Role of the eNOS-NO system in Regulating the antiproteinuric effects of VEGF

receptor 2 inhibition in diabetes

Ketika teori regulasi dari Vascular endothelial growth factor (VEGF) pertama kali

dijelaskan satu dekade yang lalu menggunakan model tikus yang dibuat diabetes, hal tersebut

sepertinya dapat menjelaskan peranan hal ini dalam patogenesis nefropati pada diabetes.

Peranannya ada 2, yaitu VEGF glomerular yang menurun atau terjadi peningkatan gangguan

VEGF sebagai kompensasi untuk memproteksi ginjal. Sejak saat itu, mulai dilakukan banyak

penelitian untuk menjelasakan VEGF/VEGF receptor-2 ( VEFGR-2) mungkin berperan

dalam perkembangan ginjal pada hemeostatis glomerular dewasa, dan pada penyakit ginjal.

Sebagai contoh, pemakaian anti-VEGF yang sering dipakai dalam bidang onkologi (karena

mempunyai efek anti angiogenesis nya), dimana dengan memblok sinyal VEGF pada

reseptornya dapat menjadikan hipertensi, proteinuriam dan cedera yang cukup signifikan

pada cedera ginjal.

Sebaliknya, dalam beberapa penelitian diabetes ditemukan efek lain dalam blokade

VEGF. Efek lainnya yang bermanfaat dalam diabetes adalah ketika diberikan obat-obatan

yang mensensitisasi VEGF/VEGFR-2, terdapat efek dalam menghambat terjadinya

albuminuria. Namun hal ini belum diketahui lebih jauh apakah ada faktor ekstrinsik lainnya

yang mempengaruhi kerja sistem VEGF/VEGFR-2 dalam glomerulus.

Salah satu faktor resiko yang mungkin mempengaruhi respon terhadap sistem

VEGF/VEGFR-2 adalah enzim vasodilator, endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Dalam

penelitian sebelumnya efek albuminuria dalam penghambatan VEGFR-2 diketahui terganggu

pada tikus yang secara genetik mempunyai defisiensi eNOS.

Untuk mengetahui apakah kerja eNOS lebih jauh lagi dalam penghambatan VEGF,

dilakukan penelitian eksperimental pada tikus yang diabetes. Tujuan penelitian ini adalah

untuk menentukan apakah proteinuria yang diinduksi oleh penghambatan VEGF terjadi tanpa

ada faktor eksternal yang mempengaruhi pada sistem vaskuler, dan untuk mengetahui apakah

respon antiproteinuria dari VEGFR-2 pada keadaan diabetes disebabkan oleh adanya aktivitas

dari ENOS.

Metode:

Penelitian 1

Penelitian pertama menggunakan tikus-tikus yang berumur 8 minggu, kemudian

dipilih secara acak untuk mendapatkan polysorbate 80 atau vandetanib, masing-masing

kelompok memakai 4 tikus. Vandetanib adalah inhibitor VEGFR-2 tirosin kinase yang poten

dengan selektifitas yang tinggi terhadap kinase yang lain termasuk VEGFR-1, erbB2, MEK,

CDK-2, Tie-2, IGFR-1R, PDK, PDGFRβ, dan AKT. Hewan coba diberikan polisorbat atau

vandetanib selama 14 hari, kemudian dihentikan untuk diamati selama 10 hari sejak

dihentikannya pemberian obat. Tekanan darah sistolik dan eksresi protein urin dinilai pada

hari sebelum pemberian obat, hari ke-14, dan hari ke-24. Tekanan darah diukur pada ekor

tikus dengan mtode plethysmography. Untuk pengukuran eksresi protein urin, tikus yang

telah diberikan obat-obatan dipisahkan dalam kandang sendiri kemudian dibiarkan selama 2-

3 jam. Tikus kemudian diberikan banyak minum dan diambil 5mL urin yang disimpan dalam

suhu -20oC untuk analisis yang berkelanjutan dengan menggunakan analyzer Olympus.

Penelitian 2

Tikus yang berumur 8 minggu dipilih secara acak untuk mendapatkan streptozotocin

(STZ) (tikus diabetes n=10) dam cairan sitrat (tikus non diabetes n=8) dengan diinjeksikan

pada ekornya setelah dipuasakan pada malam hari sebelumnya. Hewa coba kemudian

dimonitor selama 24 jam.

Penelitian 3

Tikus yang berumur 8 minggu dipilih secara acak untuk mendapatkan STZ

(n=25)atau sitrat (n=8) dengan diinjeksikan pada ekornya setelah dipuasakan pada malam

hari sebelumnya. Tikus tikus yang diabetes (yang diberikan STZ) kemudian secara acak

diberikan polisorbat 80 (n=11), 25 mg/kg vandetanib (n=10), dan 25 mg/kg vandetanib

ditambah NOS inhibitor N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 20 mg/kg) selama 24

hari.

Semua tikus dikondisikan dalam ruangan dengan suhu 22±1oC, diberikan pakan dan

minuman sebanyak-banyaknya. Setiap minggu tikus di ukur berat badan dan glukosa

darahnya. Tikus yang diabetes mendapatkan injeksi insulin 3 kali seminggu untuk

meningkatkan berat badannya. TD sistolik dan eksresi protein urinnya diperiksa seperti yang

sudahdijelaskan tadi, dan GFR nya diukur dengan pemberian single-shot 99m-technetium

diethylenetriamine pentaacetic acid (Tc99m-DTPA). Eksresi nitrit diukur dengan nitrite

colorimetric assay kit.

Untuk diperiksa ginjalnya. Tikus mendapatkan anestesi natrium pentobarbital

(60mg/kg) yang diinjeksikan secara intraperitoneal. Arteri renal dextra dan sinistra tikus di

klem, dan ginjalnya diangkat. Ginjal kiri tikus ditimbang dan disimpan dalam suhu -80oC

untuk dianalisis susunan selnya. Ginjal kanan diris secara transversal dan direndam dalam

formalin 10% selama 24 jam. Jaringan kemudian diberikan paraffin untuk kemudian dibaca

dalam mikroskop.

Seluruh prosedur eksprerimen telah mendapatkan ijin etik dari St. Vincent’s

Hospital animal Ethics Commitee (melbourne, australia) dan St. Michael Hospital Animal

Care Committee (toronto, kanada).

Real time PCR

Untuk menentukan ekspresi gen pada ginjal tikus , jaringan yang disimpan dalam

suhu -80oC dilakukan homogenisasi. RNA secara keseluruhan diberikan RQ1 DNAse untuk

membuang DNA genom. RNA ditranskripsikan secara terbalik dengan alat High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kit. Pengukuran ekspresi gen eNOS menggunkan SYBR green

pada alat ABI prism 7900HT Fast PCR system. Data kemuadian dianalisis dengan Applied

Biosystems Comparative CT Method.

Immnunoblotting

Immunobloting ginjal tikus dilakukan pada membran nitroselulosa dan dengan

antibodi dengan perbandingan antibodi:eNOS 1:1000, phospo-eNOS ser1177 1:1000 dan β-

actin 1:5000. Setelah diinkubasi dengan antibodi sekunder yang terkonjugasi HRP, protein

dideteksi dengan sistem elektrochemiluminescence. Densitometry dilakukan dengan alat

Image J version 1.39.

Immunohistochemistry

Immunohistochemistry eNOS dan marker makrofag CD68 dilakukan dengan

antibodi primer dengan komposisi eNOS:1:400 dan ED-1 1:100. Kemudian diinkubasi

dengan HRP dan sebelum diwarnai dengan Haematoxylin ,diberikan label terlebih dulu

dengan mengunakan Liquid Diaminobenzidine dan Substrat Chromogen System. Dalam

setiap irisan ginjal, ilfiltrasi makrofag ditentukan dengan immunostaining ED-1 yang dipilih

secara acak dalam pembesaran 100x pada 10 lapang pandang yang berbeda.

Index Glomerulosklerosi

80 glomerulus diperiksa dengan pewarnaan PAS untuk setiap tikus. Derajat sklerosis

ditentukan secara subjektif dari skala 0 sampai 4 dengan rincian; 0= normal, 1= area sklerosis

<25%, 2= area sklerosis 25-50%, 3= area sklerosis 50-75%, dan 4= area sklerosis 75-100%.

Glomerulosklerosis didefinisikan sebagai kedaaan dimana adanya penebalan membran,

hipertrofi mesangial dan oklusi kapiler. Indes Glomerulosklerosis (GSI) dihitungdnegan

menggunakan rumus GSI = Σfi (i).

Analisis statistik

Data dipresentasikan sebagai rerata (mean). Signifikansi statistikal ditentukan

dengan menggunakan Student’s t-test untuk 2 kelompok, atau one-way ANOVA dengan

perbandingan Newman-Keuls post hoc untuk kelompok > 2. Semua analisis statistik

dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism Verison 5.cc for Mac. Nilai P < 0,05

dianggap sebagai signifikan.

HASIL

Proteinuria yang diinduksi oleh VEGFR-2 inhibitor dapat menyebabkan terjadinya

hipertensi

Untuk mengetahui apakah peningkatan penignkatan eksresi protein urin terjadi

secara independen dalam peningkatan tekanan darah atau kedua hal ini berhubungan, peneliti

memberikan vandetanib dan polisorbat setiap hari selama 14 hari. Pada hari ke 14, eksresi

protein urin meningkat secara signifikan pada tikus yang diberikan vandetanib. Setelah

pemberian vandetanib dihentikan dan dimonitor selama 10 hari, tidak terdapat penignkatan

yang signifikan. Sebaliknya tekanan darah sistol tidak mengalami perubahan sejak awal

pengukuran , dan setelah dihentikan pemberian vandetanib, tekanan darah sistolnya

meningkat.

Tikus yang diabetes menunjukkan peningkatan ekspresi eNOS dan ekresi metabolit

nitrit oksida.

Untuk memeriksa ekspresi eNOS dan produksi NOS pada keadaan diabetes, hewan

coba dibuat dalam keadaan diabetes dengan pemberian STZ selama 24 hari. Dibandingkan

dengan tikus non diabetes, mRNA dan protein eNOS meningkat secara signifikan pada tikus

yang diabetes. Untuk mengkonfirmasi bahwa ekspresi eNOS adalah hasil aktivitas biologis,

dilakukan immunobloting dengan antibodi yang berikatan pada eNOS pada saat

terfosforilisasi pada SR 1177, yang mengindikasikan adanya aktivasi enzim. Hasilnya

menunjukkan bahwa terdapat peningkatan aktivitas dari eNOS yang terlihat pada peningkatan

eksresi nitrit pada urin tikus yang diabetes. Pada kedua kelompok kontrol dan diabetes,

protein eNOS hanya terbatas pada sel endotel dari arteriol dankapiler glomerulus.

Diabetes mencegah proteinuria yang diinduksi oleh VEGFR-2 inhibitor

Setelah mengetahui bahwa terjadi aktivitas NO pada ginjal tikus yang

diabetes,selanjutnya peneliti memeriksa apakah hewan coba tersebut terlindungi dari efek

VEGFR-2 inhibitor dengan vandetanib. Pemberian vandetanib ternyata meningkatkan

deposisi matrix mesangial pada tikus diabetes dibandingkan dengan tikus non

diabetes.akumulasi makrofag dalam korteks renalis pada tikus diabetes juga meningkat pada

tikus yang diberi vandetanib. Sebaliknya, pemberian penghambat NOS L-NAME

menghasilkan terjadinya proteinuria masif.

PEMBAHASAN

Keja biologis dari VEGF/VEGFR-2 pada glomerulus bertangggung jawab terhadap

perubahan keseimbangan isoform dan faktor eksternal. Awalnya diketahui bahwa diabetes

berhubungan dengan pengaktifan sistem eNOS-NO, yang kita ketahui sebagai regulator

penting padapenghambatan VEGF. Pada saat yang sama, ditemukan juga proteinuria pada

hewan coba diabetes yang diberikan VEGFR-2 inhibitor contohnya vandetanib. Hasil

tersebut menggaris bawahi peran penting dari eNOS-System dalam meregulasi efek dari

VEGF/VEGFR-2 pada glomerulus dan efek yang mungkin tersembunyi yang mungkin bisa

muncul pada fenotip ginjal tertentu.

Meskipun hipertensi dan proteinuria dapat muncul secara bersamaan pada pasien

yang diberikan anti-VEGF, hubungan antara kedua efek samping tersebut belum sepenuhnya

dapat dijelaskan. Hal tersebut terlihat dari penelitian dengan pemberian vandetanib dosis

rendah (15 mg/Kg), peningkatan protein urin terjadi secara terpisah dengan perubahan

tekanan darah. Pada penelitian ini, mengkonfirmasi bahwa kerusakan ginjal yang

berhubungan dengan blokade dari VEGFR-2 bukan akibat dari hipertensi yang terkait.

Peningkatan eksresi protein urin meningkat secara signifikan pada tikus non diabetes yang

diberikan vandetanib selama 10 hari, namun tekanan darahnya tidak ikut serta meningkat.

Lebih jauh lagi, penghentian blokade pada VEGFR-2 tidak emnghasilkan perbaikan

permselektifitas glomerulus. Pengigkatan tekanan darah pada hewan coba tersebut, selain

karena disebabkan oleh penghentian pemberian vandetanib, dapat diakibatkan oleh adanya

paparan yang terus menerus terhadap blokade VEGFR-2 yang dapat menimbulkan disfungsi

ginjal dan proteinuria, sebagaimana ditemukan juga pada beberapa pasien CKD yang

mendapat terapi antibodi.

Sumber utama VEGF pada ginjal adalah podosit, dimana Growth Factor berbanding

terbalik dengan laju urin dan memediasi munculnya efek primer dengan berikatan pada

VEGFR-2 pada permukaan sel endotel glomerulus. Penelitian yang dilakukan Eremina et al

pada 2003 menunjukkan peran penting VEFG dalam pembentukan dan perkembangan

glomerulus. Sselain peran utamanya dalam membentuk pembuluh darah, VEGF juga

diketahui sebagai salah satu mediator dengan permeabilitas yang tinggi, 50.000 lebih poten

dibandingkan histamine dalam molaritasnya. Berdasarkan perannya dalam pertumbuhan sel,

de Vriese dan kawan kawan menyusun sebuah hipotesis bahwa penghambatan VEGF dapat

mencegah munculnya disfungsi renal lebih awal dan menunjukkan efek albuminuria dari

blokade VEGF pada diabetes. Saat ini diketahui bahwa kuantitas dan tipe isoform dari VEGF

sendiri secara dramatis memperngaruhi permeabilitas dari glomerulus. Pengaruh sistem

eNOS-NO pada respon VEFG juga sepertinya menunjukkan efek yang sama.

Salah satu gejala yang muncul dalam nefropati diabetes adalah pengaktifan eNOS-

NO system. Peran eNOS pada patogenesis penyakit ginjal sangat rumit. Pada satu sisi, tidak

adanya eNOS yang berikatan dengan substrat tertentu dapat menyebabkan stress oksidatif

pada diabetes, disisi lain pada tikus yang dimodifikasi dengan delesi pada gen eNOSnya,

dapat menyebabkan albuminuria masif. Pada hewan coba penelitian ini,paneliti mengamati

bahwa aktivitas ENOS meningkat pada keadaan yang diabetes. Penignkatan aktivasi ENOS

kemungkinan juga berhubungan dengan proteinuria yang terjadi akibat dari blokade VEGFR-

2, yang terlihat pada tikus diabetes yang diberi vandetanib mengeksresikan protein urin yang

lebih rendah dibanding tikus lainnya. Adanya efek yang berbeda pada penghambatan

VEGFR-2 mungkin dapat menjelaskan adanya interaksi antara VEGF dan sistem eNOS yang

memainkan peranan penting dalam beberapa tingkatan filtrasi barrier.

KESIMPULAN

Dalam penelitian ini peneliti menemukan bahwa ekspresi eNOS yang diinduksi oleh

keadaan diabetes pada tikus, memodulasi respon terhadapt blokade VEGF. Perlu dilakukan

penelitianlebih lanjut apakah hal ini juga terjadi pada manusi yang mendapatkan terapi yang

sama dengan perlakuan pada tikus coba.