STRUKTUR BAKTERI DAN FUNGI

Sudah sepatutnya dunia kedokteran berterima kasih kepada 'Bapak Biologi'

Antonie Philips van Leeuwenhoek atas dedikasinya dalam pengembangan

mikroskop di tahun 1723. Dengan mikroskop kita dapat mengamati morfologi

sel maupun motilitas mikroorganisme seperti bakteri dan fungi yang berukuran

kecil. Salah satu metode yang sering digunakan untuk mengamati morfologi,

dengan metode tersebut dapat diamati pula proses replikasi seperti binary

fission pada bakteri maupun budding pada khamir (yeast). Meski demikian,

karena sebagian besar mikroorganisme tersebut tidak berwarna/transparan

sehingga kontras sel dengan latar/background sulit dibedakan. Susunan kimiawi

dinding maupun membran sel bakteri sangat bervariasi, hal tersebut akan

terlihat pada proses staining. Salah satu metode staining yang paling banyak

digunakan adalah Gram staining yang ditemukan oleh Hans Cristian Gram pada

tahun 1884. Dengan Gram staining bakteri dapat dibedakan menjadi dua

kelompok, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Namun demikian ada juga

bakteri yang termasuk dalam kelompok Gram variabel dan Gram indeterminant .

Pada perkembangan metode staining lanjut, diaplikasikan untuk pengamatan

flagela, spora, maupun kapsul, untuk fungi, metode ini banyak digunakan untuk

kepentingan identifikasi fungi seperti pengamatan struktur hifa, konidia,

konidiospora, dan makrokonidia pada kapang/mold dan morfologi sel pada

khamir/yeast.

Wet Mount

Wet mount adalah suatu metode preparasi spesimen dimana spesimen hidup

dibiakan dengan cairan yang diletakkan pada kaca cekung atau kaca datar.

Bagian cekung dari kaca membentuk semacam wadah yang akan terisi oleh

substansi tebal mirip sirup seperti carboxymethyl cellulose. Mikroorganisme

bebas bergerak dalam cairan tersebut, walaupun viskositas substansi

menghambat pergerakan mikroorganisme. Hal ini memudahkan kita untuk

mengobservasi mikroorganisme. Spesimen dan substansi dilindungi agar tidak

tumpah atau terkontaminasi dengan menutup kaca cekung dengan kaca datar.

Menumbuhkan Biakan Bakteri

Bakteri secara normal bereproduksi menggunakan proses pembelahan biner

(binary fission)

1. Sel memanjang dan kromosom DNA bereplikasi.

2. Dinding sel dan membran sel menekuk ke dalam dan mulai membelah.

3. Lekukan dinding sel saling bertemu, membentuk dinding pemisah antara dua

DNA yang membelah.

4. Sel terpisah menjadi dua individu sel.

Beberapa bakteri bereproduksi dengan bertunas (budding). Semacam tunas kecil

muncul dari bakteri dan membesar sampai berukuran seperti sel induk. Setelah

berpisah, maka akan membentuk dua sel yang identik. Beberapa bakteri, disebut

bakteri filamen (actinomycetes), bereproduksi dengan memproduksi rantai atau

spora yang terletak pada ujung filamen. Filamen akan terfragmen dan fragmen

ini menginisiasi pertumbuhan sel baru.

Pewarnaan Spesimen

Tidak semua spesimen dapat terlihat jelas di bawah mikroskop. Seringkali

spesimen bercampur dengan objek lain pada latar belakang karena mereka

menyerap dan memantulkan panjang gelombang cahaya yang hampir sama. Kita

dapat memperjelas bentuk dan rupa dari spesimen dengan menggunakan

pewarnaan. Pewarnaan digunakan untuk membedakan spesimen dari latar

belakang.

Pewarnaan menggunakan bahan kimia yang melekat pada struktur

mikroorganisme sehingga memberikan efek warna kepada mikroorganisme agar

mudah dilihat dibawah mikroskop. Pewarnaan pada mikrobiologi terdapat dua

jenis, asam dan basa.

Pewarnaan basa merupakan kationik dan memberikan listrik positif. Pewarna

basa yang digunakan antara lain methylene blue, crystal violet, safranin dan

malachite green. Pewarna tersebut ideal untuk mewarnai kromosom dan

membran sel pada kebanyakan bakteri.

Pewarnaan asam merupakan anionik dan memberikan listrik negatif. Pewarna

asam yang digunakan antara lain eosin dan picric acid. Pewarnaan asam

digunakan untuk mewarnai materi sitoplasma dan organel-organel atau inklusi.

Tipe Pewarnaan

Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana menggunakan teknik pewarnaan basa yang digunakan

untuk menunjukkan bentuk dari sel dan struktur di dalam sel. Methylene blue,

safranin, carbolfuchsin dan crystal violet adalah pewarna yang umum digunakan

pada laboratorium mikrobiologi.

Pewarnaan Diferensial

Pewarnaan diferensial terdiri atas dua atau lebih teknik pewarnaan dan

digunakan untuk prosedur identifikasi bakteri. Dua dari banyak pewarnaan

diferensial yang umum digunakan adalah pewarnaan Gram (Gram stain) dan

Ziehl-Nielsen acid-fast stain.

Pada tahun 1884 Hans Christian Gram, seorang dokter dari Denmark,

mengembangkan pewarnaan Gram. Pengecatan Gram merupakan metode

pewarnaan untuk mengklasifikasikan bakteri. Mikroorganisme Gram-positif

tercat ungu, sedangkan mikroorganisme Gram-negatif tercat merah muda.

Staphylococcus aureus, sejenis bakteri yang meracuni makanan, adalah gram-

positif. Escherichia coli merupakan gram-negatif.

Teknik Pewarnaan Gram

1. Siapkan spesimen menggunakan heat fixation process:- Siapkan kaca objek yang bersih- Ambil sampel biakan bakteri- Letakkan mikroorganisme hidup pada kaca objek

- Keringkan sebentar di udara terbuka kemudian lewatkan melalui pembakar bunsen tiga kali

- Panas menyebabkan mikroorganisme melekat pada kaca objek.2. Teteskan pewarna crystal violet pada spesimen3. Teteskan iodin pada spesimen menggunakan tetes mata, iodin membantu crystal

violet untuk menempel pada spesimen. Iodin merupakan bahan kimia yang melekatkan pewarna ke spesimen.

4. Cuci spesimen menggunakan etanol atau larutan alkohol-aseton, lalu bilas dengan air.

5. Cuci spesimen untuk menghilangkan kelebihan iodin. Spesimen akan menunjukkan warna ungu.

6. Cuci spesimen dengan etanol atau alkohol-aseton untuk menghilangkan warna.7. Cuci spesimen dengan air.8. Teteskan safranin ke spesimen menggunakan tetes mata.9. Cuci spesimen.10. Gunakan tisu/kertas hisap untuk mengeringkan spesimen.11. Spesimen siap dilihat dibawah mikroskop. Gram-positif terlihat ungu, dan gram-

negatif terlihat merah muda.

PEMBUATAN PREPARAT DAN PENGECATANNYA

Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998).

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983).

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994).

Tujuan dari percobaan ini adalah dapat melakukan pembuatan preparat dari bahan yang berasal dari penderita baik itu dengan media cair dan media padat.Dapat melakukan

pengecatan bakteri khususnya dapat membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991).

Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983)

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991).

Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).

Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Schegel, 1993).

Sebagian besar dari genus anaerobik Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobik Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas

sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983)

Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005).

***or jika dirasa belum lengkap, silakan bisa buka2 buku:

-Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.-Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company, New York.-Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.-Gupte, S. 1990. Mikrobiologi Dasar. Binarupa Aksara, Jakarta.-Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.-Jaweta, E. 1986. Mikrobiologi Untuk Profesi Kesehatan. EGC, Jakarta.-Lim,D. 1998. Microbiology, 2nd Edition. McGrow-hill book, New york.-Pelczar, M. J. & E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press, Jakarta.-Ratna, S. H. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek , Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Penerbit Gramedia, Jakarta.-Schegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press, USA.-Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.-Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.-Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta.

ANATOMI JAMUR (FUNGI)Yang dimaksud badan dari fungi adalah bagian panjang, terdapat susunan filamen longgar yang disebut hifa (hyphae).Hifa dipisahkan oleh dinding sel yang disebut septa. Pada kebanyakan jamur, hifa dipisahkan menjadi satu unit sel yang disebut septate hyphae. Pada beberapa fungi, hifa tidak mempunyai septa dan terlihat seperti sel panjang multinukleus yang disebut coenocytic hyphae. Sitoplasma bergerak melalui hifa menembus pori-pori pada septa. Dibawah kondisi lingkungan yang baik, hifa tumbuh membentuk massa filamen yang disebut miselium. Jamur dapat

Makalah Tentang Pewarnaan Gram atau Pengecatan Bakteri

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan Masalah Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap

keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan

1.3 Tujuan Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri,

mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut.

BAB II TINJAUAN PUSTAKAMetode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.

Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan

gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008). Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur.

Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006). Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).

BAB III METODE PENELITIAN3.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.

3.2 Cara Kerja3.2.1 Pewarnaan Bakteri

Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri.

3.2.2 Pewarnaan Endospora Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASANPewarnaan Bakteri dan Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk

8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapan bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002).

Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000).

Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.