Sterilisasi Alat dan Bahan

PERCOBAAN 1

STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

       I.            Tujuan Percobaan

1.      Memahami prinsip sterilisasi

2.      Mengetahui dan memahami jenis-jenis metoda sterilisasi

3.      Melakukan sterilisasi alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi

4.      Menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi

    II.            Teori Dasar

Steril adalah istilah yang menunjukan kondisi tanpa mikroorganisme hidup.

Mikroorganisme hidup adalah organisme yang dapat berbiak dibawah kondisi optimum untuk

pertumbuhannya (Jutono, dkk. 1990).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga

jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak.

Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri

(Fardiaz, 1992).

Sterilisasi secara umum adalah metode destruksi semua bentuk organisme hidup.

Sterilisasi ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi pada alat dan bahan yang

digunakan pada pengujian mikrobiologi oleh bakteri/ virus dari lingkungan sekitar.

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakuakan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan

kimiawi.

1.      Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)

Sterilisasi dengan menggunakan saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau

0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk

sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.

2.      Sterilisasi secara fisik

a.       Sterilisasi panas lembab

Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 1210C selama 15 menit (Hadioetomo, 1985). Cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim didalam sel (Fardiaz, 1992).

Metode ini digunakan untuk :1)      Larutan dengan pembawa air2)       Alat-alat gelas3)      Pembalut untuk bedah4)      Penutup karet dan plastik5)      Media untuk pekerjaan mikrobiologi

b.      Sterilisasi panas kering

Dibandingkan pemanasan basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan suhu yang lebih tinggi serta waktu lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembaban maka tidak ada panas laten (Hadioetomo, 1985).

Pemanasan kering dapat menyebabkan dehidrasi sel dan oksidasi komponen-komponen di dalam sel (Fardiaz, 1992). Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan, selain itu peralatan yang digunakan untuk sterilisasi uap kering lebih murah dibandingkan uap basah (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan kering sering dilakukan dalam sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven dengan suhu 160-1800C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis (Fardiaz, 1992).

c.       Sterilisasi dengan Radiasi

1)      Radiasi ionisasiRadiasi ionisasi adalah radiasi yang mengandung energi yang jauh lebih tinggi daripada

sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 (Fardiaz, 1992). Radiasi dengan sinar gama dapat menyebabkan ion bersifat hiperaktif (Lay dan Hastowo, 1992).

2)      Radiasi sinar ultra violetSinar ultra violet dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial

yang sangat kuat. Daya kerjanya adalah absorbsi oleh asam nukleat tanpa menyebabkan kerusakan pada permukaan sel. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas yang mempunyai gelombang yang lebih panjang (Lay dan Hastowo, 1992).

3.      Sterilisasi secara kimiawi

Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering digunakan antara lain : 1)  Alkohol, daya kerjanya adalah mengkoagulasi protein. Cairan alkohol yang umum digunakan berkonsentrasi 70-80 % karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif. 2)  Khlor, Gas khlor dengan air akan menghasilkan ion hipokloride     yang akan mengkoagulasikan protein sehingga membran sel rusak dan terjadi inaktivasi enzim.

3) Yodium, daya kerjanya adalah bereaksi dengan tyrosin, suatu asam amino dalam emzim atau protein mikroorganisme. 4) Formaldehida 8 % merupakan konsentrasi yang cukup ampuh untuk mematikan sebagian besar mikroorganisme. Daya kerjanya adalah berkaitan dengan amino dalam protein mikrobia. 5) Gas etilen oksida, gas ini digunakan terutama untuk mensterilkan bahan yang dibuat dari plastik.

Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70 %. Menurut Gupte (1990), etil alkohol sangan efektif pada kadar 70 % daripada 100 % dan ini tidak membunuh spora. Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi. Alkohol 70 % disemprot-kan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikro-pipet. Menurut Volk dan Wheeler (1988), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri. Menurut Gupte (1990), alkohol 70 % dapat menyebabkan denaturasi protein dan koagulaasi.

No

.Metode Kelebihan Kekurangan

1 Sterilisasi dengan filtrasiDapat digunakan untuk media berwujud cair

2 Sterilisasi panas lembab Lebih efisien dalam waktu

Ada tetesan uap air pada alat dan bahan yang disterilkan

3 Sterilisasi panas kering

Tidak ada uap air yang menetes pada alat dan bahan yang disterilkan

Memerlukan temperatur yang tinggi dan waktu yang lama.Belum tentu dapat membunuh semua bakteri

4 Sterilisasi radiasi

Dengan panjang gelombang yang pendek, mempunyai daya antimikrobal yang kuat.

Sinar UV dapat menyebabkan kerusakan hati, kanker, dan lain-lain

5 Sterilisasi gas Waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan

konsentrasi etilen oksida.

 III.            Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan :

1.      Autoclave2.      Erlenmeyer3.      Tabung reaksi 4.      Cawan petri5.      Botol media6.      Gelas ukur7.      Labu takar8.      Gunting

9.      Kertas label10.  Benang kasur11.  Selotip12.  Kapas13.  Stirrer14.  Alumunium foil15.  Kain kasa

Bahan yang digunakan :1.      Nutrient Agar (NA)2.      Nutrient Broth (NB)

 IV.            Prosedur Percobaan

1.      Persiapan dan sterilisasi alat

Siapkan alat-alat yang akan disterilkan.

2.      Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer

Timbang Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB). Kemudian masukkan kedalam

erlenmeyer yang berbeda. Masukkan 200 ml aquades kedalam erlenmeyer yang berisi NA dan

100 ml aquades kedalam erlenmeyer yang berisi NB. Lalu masukkan stirrer dan panaskan.

Setelah larutan menjadi jernih, diamkan sebentar. Tutup dengan kapas dan alumunium foil

kemudian ikat dengan benang kasur dan diberi etiket. Lalu masukkan kedalam autoclave untuk

disterilisasi. Setelah 15 menit, dinginkan pada suhu kamar. Hasil diamati setelah 24 jam.

    V.            Data Pengamatan

Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave :

        erlenmeyer = 2 buah

        tabung reaksi = 10 buah

        Labu takar = 3 buah

        Gelas ukur = 2 buah

        Pipet ukur = 1 buah

        Cawan petri = 10 buah

Tabel 2. Hasil pengamatan

Media Data PengamatanSebelum Sesudah

NA

NA            +      Aquades5,6006 gr               200 ml(serbuk kuning)   (larutan bening)

Larutan kuning muda      Setelah dipanaskan sampai

mendidih, larutan menjadi berwarna kuning bening.

      Setelah disterilisasi dengan autoclave, larutan tetap berwarna kuning bening tetapi terdapat uap air dalam erlenmeyer.

      Setelah 24 jam, larutan memadat menjadi agar berwarna kuning muda dan terdapat sisa uap air dalam erlenmeyer.

NB NB             +     Aquades0,8018 gr               100 ml

serbuk kuning   (larutan bening) muda

Larutan sedikit keruh      Setelah dipanaskan, larutan

menjadi bening.      Setelah disterilisasi dengan

autoclave, larutan tetap bening dan terdapat uap air dalam erlenmeyer.

      Setelah 24 jam, larutan tetap bening dan tidak terdapat sisa uap air.

      Setelah dibandingkan dengan NB Kontrol terlihat perbedaan :

NB Kontrol larutannya keruh karena tidak disterilisasi. Hal ini menandakan adanya bakteri dalam larutanNB larutannya bening menandakan tidak adanya kontaminasi oleh bakteri (steril).

 VI.            Pembahasan

Sebelum melakukan pratikum mikrobiologi, alat-alat yang akan digunakan harus

disterilkan terlebih dahulu. Hal ini dilakukan untuk mencegah terkontaminasinya alat dan bahan

yang digunakan karena dalam praktikum mikrobiologi berhubungan dengan mikroorganisme

yang sangat kecil. Alat-alat yang disterilkan diantaranya erlenmeyer, tabung reaksi, pipet ukur,

cawan petri, gelas ukur, dan labu takar. Semua alat tersebut disterilisasi dengan menggunakan

autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit.

Mekanisme kerja autoclave :

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih

dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam

autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf

naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer

mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan

tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum

tekanan mencapai 0 psi.

Mekanisme penghancuraqn bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi

beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Protein dapat terdenaturasi karena sebagian

besar komponen dari bakteri adalah protein dan protein bersifat tidak btahann panas. Karena

sterilisasi ini menggunakan uap air panas sebagai agen pensterilnya sehingga saat alat-alat

dikeluarkan dari autoclave banyak sekali tetesan uap air yang mengenai alat. Oleh karena itu,

seharusnya alat-alat tersebut dimasukan kedalam oven untuk dikeringkan. Tapi hal ini tidak

dilakukan karena waktu yang diperlukan tidak mencukupi.

Percobaan selanjutnya dilakukan pembuatan media serta larutan pengencer. Pembuatan media Nutrien Broth (NB) didahulukan dibanding media Nutrien Agar (NA) ini di dasarkan pada komposisi dari masing-masing media,karena nutrien broth tidak mengandung agar maka akan lebih mudah larut dan membutuhkan waktu yang relatif lebih cepat di bandingkan nutrien agar yang mengandung banyak agar dalam komposisinya.

NB             +     Aquades0,8018 gr               100 ml

serbuk kuning   (larutan bening)

muda

Saat NB dilarutkan oleh aquades menghasilkan larutan yang agak keruh. Hal ini menunjukkan bahwa larutan tersebut masih belum steril. Sebelum dipanaskan, stirrer dimasukkan kedalam erlenmeyer untuk membantu proses pengadukan larutan. Larutan NB dapat dipanaskan menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer, tetapi jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuaisehingga tumpah). Pemanasan dilakukan pada suhu 1200C. Setelah dipanaskan larutan menjadi jernih. Pemanasan ini dilakukan agar dihasilkan larutan yang homogen. Kemudian botol media ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Selanjutnya di masukkan kedalam autoclave. Sterilisasi dilakukan pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah disterilisasi larutan tetap jernih dan terdapat uap air dalam erlenmeyer.

NA            +      Aquades5,6006 gr               200 ml(serbuk kuning)   (larutan bening)

Seperti pada media NB, media NA pun ditambahkan aquades untuk selanjutnya dipanaskan dengan suhu yang berbeda yaitu 1250C sampai larutan agak mendidih. Hal ini dilakukan karena dalam komposisi NA terdapat komponen agar yang bila didiamkan pada suhu kamar bisa memadat, sehingga dipanaskan sampai memdidih agar larutan menjadi homogen. Jadi jika media dimasukkan kedalam tabung reaksi, dan dibuat posisi datar atau miring maka akan memadat dengan sempurna. Kemudian botol media ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Selanjutnya di masukkan kedalam autoclave. Sterilisasi dilakukan pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah disterilisasi larutan tetap jernih dan terdapat uap air dalam erlenmeyer.

Setelah proses sterilisasi kedua botol media didiamkan selama 24 jam. Hal ini dilakukan karena

bakteri dapat membentuk koloni dalam waktu kurang lebih 24 jam. Media NB selanjutnya

dibandingkan dengan NB kontrol dan terlihat perbandingan sebagai berikut :

NB kontrol      : Larutan keruh karena tidak disterilisasi, hal ini menandakan adanya bakteri

dalam larutan (tidak steril).

NB                  : Larutan jernih, hal ini menandakan dalam media tersebut tidak terdapat

kontaminan (steril).

Sedang pada media NA larutan memadat menjadi agar berwarna kuning muda dan terdapat sisa

uap air didalamnya. Sisa uap air ini terbentuk karena saat penutupan botol media tidak diikat

dengan benang kasur sehingga saat proses streriliisasi dalam autoklaf penutup alumunium foil

terlepas dari botol media.         

VII.            Kesimpulan

1.      Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.

2.      Ada lima Metoda-metoda sterilisasi : sterilisasi lembab, sterilisasi kering, sterilisasi filtrasi, sterilisasi gas, dan sterilisasi radiasi.

3.      NA larutanya memadat jadi agar, berwarna kuning muda, NB larutanya jernih yang menandakan larutanya steril.

VIII.            Daftar Pustaka

1.       http://youyoecreativeinc.blogspot.com/2008/11/laporan-mikrobiologi-pertanian.html2.       http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-3-sterilisasi.html