Insulin Merangsang Lipogenesis dan Melemahkan Beta-Oksidasi dalam Jaringan Adiposa Putih dari Fed Rainbow TroutAbstrak Sebagai jaringan deposisi lipid pada ikan, jaringan adiposa putih (WAT) memiliki fungsi penting yang berhubungan dengan reproduksi dan tantangan jangka panjang puasa. Dalam studi yang dilaporkan di sini, ikan yang diberi diet tinggi karbohidrat dengan dua dosis insulin selama 5 hari dalam rangka untuk mengeksplorasi efek dari hormon ini pada lipogenesis dan beta-oksidasi yang berhubungan dengan enzim. Kami menunjukkan adanya beberapa enzim lipogenic utama pada tingkat molekul, protein dan aktivitas (ATP-sitrat liase dan sintase asam lemak). Namun, sementara ATP-sitrat liase tiba-tiba diatur turun, sintase asam lemak adalah up-diatur (pada tingkat protein dan aktivitas) secara dosis-tergantung insulin. Enzim utama bertindak sebagai donor NADPH untuk lipogenesis juga ditandai pada tingkat biokimia dan molekuler, meskipun tidak ada bukti regulasi mereka dengan insulin. Di sisi lain, potensi oksidasi lipid ditemukan dalam jaringan ini melalui pengukuran ekspresi gen dari enzim yang terlibat dalam -oksidasi, menyoroti dua isoform palmitoyltransferase karnitin, keduanya turun-diatur oleh infus insulin. Kami menemukan insulin yang bertindak sebagai regulator penting dari metabolisme lipid WAT trout, merangsang tahap akhir lipogenesis pada tingkat aktivitas molekuler, protein dan enzim dan menekan -oksidasi setidaknya pada tingkat molekul. Hasil ini menunjukkan bahwa WAT pada ikan mungkin memiliki peran yang penting bukan hanya sebagai jaringan deposisi lipid, tetapi juga sebagai organ lipogenic (dengan kemungkinan keterlibatan dalam homeostasis glukosa) yang juga bisa dapat memanfaatkan lipid disimpan sebagai sumber energi lokal .PengantarJaringan adiposa putih (WAT) memiliki peran dalam penyimpanan energi dan sebagai isolasi dari suhu lingkungan dan trauma, menyimpan lipid dalam bentuk trigliserida (TAG) dan dalam memobilisasi mereka melalui pemecahan menjadi asam lemak bebas (FFA) dan gliserol [1]. Pada mamalia, beberapa studi telah mampu mendokumentasikan keberadaan enzim lipogenic dan konversi glukosa menjadi lemak insulin-dirangsang adipocytes [2], meskipun sangat sedikit yang diketahui tentang kapasitas oksidasi lipid WAT [3]. FFA berasal dari asupan makanan atau sintesis de novo disimpan sebagai TAG. Dengan kapasitas penyimpanan dan kemampuannya untuk menghidrolisis TAG, WAT menyediakan sistem penyangga FFA untuk organ lain [4].WAT merupakan salah satu toko lipid paling penting dalam beberapa teleosts, meskipun hati dan otot juga merupakan organ lipid penyimpanan di beberapa spesies [5]. Dalam salmonids, WAT didistribusikan terutama di rongga perut, berkaitan dengan mesenterika dan pilorik caeca [6]. Pada ikan, seperti pada mamalia, pengembangan WAT dan akumulasi lipid adalah proses yang berkesinambungan yang tergantung pada nutrisi [, 7 8] dan status reproduksi [9]. WAT menyediakan modal untuk reproduksi ikan [10] serta untuk menghadapi tantangan jangka panjang puasa [7].Sebagai mesin enzimatik bertanggung jawab untuk mobilisasi lipid dan deposisi pada ikan, WAT mirip dengan yang ditemukan pada mamalia [6], dan keduanya lipoprotein lipase (LPL) [11, 12] dan hormon-sensitif lipase (HSL) [13, 14] telah ditandai. Namun, aspek-aspek lain dari metabolisme lipid seperti potensi oksidasi lipid lipogenic dan belum sepenuhnya dieksplorasi dalam WAT ikan. Studi awal menunjukkan adanya aktivitas enzim lipogenic lemak visceral di belut [15], ikan lele [16] dan coho salmon [17]. Penelitian lebih baru juga meneliti keberadaan NADPH-donor enzim yang terlibat dalam lipogenesis di gilthead seabream [18]. Namun, atas dasar temuan di trout pelangi, di mana rekening hati untuk sintesis TAG lebih dari jaringan adiposa [19], dan tingkat yang lebih rendah dari aktivitas enzim lipogenic di masa kini WAT di coho salmon [17], Henderson dan Sargent [20] mengusulkan peran kecil untuk WAT dalam potensi ikan utuh lipogenic. Kapasitas oksidasi lipid dari WAT ikan yang kurang dipahami, meskipun -oksidasi baru-baru ini dilaporkan diatur oleh asam lemak yang berbeda in vivo [21] dan in vitro [22] dalam salmon Atlantik. Data Fungsional langka, dan hanya ekspresi gen dari palmitoyltransferase karnitin (CPT) telah dijelaskan dalam WAT dari rainbow trout [23] dan salmon [24], sementara ekspresi tidak ditemukan di gilthead seabream [25]. Enzim lain yang terlibat dalam oksidasi lipid juga dinyatakan dalam salmon WAT, termasuk asil-CoA oksidase dan asil-CoA dehidrogenase, meskipun mereka tidak diatur oleh sifat hadir minyak di feed [24].Metabolisme lemak pada ikan WAT diatur oleh faktor endokrin beberapa, seperti insulin, GH dan somatolactin, [26], glukagon [27] dan norepinefrin [28], dan juga oleh faktor-faktor lain seperti TNF-a [13, 29]. Jelas, sebagian besar studi pada kontrol endokrin metabolisme lipid pada ikan WAT telah difokuskan pada tindakan insulin [12, 27, 30, 31]. Sayangnya, semua studi ini dilakukan dalam rangka untuk memahami regulasi enzim kunci yang terlibat dalam penyimpanan lemak dan mobilisasi seperti LPL dan HSL (lihat di atas), dan tidak ada informasi tentang kontrol hormon lipogenesis atau oksidasi lipid yang tersedia untuk WAT ikan. Di sisi lain, aksi insulin pada jaringan lain seperti hati dan otot rangka putih telah banyak dipelajari, dengan tindakan lipogenic dan anti-lipolitik dominan hormon ini [30, 32]. Kami baru-baru ini melaporkan hasil yang sama pada tingkat molekul dalam trout pelangi berpuasa diresapi dengan insulin sapi selama 4 hari [33], meskipun detail mengenai WAT yang tidak tersedia dalam studi itu. Reseptor insulin juga telah dipelajari dalam rainbow trout WAT, menunjukkan bukti pertama dari regulasi insulin metabolisme lipid dalam jaringan ini [34].Dalam rangka untuk mengkarakterisasi potensi lipogenic dan pengaturannya oleh insulin pada ikan WAT, rainbow trout yang diresapi dengan dua dosis yang berbeda dari insulin sapi selama 5 hari. Kami menilai dua enzim utama yang terlibat dalam lipogenesis pada tingkat enzimatik, protein dan molekul (ACLY (ATP sitrat lyase) dan FAS (sintase asam lemak)) serta enzim utama yang bertindak sebagai donor NADPH, termasuk 6PGDH (6-phosphogluconate dehidrogenase ), G6PDH (glukosa 6-fosfat dehidrogenase), ICDH (dehidrogenase isocitrate) dan ME (enzim malic). Tingkat RNA dari dua enzim yang terlibat dalam oksidasi lipid juga dinilai, termasuk Hoad (hydroxyacyl-CoA dehidrogenase) dan CPT-1 isoform. WAT sensitivitas insulin dipelajari atas dasar status fosforilasi Akt, dan ikan diberi makan diet karbohidrat tinggi untuk melawan hipoglikemia insulin diinduksi disebabkan oleh infus pompa [35] dan untuk menginduksi lipogenesis, seperti dalam jaringan ikan lainnya [16, 36-38].

Bahan dan MetodeikanRainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) diperoleh dari INRA fasilitas eksperimen pertanian ikan Donzacq (Landes, Perancis). Ikan yang dipelihara dalam tangki dengan baik-aerasi air pada 17 C dan penyinaran dikendalikan (LD12: 12), dan diberi diet standar trout komersial selama periode aklimatisasi (T-3P klasik, Trouw, Perancis). Berat ikan adalah 200 10 g. Percobaan dilakukan sesuai dengan Pedoman Legislasi Nasional Perawatan Hewan Kementerian Riset Perancis (Decret No 2.001-464, 29 Mei 2001) dan telah disetujui oleh Komite Etika INRA (menurut INRA 2.002-36 , 14 April 2002).

eksperimental ProtokolUntuk infus hormon berkelanjutan, ikan adalah makanan-kekurangan selama 48 jam dan kemudian ditanamkan dengan 1003D Alzet miniosmotic pompa (Alza, USA) yang mengandung larutan insulin baik saline (kontrol, n = 6) atau sapi pada dua konsentrasi yang berbeda (n = 6) (~ 27 unit / mg, Sigma Chemical Co). Ikan pertama kali dibius dan ditimbang, dan pompa kemudian dimasukkan ke dalam rongga peritoneum melalui sayatan 1,0 cm-dibuat di garis tengah ventral di ca. 2.0 rostral dari sirip panggul cm. Sayatan ditutup dengan satu jahitan dan gel antibiotik dioleskan ke daerah insisi. Pompa ditanamkan di pagi hari dan ikan diizinkan untuk pulih. Keesokan harinya (24 jam kemudian), ikan diberi makan diet yang mengandung tingkat tinggi karbohidrat (30% dekstrin, tepung ikan 57% dan minyak ikan 10%) selama 5 hari dan sampel 6 jam setelah makan terakhir mereka. Pompa laju aliran didirikan pada 0,39 ll h-1, yang pada 17 C harus memberikan rilis berkelanjutan dari 0,35 (Ins1x) atau 0,7 (Ins2x) IU kg-1 hari-1 insulin selama 11 hari. Dosis yang dipilih didasarkan pada studi sebelumnya yang dilakukan di trout pelangi berpuasa [35, 39].

Jaringan dan Sampling DarahTrout dikorbankan oleh pukulan tajam di kepala. Darah telah dihapus dari kapal ekor dan disentrifugasi (3.000 g, 5 menit), plasma pulih segera dibekukan dan disimpan pada -20 C analisis tertunda. Gut isi ikan setiap sistematis diperiksa untuk mengkonfirmasi bahwa ikan sampel sebenarnya sudah dikonsumsi diet. The WAT perivisceral dikumpulkan dan dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada -80 C analisis tertunda.

Molekuler dan Biokimia AnalisisGlukosa plasma (bioMerieux, France), trigliserida (bioMerieux, Perancis) dan FFA (Wako Kimia GmbH, Jerman) tingkat ditentukan dengan menggunakan kit komersial disesuaikan dengan format lempeng. Kadar insulin Bovine diukur menggunakan sapi-spesifik ELISA kit komersial (Mercodia, Swedia) seperti dalam [35].Tingkat mRNA jaringan protein yang terlibat dalam metabolisme lipid ditentukan oleh real-time kuantitatif RTPCR (q-PCR) [33]. Transkrip dinilai FAS, G6PDH, ACLY, Hoad, CPTIA, CPTIB, CPTIC, CPTID, ME, 6PGDH dan ICDH. Primer (Tabel 1) yang dirancang untuk tumpang tindih intron mana mungkin (Primer3 software) menggunakan urutan dikenal ditemukan di database trout nukleotida (Genbank dan INRA-Sigenae) sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [33]. Kuantifikasi tingkat gen target transkrip dilakukan dengan menggunakan ekspresi gen ef1a sebagai referensi [40], yang ditemukan stabil dalam penelitian ini. Kuantifikasi dari transkrip gen target dalam kaitannya dengan transkrip gen referensi ef1a dilakukan mengikuti metode Pfaffl [40].Protein ekstraksi (20 lg) dan Western blotting dilakukan dengan menggunakan anti-phospho-Akt Ser473 (your Signaling Teknologi), anti-FAS (Santa Cruz Biotechnology), anti--tubulin (your Signaling Teknologi) dan anti-ACLY (Cell Signaling Teknologi) terhadap protein manusia.Jaringan yang digunakan untuk menilai aktivitas enzim dihomogenisasi dengan 10 vol es-dingin penyangga yang terdiri dari 20 mmol l-1 Tris (pH 7,4), 250 mMsucrose, 2 mmol l-1 EDTA, 10 mmol l-1 -mercaptoethanol, 100 mM NaF dan 0,5 mM EDTA. Homogenat disentrifugasi selama 20 menit pada 17.000 g dan supernatan digunakan segera untuk tes enzim pada 37 C dalam pra-kondisi mapan. Hoad dinilai seperti dalam [41], sementara G6PDH (substrat konsentrasi akhir 0,5 mM glukosa-6-fosfat) dan FAS (substrat konsentrasi akhir 50 Lm malonil-CoA) yang diperiksa dengan mematuhi metode yang dijelaskan oleh Figueiredo-Silva et al. [42] disesuaikan dengan jaringan trout. ME, ICDH dan 6PGDH dinilai seperti dalam [43], mengadaptasi kondisi ke WAT. Aktivitas ACLY ditentukan seperti dalam [44]. Tingkat aktivitas enzim yang dinyatakan dalam mg protein. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan protein Bradford kit assay (Bio-Rad, Jerman) dengan BSA sebagai standar.

Analisis statistikHasilnya dinyatakan sebagai berarti SEM (n = 6). Data dianalisis dengan ANOVA satu arah. Bila perlu, data yang log-berubah untuk memenuhi kondisi analisis varians. Pasca-hoc perbandingan dibuat dengan menggunakan uji Student-Newman-Keuls, dan perbedaan dianggap signifikan secara statistik pada P