam amino. $erdasarkan 4"2-terminal urutan asam
amino dari dimurnikan /po 1'' residu terakhir sesuai dengan protein dewasa dengan *r
dihitung dari 1).+,, dalam bentuk unglycosylated. 6rutan asam amino 27 pertama terutama
residu hidrofobik konsisten dengan wilayah ini pengkodean peptida pemimpin &+'(. 6rutan
asam amino mulai dari posisi 1 sesuai dengan urutan uung amino ofe=pressed produk /po
rekombinan dalam sel " &data tidak ditampilkan(. Seperti yang ditunukkan pada Gambar.
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
6/9
+ protein dewasa memiliki tiga lokasi potensial untuk glikosilasi 4-linked masing-masing di
ekson kedua ketiga dan keempat gen menurut aturan 8sn-J88-Ser 3 :hr &+7(.
Sebuah pencarian dari Seluruh wilayah '2'-bp hulu dari inisiasi protein kodon 8:G tidak
mengungkapkan urutan promoterlike seperti kotak 8:8 kotak 88: atau -100 wilayah
&+)( uga tidak setiap urutan seperti yang ditemukan di tempat lain di seluruh gen.
8da a 5'5-bp diteremahkan wilayah di uung + dari ekson lalu. 6rutan nukleotida hulu dari
situs poli &8( pada gen /po tidak mengandung konsensus poli &8( urutan sinyal 88:888
atau urutan terkait biasanya ditemukan di lokasi ini &+,-!1(. emikian pula konsensus poli
&8( sinyal tidak ditemukan di clone /po c48 dari cynomolgus monyet &data tidak
dipublikasikan(. Satu-satunya urutan menyerupai 88:888 adalah 88G88 ditemukan 11-
1+ nukleotida hulu dari poli &8( situs &Gambar. +(.
alam urutan inter%ensi antara ekson ### dan #H adalah anggota dari keluarga 8lu urutan
diulang. Ailayah ini adalah 70E homolog dengan konsensus 8lu urutan &!2(. Seperti khas
dari urutan ini daerah ini diapit oleh ulangi langsung tidak sempurna.
Ekspresi Epo %ene" $iologis aktif rekombinan /po manusia diproduksi dalam sel "
yang telah stabil berubah dengan %ektor ekspresi yang mengandung genom /po insert gen
didorong dengan SH!0 akhir promotor &Gbr. 18(. Sebuah sampel yang representatif dari 55-
hari 8 menengah dari sel pSH9-g"u/-transfected terkandung 1)2 unit /po per ml
bila diukur dengan radioimmunoassay dan 15) N !' dan 1') N +0 unit 3 ml bila diukur
dengan in %itro dan in tes %i%o masing-masing. eranian erat antara hasil tiga tes tersebut
menunukkan bahwa /po diproduksi dengan teknik rekombinan sepenuhnya biologis aktif.
/po yang disekresikan memiliki *r elas +!.000 ketika dianalisis di transfer blot
elektroforesis. /ndo-$4-asetil pengobatan ; mengurangi *r rekombinan /po dari +!.000 ke
-1,000 &data tidak dipublikasikan( menunukkan bahwa protein tersebut glikosilasi.
ekombinan /po telah ditentukan mengandung asam sialat dengan kromatografi gas &data
tidak dipublikasikan(. 8sam sialat terminal struktur karbohidrat /po telah terbukti diperlukan
untuk in %i%o akti%itas &!+(.
%enomi! Organisasi Epo %ene"8nalisis restriksi fragmen 48 limfosit manusia diperiksa
dengan manusia /po c48 mengungkapkan satu band di mencerna dari $am"# /co# 3
"ind### /co# 3 $am"# dan "ind###l $am"#. 8da tiga band terlihat dalam st # digest
&Gambar. !(. 6kuran band hibridisasi dari "ind### 3 $am"# dan st # adalah sama dengan
yang di terisolasi /po genom clone J"/1 seperti ditunukkan pada Gambar. 2. "ibridisasi di
keketatan rendah &55:( tidak mengungkapkan band tambahan yang menunukkan bahwatidak ada yang terkait erat gen /po lain atau pseudogen. Sebuah pencarian homologi dibantu
komputer dari gen /po manusia dan monyet terhadap Gen$ank dan seluruh $ank protein
ayhoff tidak mengungkapkan homologi signifikan dengan 48 atau protein urutan
diterbitkan termasuk angiotensinogen yang telah diusulkan sebagai kemungkinan /po
prekursor &!!(.
PEMBAHASAN
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
7/9
ampuran pendek probe oligonukleotida sintetik telah digunakan untuk mengisolasi klon dari
perpustakaan c48 &!5 !'(D 4amun probe oligonukleotida campuran belum pernah
digunakan sebelumnya untuk isolasi gen dari perpustakaan genom mamalia terutama karena
kompleksitas dari genom. *emanfaatkan dua campuran dari 12) urutan panang 17 dan 20
nukleotida kami telah dengan cepat mengisolasi gen /po manusia dari pustaka genom
menggunakan Odua-situsO pendekatan konfirmasi. endekatan ini untuk skriningperpustakaan genom menghilangkan seumlah besar positif palsu terkait dengan pendekatan
campuran tunggal-probe. alam penelitian ini tiga dari empat klon yang hibridisasi dengan
kedua campuran penyelidikan yang otentik klon /po seperti ditegaskan oleh urutan 48
atau blot Southern analisis. 8kurasi yang tinggi dari teknik ini merupakan penghematan besar
dalam waktu dan upaya yang diperlukan untuk mengisolasi gen yang diinginkan. unci
keberhasilan pendekatan screening dalam optimalisasi berbagai langkah dalam hibridisasi.
Gunakan filter GeneScreenlus mengakibatkan lebih efisien mengikat 48 dari yang
diperoleh dengan filter nitroselulosa dan uga memiliki keuntungan dari penggunaan
berulang. Sebuah media yang kaya seperti 4BC8* diperlukan untuk mendukung amplifikasi
yang baik dari fag pada enis filterD kelalaian asam casamino atau maltosa menghasilkan
sinyal hibridisasi lemah. :he proteinase pencernaan langkah sangat berkurang latarbelakang spesifik yang membuat menyelidik dengan campuran 12) urutan mungkin. i
bawah dipilih kondisi hibridisasi ketat &2-!0 di bawah td( konsentrasi probe 0025 pmol 3
ml setiap urutan mendekati optimum diperlukan untuk mencapai rasio signal-to-noise yang
baik saat menggunakan campuran dari ukuran ini. 9angkah-langkah optimasi ini bersama-
sama membuat skrining genom dengan oligonukleotida pendek mungkin. elayakan dan
kemudahan menggunakan campuran besar probe oligonukleotida pendek untuk mengisolasi
gen genom mamalia membuka alan baru untuk isolasi gen yang ada m48 atau antibodi
sumber diketahui tersedia dan yang hanya terbatas urutan asam amino yang dikenal.
Selanutnya gen yang dapat dinyatakan dalam %ektor ekspresi mamalia yang pada
gilirannya memungkinkan untuk isolasi m48 dan pembangunan perpustakaan c48.
etersediaan urutan c48 memberikan tugas yang akurat dari protein coding daerah dan
ekson-intron unction sambatan.
$ukti bahwa klon genom terisolasi mengandung gen /po didasarkan pada hasil yang
diperoleh ketika 48 ini dimasukkan ke dalam plasmid SH!0 promotor yang mengandung .
lasmid ini ketika transfected ke sel " menyebabkan produksi protein yang memiliki
akti%itas biologis /poi.e. protein merangsang produksi eritrosit. #se%ident ini dari hasil
bioassay in %i%o berdasarkan 5,;e penggabungan ditingkatkan menadi heme dalam eritrosit
tikus diobati dengan protein dan pada nilai hematokrit yang meningkat ketika protein tersebut
disuntikkan ke tikus normal &data tidak dipublikasikan(. :elah diusulkan bahwa bentuk-
bentuk biologis aktif dari /po disebut erythropoietinogen dan proerythropoietin diproduksidi ginal &lihat ref. + untuk diperiksa(. 8nalisis urutan 48 tidak mendukung hipotesis
tersebut. Gen /po mengkodekan preprotein mungkin terdiri dari 27-amino sinyal asam
peptida dan protein asam 1''-amino matang. rotein yang matang telah terbukti secara
biologis aktif.
Gambar. +. nukleotida urutan gen /po manusia. aerah coding dari ekson telah
diteremahkan dan urutan asam amino yang dikodekan ditampilkan di atas urutan nukleotida.
esidu asam amino diberi nomor dan situs potensial 4-linked glikosilasi yang ditunuk olehtanda bintang. anah atas urutan nukleotida menunukkan wilayah yang berhubungan dengan
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
8/9
keluarga 8lu urutan diulang. anah bawah urutan nukleotida menunukkan ulangi langsung
mengapit urutan 8lu. Situs yang polyadenylylated dalam m48 digarisbawahi. oli &8(
dapat ditambahkan setelah salah satu dari tiga kemungkinan posisi. otensi poli &8(
88G88 sinyal o%erlined.
Gambar. !. hibridisasi Southern 48 limfosit manusia dicerna dengan pembatasan
endonuklease. 9ane 1 +2-berlabel fragmen J"ind### mencerna dan J17! "ae ### digest
sebagai penanda berat molekulD alur 2 $am"#D alur + "ind### K /co#D lane ! $am"# K
/co#D lane 5 $am"# K "ind###D alur ' st #. 48 dicerna menadi sasaran elektroforesis
pada gel agarosa 07E ditransfer ke GeneScreenlus filter dan hibridisasi dengan nick-
diteremahkan +2-berlabel /po c48 di '50. *encuci posthybridiFation dilakukan di
'50 dengan 015 * 4a9 3 15 m* natrium sitrat p" 70 3 1E 4aodS!.
-
7/26/2019 TranslatedcopyofCloningandexpressionofthehumanerythropoietingene.docx
9/9
:idak ada bukti dari urutan gen yang bentuk lain dari pengolahan diperlukan.
etersediaan umlah yang cukup dari rekombinan /po akan memfasilitasi pemahaman yang
lebih lengkap tentang struktur dan fungsi molekul ini di hemopoiesis dan in%estigasipenggunaan potensinya sebagai agen terapi untuk pasien anemia.
Setelah selesai naskah ini Macobs et al. &!7( melaporkan isolasi gen /po manusia
menggunakan campuran probe oligonukleotida pendekatan yang sama dengan kita yang
mengkode protein /po dengan urutan asam amino identik dengan kita. Sebelumnya 9ee-
"uang &!)( melaporkan isolasi klon /po c48 manusia dari sebuah bank c48 manusia
menggunakan antibodi monoklonal. arena tidak ada informasi urutan diberikan dalam
makalahnya kita tidak bisa membandingkan clone ini dengan kita.