BAB I

PENDAHULUAN

Identifikasi proteomic berbasis biomarker untuk janin yang

abnormal pada plasma ibu, cairan amnion dan cairan reproduktif

membuat progress yang signifikan pada 5 tahun terakhir ini. Teknik

ini sangat sensitive dan membutuhkan jumlah kecil cairan tubuh,

hal ini diharapkan akan membuka jalan untuk perkembangan

noninfasif yang efektif.

Selama ini sejumlah dari cairan tubuh, seperti serum ibu dan

plasma, cairan amnion, cairan serviks, cairan vagina, urin, saliva

atau material fetus seperti trofoblast plasenta, membrane fetus

atau tali pusat, telah digunakan dengan sukses dalam upaya untuk

mengembangkan marker untuk sejumlah kehamilan yang patologis.

Dalam pembahasan saat ini, akan difokuskan pada munculnya

proteomic sebagai platform teknologi utama dalam mempelajari

berbagai jenis kondisi janin dan mengembangkan marker untuk

gangguan yang berhubungan dengan kehamilan, seperti aneuploidy

fetus, kelahiran premature, pre-eklampsia, infeksi intra-amnion dan

fetal stress.

Kesenjangan ekonomi antara negara maju dan berkembang

semakin cepat. Lebih dari setengah populasi dunia berada pada

Negara berkembang, dan mayoritas kelahiran berada pada Negara

berkembang. Namun dengan perkembangan yang pesat membuat

suatu perubahan set demografi : ibu bekerja, keluarga kecil dan

kehamilan selanjutnya. Jadi sekarang, lebih dari sebelumnya,

diagnosis prenatal menjadi isu penting bagi keluarga di seluruh

dunia.

1

Pada saat yang sama, “omics” era menawarkan pilihan

teknologi baru untuk penemuan biomarker dan diagnostic klinis.

Apakah teknologi ini memungkinkan identifikasi tunggal/panel dari

diagnostic markers yang digunakan pada mereka sendiri, atau

menjadi bagian dari keseluruhan strategi untuk meningkatkan

akurasi dan mengurangi false-positive yang masih perlu dilihat.1

Misalnyam dalama deteksi antenatal pada Down’s syndrome (DS),

ada kemungkinan bahwa strategi –omics dapat membantu

meningkatkan deteksi yang melampaui 95% dan yang lebih penting

untuk mengurangi false positive dibawah 1%. Kita percaya bahwa

umumnya akan terjadi, kecuali beberapa gangguan gen tunggal.

The Human Genome Project dirampungkan pada tahun 2003,

dan dampak dari obat genomic pada diagnostic prenatal kini

menjadi jelas. Dalam konteks ini menarik untuk melihat

penggabungan teknologi baru dan strategi genom untuk mengatasi

kondisi genetic janin yang penting, DS (trisomy 21). 2,3,4

Pada pembahasan ini, mengeeksplorasi strategi proteomic

baru yang telah digunakan untuk mempelakari kondisi janin dan

focus dalam strategi proteomic yang telah digunakan dengan

sukses hingga saat ini.

2

BAB II

PEMBAHASAN

A. Clinical Proteomics & Fetal Diagnosis

Istilah Proteomik diciptakan oleh Marc Wilkins pada tahun

1984, dimana menunjukkan skala besar dari keseluruhan

komplemen protein dari cairan tubuh, jenis sel, jaringan atau

seluruh organisme.5 Tujuan dari Clinical Proteomics adalah untuk

mengidentifikasi biomarker untuk diagnosis dan terapi intervensi

untuk berbagai kondisi penyakit dengan membandingkan profil

proteomic atau entitas individu (protein atau peptida)

pengendalian penyakit dan kondisi. Platform proteomic yang

berbeda telah sukses dalam penilaian sampel klinis dalam

kedokteran feto-maternal.6,7 Meskipun 2D Gel Electrophoresis

(2DE) tetap menjadi penting untuk identifikasi protein, sekarang

sedang bertambah dengan analisis Mass Spectrometry (MS)

sebagai sarana untuk mengkarakterisasi mileus kompleks yang

diteliti.8,9

Dapat diterima bahwa untuk mendiagnosis prenatal adalah

dengan deteksi penanda pada darah ibu sehingga dapat

3

memprediksi terjadinya kelainan pada janin. Bentuk diagnoiss

prenatal noninvasive menawarkan kesempatan untuk benar-

benar menghilangkan resiko yang berhubungan dengan

prosedur, seperti amniosentesis dan chorionic villus sampling.10

Pada konteks ini, pendekatan untuk mendeteksi produk gen

janin dalam sirkulasi ibu mungkin menawarkan peluang baru

intuk mengidentifikasi protein yang dapat menjadi kunci

penanda diagnosis untuk penyakit tersebut. Misalnya, penanda

proteomic tersebut mungkin menggantikan penanda skring saat

ini untuk skring kehamilan pada resiko bearing an aneuploidy

fetus.10,11

Kemajuan teknologi telah menyebabkan peningkatan yang

pesat dalam aplikasi untuk berbagai sampel, dari percobaan

awal yang menggunakan jalur sel pada jaringan yang lebih

kompleks dan cairan biologis kini sedang dikaji untuk

menetapkan perubahan dalam ekspresi protein. Sejumlah cairan

tubuh dan jaringan, speerti serum & plasma ibu, cairan amnion,

cairan serviks-vagina, urin, saliva, trofoblas, plasenta, ketuban,

tali pusat dan cairan folikular telah diperiksa hingga saat ini. 12,13,14

B. Conventional Biochemical Markers

I. Chromosomal Aneuploidy & Protein Markers

Metode diagnostic konvensional prenatal untuk

diagnosis aneuploidy janin bergantung pada perolehan

materi dengan prosedur invasive, seperti amniosentesis

atau chorion villus sampling, atau dalam kasus yang

jarang terjadi, pengambilan sampel darah janin yang

berkaitan dengan resiko 1% dari kematian janin. Untuk

meminimalkan paparan tindakan invasive ini, wanita hamil

dikelompokkan berdasarkan skring menggunakan

kombinasi ultrasonografi dan serum penanda

4

biochemical.15 Namun, metode skrining ini umumnya

menargetkan epiphenomenas, seperti nuchal

translucency, yang mana berhubungan dengan anomaly

kromosom. Praktek ini memungkinkan tingkat deteksi

lebih dari 90% untuk Down Syndrome (DS), Edward

Syndrome (trisomy 18) dan Patau syndrome (trisomy 13).16

II. Human ∝ - fetoprotein

Human ∝ - fetoprotein (AFP) merupakan tumor marker

yang berhubungan dengan glikoprotein fetus yang terlibat

baik pertumbuhan ontogenik atau onkogenk.17 Protein ini

pertama kali dijelaskan pada tahun 1972 dimana tingkat

AFP meningkat pada cairan ketuban yang ditemukan

terkait dengan defek pada neural tube.18 Saat ini, literature

biomedical telah mengumpulkan mengenai penggunaan

AFP manusia selama kehamilan sebagai biomarker dalam

serum ibu dan cairan ketuban. Studi tersebut telah

membahas pengukuran kadar serum AFP diluar nilai

normal dalam serum ibu hamil; nilai-nilai tersebut adalah

indikasi dari hambatan pertumbuhan dalam kandungan

dari janin yang sedang berkembang.

III. Inhibins as Diagnostic Markers in Human

Reproduction

Inhibin A merupakan penambahan terbaru untuk

skrining serum trimester kedua, ini merupakan hormone

subunit α−β asal plasenta, dan diukur dengan

menggunakan monoclonal two-site ELISA divalidasi untuk

digunakan dalam skrining prenatal. Inhibin A merupakan

penanda dari folikel dominan dan aktivitas korpus luteum,

dan menurun pada polycystic ovary syndrome.19 Inhibin A

juga ditemukan dapat meningkat pada penyakit

gestasional, seperti pre-eklampsia dan fetal DS, &

5

ditemukan menurun pada wanita dengan fungsi ovarium

menurun dan berkorelasi dengan respons perempuan

terhadap induksi ovulasi.

IV. Triple Test & Quadruple Test

Sejumlah penanda serum selama trimester kedua telah

ditemukan terkait dengan Down Syndrome. Penanda

utama adalah AFP, hCG atau subunit individual (free α -

and free β-hCG), unconjugated estriol (uE)3 dan inhibin A.

modalitas skrining akan tergantung pada pilihan penanda,

serta apakah USG digunakan atau tidak untuk

memperkirakan usia kehamilan. Dengan USG, diperkirakan

tingkat deteksi usia kehamilan untuk tingkat false-positive

5% diperkiran 59% menggunakan double test (AFP & hCG),

69% menggunakan triple test (AFP, hCG & uE3), dan 76%

menggunakan quadruple test (AFP, hCG, uE3, & Inhibin A),

semua dalam kombinasi dengan usia ibu.20

Kombinasi multiple marker dengan Positive Predictive

Value (PPV) yang tinggi saat ini tersedia untuk DS adalah

AFP, uE3, hCG dn inhibin A, bersama dengan umur ibu

(quadruple marker test). Dengan kombinasi ini, tingkat

deteksi 80% dengan tingkat false-positive 5% telah

dilaporkan. ADAM 12 (A Disintegrin and Metalloprotease

12) dapat merupakan tambahan yang berguna pada

skrining awal Edward Syndrome disamping anomaly

kromosom lain, khususnya jika skrining biochemical dapat

terjadi sebelum 10 minggu. Level Placental Protein (PAPP)

ditemukan menurun pada Patau Syndrome pada

kehamilan trimester kedua. Etiologi penurunan kadar PAPP

pada Edward syndrome dapat sama pada kasus Edward

syndrome, namun berbeda dari kasus DS sejak pola

temporal pada Patau syndrome dan Edward syndrome

berbeda dengan DS. PAPP-A dan free β-hCG telah

6

digabungkan dengan nuchal translucency pada skrining

trimester pertama.21,22

C. Biomarkers for Fetal Diagnostics Based on

Proteomics Platforms

Bagian berikutnya menjelaskan penelitian terbaru yang

berhubungan dengan intervensi proteomic pada berbagai

kondisi penyakit yang berhubungan dengan perkembangan dari

janin. Beberapa kondisi penyakit yang sering muncul

berhubungan dengan perkembangan janin, maupun

berhubungan dengan komplikasi pada system maternal, dan

strategi proteomic yang digunakan untuk mengidentifikasi

biomarker.

Tabel 1 : Summary of Different Studies Representing

Different Body Fluids Used for Biomarker Discovery for

Fetal Diagnostics and the Different Techniques Used to

Identify These Biomarkers

Disease Techniqu

e used

Protein Markers Re

f.

Biomarkers from maternal blood

Down

Syndrome

2D-GE,

MALDI-

TOF-MS

Western

Blot

TTHY, CERU, AFAM, AMBP, APO-E,

SAM), HRG & A1AT were

upregulated and CLUS was

downregulated

10

Down

Syndrome

2D-DIGE

2D-CF,

MudPIT;

LC/LC-

MS/MS

MALDI-

A2AP, ANT3, A2MG & ITIH4, 35 A1AG

& SAA complement system protein

B, C, & H Serum carrier protein

group, afamin & vitamin D Binding

protein are carries for the fat-soluble

vitamin E & D, Ceruloplasmin, TTHY

15

7

TOF-MS

peptide

profiling

Preeclampsi

a

MALDI-

TOF-MS

CLUS 84

Biomarkers from amniotic fluid

Histologic

chorioamnio

nitis

SELDI-

TOF-MS

Defensins 2 & 1, calgranulins C & A 52

Down

Syndrome

MALDI-MS

& nano-

ESI-MS/M

S

SFRS4; Q08170 only in DS fetuses

AF Quantitative differences were

detected for AMBP; P02760, CO1A1;

P02452, CO3A1, P02461, CO5A1;

P20908, and basement membrane-

specific heparin sulfate PGBM;

P98160 Four proteins, CO1A1,

CO3A1, CO5A1 & PGBM, appeared

as fragments

17

Intraamnioti

c

inflammatio

n

SELDI-

TOF-MS

17 protein were significantly

overexpressed 5 of them were

identified as human neutrophil

protein 1-3, calgranulin A & B

51

Neonatal

sepsis

SELDI-

TOF-MS

Neutrophil defensins 1 & 2 and

calgranulins A & C

85

Fetal alcohol

syndrome in

C57BL/6

LC-MS/MS

& MudPIT

AFP 56

Rh-

incompatibili

tty

2DE &

MALDI-

TOF-MS

Albumin, serotransferrin,

haptoglobin, AFP & Immunoglobulin

58

Preeclampsi

a

SELDI-

TOF-MS

Pro-Apo-A-I & a fuctionally obsecure

peptide, SBBI42

47

Preeclampsi 2DE & Oxidized TTHY 49

8

a MALDI-

TOF-MS

Biomarkers from placental tissues

Gestational

disease

Placental peptides for intrauterine

growth retardation, preterm labor,

preeclampsia, chromosomal

disorders, gestational diabetes &

trophoblastic disease

86

Biomarkers from trophoblasts

Preeclampsi

a

2D-PAGE

& MALDI-

TOF-MS

Disulfide isomerase precursor,

endoplasmic reticulum resident

protein, dihydrolipoyl

dehydrogenase & TIM21-like protein

87

Biomarkers from human cervical-vaginal fluid

Spontaneou

s preterm

birth

LC/LC-

MS/MS;

MudPIT,

2D-DIGE

Calgranulins, annexins, S100

calcium-binding protein A7 &

epidermal fatty acid-binding protein

were abundant in CVF and

differentially expressed as were the

serum proteins A1AT, A1AG,

haptoglobinm serotransferrin, and

vitamin D-binding protein

54

Intra-

amniotic

inflammatio

n

SELDI-

TOF-MS

17 proteins were significantly

overexpressed Five of them were

identified as human neutrophil

protein 1-3, calgranulin A & B

51

Biomarkers from saliva

Preterm

premature

rupture

Luminex

technolog

ies

Luminex technologiesSalivary matrix

metalloproteinase 9

24,

83

Biomarkers from human follicular fluid

HFF

proteome

MALDI- A large number of acute-phase

proteins, including transferrin, CERU,

88

9

from normo-

ovulatory

women

TOF-MS afamin, hemopexin, haptoglobin and

plasma amyloid protein, were

identified in HFF in relatively high

concentration supporting the

hypothesis that mammalian

ovulation can be compared with an

inflammatory event Antioxidant

enzymes such as catalase,

superoxide dismutase, glutathione

transferase, paraoxonase, heat-

shock protein 27 and protein

disulfide isomerase were detected

Authors claim that this might be an

indication that during maturation

the human follicle is well protected

against toxic injury due to oxidative

stress

Cervicovagi

nal fluid &

parturition

2D-GE Blood transport proteins (albumin &

transthyretin); structural protein (β-

actin); proteins involved in fatty acid

metabolism (fatty acid-binding

protein and acetyl-DoA-binding

protein); a calcium-binding protein

(annexin III); an anti-inflammatory

cytokine (IL-1 receptor antagonist);

proteinase inhibitors (A1AT,

monocyte/neutrophil elastase

inhibitor, squamous cell carcinoma

antigen-1 and cystatin A); and

enzymes involved in oxidative stress

defence (thioredoxin, peroxiredoxin

2, glutathione S-transferase P and

copper, zinc superoxide dismutase)

89

10

Specific

peptide

patterns of

follicular

fluids at

different

growth

stages

MALDI-

TOF-MS

Apo-A-I, collagen type IV, integrin 90

Recurrent

spontaneous

abortion

MALDI-

TOF-MS,

nano-LC

MS/MS

and

Western

blot

analysis

30

2DE = 2D gel electrophoresis; A1AG = α-1-acid-glycoprotein;

A1AT = α-1-antitrypsin; A2AP= α-2-antiplasmin precursor; A2MG

– α-2-macroglobulin precursor; AF = Amniotic Fluid; AFAM =

Afamanin; AFP = α-fetoprotein; AMBP – α-1-microglobulin; ANT3

= Antithrombin-3; APO-E = Apolipoprotein E; CERU =

Ceruplasmin; CLUS = Clusterin; CO1a1 = Collagen-α1 (I) chain;

CO3A1 = Collagen-α1 (III) chain; CO5A1 = Collagen-α1 (V) chain

d; CVF = Cervicovaginal fluid; DS = Down Syndrome; HFF =

Human Follicular Fluid; HRG = Histidine-rich Glycoprotein; ITIH4

= Inter-R Trypsin Inhibitor H4; LC = Liquid Chromatography; MS

= Mass Spectrometry; PAGE = Polycrylamide gel

electrophoresis; SAA = Serum Amyloid A; SAMP = Serum

Amyloid P-component; SFRS4 = Splicing Factor Arginine/Serine-

Rich 4; TTHY = Transthyretin.

Amniotic Fluid

11

Amniotic fluid merupakan lapisan aqueous atau cairan

disektirar janin dan berkontribusi secara signifikan pada

kesehatan janin. Cairan amnion melindungi janin dari cedera,

membantu dalam hal mobilitas dan stabilisasi temperature.

Produk janin, seperti sel janin, lanugo, urin dan fosfolipid berasal

dari paru-paru, dan tersimpan pada cairan amnion. Komposisi

cairan berubah seiring umur gestasi. Sejak cairan amnion

berhubungan dengan material janin, terdapat beberapa

perubahan dalam volume dan komposisi cairan ketuban

mungkin merupakan indikasi dari metabolisme atau status

perkembangan janin pada titik waktu tertentu dalam

kehamilannya. Oleh karena itu, abnormalitas pada

perkembangan janin menjadi reflek dalam cairan amnion pada

pembentukan nucleic acid (DNA & RNA), metabolit, peptide,

protein, enzim, lipid , sel-sel dan lainnya.23,24

Monitoring Gestational-dependent Changes in the

Developing Fetus

Plasenta manusia dihasilkan dalam jarak peptida yang lebar

dan protein selama masa kehamilan. Protein dan peptide dari

plasenta berhubungan dengan terjadinya penyakit gestasional,

seperti Intrauterine Growth Retardation, preterm labor, pre-

eklampsia, penyakit kromosom, diabetes gestasional dam

penyakit trofoblastik.25 Dalam studi terbaru, cairan ketuban

manusia telah mengalami analisis proteomic komprehensif

untuk mempelajari perubahan usia tergantung kehamilan.

Peneliti menggunakan teknik molecular, seperti gel-based 2D-

liquid chromatography (LC)-MS/MS & 2D-DIGE pada cairan

amnion, serum dan caira serviko-vagianal dalam penenlitian

gestational-dependent changes. Hasilnya berdasarkan pada

teknik 2D-DIGE yang diperliharkan pada trimester I, II dan III

sampel cairan amnion, perbedaan yang maksimal pada protein

12

cairan amnion terjadi antara trimester I & II. Penelitian

mengusulkan bahwa analisis sistemik protein baik dalam cairan

ketuban dan serum ibu dapat menyebabkan pengembangan

prosedur diagnostik baru yang noninvasive untuk memonitor

status janin. Plasenta telah digambarkan sebagai “buku harian

kehidupan intrauterine” & memiliki potensi untuk mencerminkan

banyak aspek ini pada proses ini.26

Markers for Preeclampsia

Pre-eklampsia merupakan penyebab utama dari morbiditas

dan mortalitas janin dan ibu.27 Penyakit ini masih belum

diketahui etiologinya, dan dikarakteristik oleh peningkatan

patologis tekanan darah yang tiba-tiba dari seorang ibu, dimana

jika tidak dikoreksi, dapat menjadi eklampsia dan kematian.28

Walaupun kebanyakan kasus pre-eklampsia terjadi saat

mendekati kelahiran, namun hal yang paling berbahaya yaitu

saat terjadi pada akhir trimester kedua/awal trimester ketiga

dan berhubungan dengan severe fetal growth retardation. Pre-

eklampsia hanya dapat diselesaikan dengan kelahiran dari bayi

& plasenta, ini menghasilkan kelahiran bayi yang premature.

Pre-eklampsia juga meningkatkan resiko penyakit kardiovaskular

kepada bayi yang bersangkuran kedepannya. Penelitian

membuktikan bahwa hubungan antaran abnormalitas uuterine

artery Doppler flow velocimetry, resiko pre-eklampsia dan indeks

dari struktur arteri dan fungsinya. Wanita dengan hasil uterine

artery Doppler yang abnormal dapat tidak hanya meningkatkan

resiko pre-eklampsia namun juga penyakit kardiovaskular

kedepannya.29

Salah satu penelitian terbaru telah mengidentifikasi level

sirkulator dari factor angiogenik, seperti VEGF,

pgosphatidylnositol glycan anchor biosynthesis, class F (PIGF)

dan bentuk soluble dari mutual reseptor Flt1, serta plasenta

soluble endoglin (sENG), berubah pada kehamilan dimana

13

terbentuknya pre-eklampsia. Temuan ini menunjukkan bahwa

molekul-molekul ini dapat berfungsi sebagai penanda skring

untuk mendeteksi pada kehamilan beresiko. Karena perubahan

dalam factor-faktor angiogenik hanya terjadi relative terlambat

pada kehamilan, pencarian terus untuk penanda yang

perilakunya diubah sebelumnya selama kehamilan pada

kehamilan tersebut. Alasannya karena bahwa deteksi dini dapat

membantu dalam pengembangan strategi terapi atau

pencegahan yang efektif. Factor seperi placental protein 13 (pp-

13), dimana perubahan terjadi pada trimester pertama

kehamilan pada mereka yang kemudian menjadi preeclampsia.30

Intra-amniotic inflammation

Infeksi intrauteri merupakan hasil dari inflamasi dari intra-

amniotic dan telah sering muncul dan merupakan penyebab

penting dari kelahiran premature yang dapat mempengaruhi

perkembangan janin yang normal. Sepertiga dari semua

kelahiran premature terjadi ketika ibu dengan invasi mikroba

dari rongga amnion dan sering mengakibatkan infeksi dari janin

dengan perkembangan fetal inflammatory response syndrome,

factor resiko untuk onset kerja yang akan datamg, komplikasi

jangka pendek pada neonatal dan kecacatan jangka panjang,

seperti cerebral palsy dan penyakit paru-paru kronik. Analisis

proteomic dari cairan servikal dan cairan amnion pada wanita

dengan inflamasi intra-amniotic menghasilkan identifikasi dari

17 protein secara signifikan diekspresikan itu apakah dalam

cairan ketuban dari kasus intra amniotic inflammation dan

terjadi lebih sering pada wanita dengan persalinan premature

dibandingkan mereka yang dengan pecah ketuban. Ke-limanya

telah diidentifikasi sebgai human neutrophil proteins 1-3,

calgranulin A & B. upaya khusus juga dibuat untuk mempelajari

penyakit sperti histologic chorioamnionitis dengan

menggunakan proteomic platform. Empat proteomic biomarker

14

cairan amnion dikarakteristik oleh inflamasi (defensins 2 & 1,

calgranulins C & A). proteomic fingerprint (Mass Restricted [MR]

score) dihasilkan dari cairan amnion menggunakan SELDI-TOF-

MS. MR score telah dibuat menggunakan 4 biomarker untuk

mempelajari keparahan dari inflasi intra-amniotic. Dari keempat

biomarker, Calgranulin C menunjukkan hubungan yang kuat

dengan kehadiran stage III Chorioamnionitis, independent of

race, amniocentesis-to delivert interval & gestational age.

Pendekatan yang sama juga digunakan untuk mendeteksi

penyakit seperti occult candida chorioamnionitis.31,32,33

Spontaneous Preterm Birth & Premature Rupture of the

Membranes

Evaluasi mengenai protein sebagai biomarker cervical-vaginal

fluid untuk diagnosis noninvasive dari penyakit yang

berhubungan dengan kehamilan, seperti Spontaneous Preterm

Birth (SPTB) & Premature Rupture of the Membranes (PROM),

telah dilaporkan baru-baru ini. Penelitian terbaru

menginvestigasi SPTB mengidentifikasi 205 protein pada

cervical-vaginal fluid, 28 dari yang diperlihatkan memiliki

perbedaan yang signifikan dalam perbandingan berpasangan

dan progresif.34

PROM merupakan komplikasi lain yang dapat mengakibatkan

morbiditas pada janin.35 2DE telah digunakan untuk membentuk

profil protein dari plasma yang mengandung protein cairan

amnion untuk PROM. Dengan menggunakan pendekatan high-

throughout untuk PROM biomarker discovery, Michel et al.

mempelajari baik plasma ibu dan sampel cairan ketuban dari

pasien yang sama dimasa kehamilan dan itu digunakan untuk

mencari protein cairan ketuban tertentu sebagai penanda

PROM.13

Detection of Chromosomal Abnormalities

15

Karena kromosom aneuploidy adalah salah satu kondisi yang

paling umum yang terkait dengan janin yang sedang

berkembang, tidak mengherankan bahwa itu adalah subjek dari

beberapa laporan menggunakan genomic canggih dan teknik

proteomic. Dalam konteks ini, pembangunan saat ini sebagian

besar focus pada penerapan berbagai platform teknologi untuk

mengidentifikasi biomarker yang bersangkutan dalam cairan

tubuh. Ini termasuk cairan ketuban, yang merupakan sumber

potensial yang kaya biomarker untuk diagnosis gangguan ibu

dan janin selama kehamilan.

Cairan ketuban memeiliki potensi besar untuk mendeteksi

beberapa tanda-tanda penyakit tertentu pada janin, dengan

potensi untuk melaksanakan diagnosis prenatal. Ketersediaan

normal Amniotic Fluid Supernatant (AFS), peta proteome adalah

alat yang berharga untuk mempelajari ekspresi protein abberant

dalam kehamilan yang terkena dampak dan berfungsi sebagai

alat penting dalam mencari penanda yang baru.

Sebagai protein, ia membentuk sejumlah jenis sel yang

berbeda, hal ini menunjukkan bahwa populasi sel cairan ketuban

dapat heterogen, yang berasal dari kompartemen janin yang

berbeda, dimana masih mengandung sel multipoten. Kehadiran

protein ini dapat berfungsi sebagai penanda untuk diagnosis

janin tetapi juga dapat membantu dengan identifikasi sel dengan

karakteristik sel induk. Dalam studi berikutnya, kelompok ini

melaporkan proteome cairan ketuban manusia yang normal.36

Pentingnya studi ini terletak pada kenyataan bahwa sampel

cairan ketuban digunakan secar arutin untuk diagnosis prenatal

dari berbagai kelainan janin.

Kondisi aneuploidy lain yang dianalisis adalah Turner

Syndrome, yang terjadi pada satu dari 2500 kelahiran

perempuan, dan disebabkan oleh lengkap atau parsial dari satu

kromosom X. Dalam analisis cairan ketuban dari 5 kehamilan

trimester kedua dengan janin Turnet Syndrome dan 5 janin

16

sebabgai control dengan 2DE, MALDI-TOF-MS dan Western

Blotting, peningkatan tingkat serotransferin, lumican, plasma

retinol-binding protein dan Apolipoprotein (APO) A-I terdektsi

pada kasus Turner Syndrome, sedangkan tingkat kininogen,

protrombin dan API A-IV mengalami penurunan.37

Masih belum jelas apakah protein cairan ketuban melintasi

placenta barrier untuk memasuko sirkulasi ibu. Premis ini harus

benar, ada kemungkinan bahwa pola diferensial diamati pada

protein ini dalam cairan ketuban dapat membantu dengan

pengembangan pendekatan skrining serupa dengan

menggunakan plasma atau serum ibu.

Pada pembahasan sebelumnya, tujuan sebenarnya adalah

pembentukan strategi noninvasive untuk mendeteksi fetus yang

abnormal, seperti dengan mendeteksi penanda protein pada

plasma atau serum ibu. Sebuah studi penting yang dilakukan

baru-baru ini oleh Nagal et.al. yang mengidentifikasi serum

biomarker yang potensial untuk mendeteksi DS.12 Studi tersebut

dilakukan pada trimester pertama dan kedua sampel serum ibu

dari kehamilan dengan janin Down Sydnrome dan umur

kehamilan yang sehat sebagai control.

Sebagian besar protein yang diidentifikasi milik glikoprotein

yang mungkin berhubungan dengan diferensiasi selular dan

pertumbuhan janin. Analisis profil peptide MALDI-TOF-MS dengan

perangkat lunak pengenalan pola menyebabkan diskriminasi DS

yang jelas dan control pad atriemster kedua, dengan tingkat

deteksi rata-rata hamper 96%. Di lain laporan terbaru

menggunakan 2DE dan MALDI-TOF-MS pada plasma ibu dari

janin dengna DS dan control yang cocok, Sembilan protein

diferensial dinyatakan terdeteksi dalam kasus DS.7

Kesimpulannya, protein diferensial diatas dinyatakan memiliki

potensi untuk dikembangkan sebagai biomarker untuk DS,

memberikan kesempatan untuk pengembangan skrining non-

invasif dan strategi diagnosis yang baru.

17

D. Proteomics Techniques Used for Fetal

Diagnostics & Screening

Kemajuan besar terkait dengan proteomic klinis pada tahun-

tahun terakhir ini berdasarkan pada platform MS.7 Profil protein

menggunakan teknik SELDI-TOF-MS maupun MALDI-TOF-MS,

ditambah dengan algoritma baru untuk beberapa identifikasi

protein dan klasifikasi & parameter klinis (misalnya; skor MR)

yang ditunjukkan untuk mendiagnosa kondisi penyakit.

Pendekatan multidimensional menggunakan 2DE- berbasis

pendekatan dan teknik DIGE, serta pendekatan proteomic yang

telah menghasilkan ratusan calon penanda diagnosia janin

dalam beberapa tahun terakhir. Pada bagian ini akan difokuskan

pada teknik utama yang digunakan dalam diagnose

janin/skrining. Aplikasi ini tinggi diseluruh metodologi yang yang

telah memberi kontribusi terhadap pemahaman tentang

patofisiologi yang mendasari dan identifikasi yang berhasil dari

biomarker protein yang relevan yang berpotensi dapat

mengubah diagnosis awal kondisi janin abnormal.

Multidimensional Proteomics Approaches for Fetal

Diagnostics & Screening

Pembahasan bagian ini focus pada spectrum teknik yang

banyak kelompok gunakan, serta sifat biomarker diidentifikasi

dalam proses untuk berbagai kondisi janin. Fokus sekarang pada

teknologi proteomic yaitu mengikuti teknik MS seperti

fluorescence 2D-DIGE, Cleavable Isotope-coded Afiinity Tags

(cICAT) & Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification

(iTRAQ), menggunakan 2D gel- atau LC-MALDI TOF/TOF. Studi

banding dari tiga metode kuantitatif sering digunakan dalam

proteomic, 2D-DIGE, cICAT & iTRAQ, dapat membedakan

sebagian besar protein deferensial diatur dalam control dan

kondisi sehat.38

18

iTRAQ adalah teknik baru yang secara bertahap mulai

berkembang popularitasnya. Akan dibahas lebih lanjut

perbedaan teknik yang digunakan pada spectrum luas dari

penyakit yang berhubungan dengan perkembangan janin,

pathogenesis dan kondisi abnormal yang berhubungan dengan

pembentukan janin.

Identifikasi secara kuantitas dari skrining biomarker untuk

Down syndrome-kehamilan menggunakan plasma dengan four-

plex metode iTRAQ. Reagen iTRAQ 114 dan 116 digunakan

untuk pelabelan yang dikumpulkan dan digandakan sampel

control (n=6) dan 115, 117 label digunakan untuk pelabelan

yang dikumpulkan dan digandakan sebagai sampel Down

Syndrome (n=6).

Dari beberapa laporan yang muncul untuk memanfaatkan

pendekatan multidimensional serupa pada plasma dan serum

ibu, beberapa telah difokuskan pada identifikasi penanda untuk

kromosom aneuploidy dari pembentukan fetus. Sebuah laporan

oleh Nagalla et al. digunakan multiple, pendekatan proteomic

dilengkapi, termasuk 2D-DIGE, 2D-LC-CF, MudPIT; LC/LC-MS/MS

dan MALDI-TOF-MS profil peptide. Secara total, 28 dan 26

protein yang berbeda-beda mucul dalam sampel trimester

pertama dan kedua, masing-masing. Dari jumlah tersebut, 19

protein khusus untuk trimester pertama dan 16 untuk trimester

kedua, dan kemudian yang berbeda-beda muncul pada kedua

trimester. Sebagian besar biomarker diidentifikasi adalah serum

glikoprotein yang mungkin memainkan peran dalam diferensiasi

selular dan pertumbuhan janin.

Teknik 2D-DIGE juga digunakan untuk studi dari sampel cairan

ketuban.39 Studi ini membandingkan cairan ketuban pada

keadaan normal dan patologis. Pendekatan ini digunakan untuk

mempelajari electrophoregrams cairan ketuban yang normal

dari kehamilan 17 minggu dan aterm, serta cairan ketuban dari

janin yang mengalami hernia diafragma kongenital.

19

Premature Rupture of the Membranes (PROM) juga dipelajari

dengan menggunakan 2DE untuk menghasilkan profil protein

plasma yang mengandung protein cairan ketuban untuk PROM.

Baru-baru ini, dilaporkan oleh Michel et al. untuk studi PROM

menggunakan plasma ibu dan sampel cairan amniotic dari

pasien yang sama dimasa kehamilan untuk menemukan protein

cairan ketuban tertentu sebagai penanda PROM.13 Plasma ibu

dan cairan ketuban yang sesuai yang immunodepleted dalam

hal untuk menghapus 6 protein yang paling berlimpah sebelum

analisis sistemik komposisi protein mereka.

Protein in Profiling Using MALDI-TOF-MS

Wang et al. menggambarkan analisis dua langkah proteomic

dari AFS dengan model C18, diikuti oleh lemahnya modek

kation.40 Penelitian ini bisa mendeteksi AFS aneuploidy pada

tingkat prevalensi penyakit 3.3% dengan sensitivitas 100%

spesifisitas 72-96%, 11-50% PPV dan nilai prediktif negative

100%. Proteomic profil yang dihasilkan oleh MALDI-TOF-MS

setelah fraksionasi sampel dengan manik-manik magnetic

difungsikan untuk membedakan 60 kariotipe yang normal dari

20 AFS aneuploidy. Pendekata fingerprinting proteomic

menggunakan MS ditambah dengan metode klasifikasi statistic

digunakan menggunakan MS ditambah dengan metode

klasifikasi statistic digunakan untuk memperbaiki diagnosis dari

aneuploidy, termasuk trisomy 13,18 dan 21, dama sampel cairan

ketuban.41

SELDI-TOF-MS & Prenatal Diagnosis

Proteomic klinis adalah bidang baru yang akan memiliki

dampak yang besar pada diagnosis molecular, identifikasi

biomarker penyakit,pengobatan masyarakat dan uji klinis di era

postgenomic. Dalam beberapa tahun terakhir, SELDI-TOF-MS

telah berada di garis depan pilihan teknik utnuk hamper

20

disemua kondisi penyakit. Laportan pertama tentang

penggunaan teknologi SELDI pada proteomic klinis dilaporkan

untuk kanker ovarium oleh Petricoin’s group pada tahun 2002.42

Berikutnya, teknik ini digunakan untuk mendiagnosa kondisi

penyakit banyak, termasuk yang berhubungan dengan

perkembangan janin, seperti peradangan intrauterine, histologis

korioamnionitis dan kelahiran premature idiopatik.32,43

Meskipun teknik ini dikritik karena beberapa kekurangan, hal

ini tetap merupakan teknik favorit bagi banyak peneliti karena

ketahanan dan kemudahan untuk melakukan serta algoritma

yang mapan saat ini tersedia untuk memprediksi kondisi

penyakit. Bagian berikut ini menjelaskan penggunaan teknik ini

pada penelitian diagnostic janin.

Menggunakan teknik SELDI-TOF-MS dan skor MR, Buhimschi et

al. menggunakan algoritma baru untuk mengekstrak baik secara

klinis dan biomarker biologis yang relevan dari menjiplak SELDI

proteomic dalam sampel cairan ketuban.43 Penelitian ini

menghasilkan identifikasi pada pasien dengan radang intra-

amnion yang persalinannya premature, dari profil proteomik

cairan ketuban yang khas dari 3 atau 4 protein berikut :

neutrophil defensins-1 & -2, dan calgranulins A & C.

Biomarker Validation

Validasi biomarker merupakan area yang penting untuk

terjemahan keberhasilan penemuan protemik untuk praktek

klinis. Validasi melibatkan penggunaan kriteria ketat yang diikuti

untuk desain percobaan yang tepat, pengumpulan smapel dan

dalam jumlah yang memadai pasien. Saat menggunakan

platform berbasis MS, berisis MS dapat digunakan untuk

identifikasi protein sementara ditargetkan MS dapat difunakan

untuk tindak lanjut untuk memvalidasi calon kandidat biomarker,

lebih dari satu protein sering ditemukan untuk beberapa kondisi

21

penyakit dan ini hadir dalam tingkat yang berbeda dalam cairan

tubuh. Dengan menggunakan informasi diatas pada beberapa

biomarker untuk kondisi penyakit yang sama, pemodelan

jaringna serta analisis biologi system set data biologis dapat

dikembangkan untuk model matematis untuk memprediksi

penyakit, sementara literature ilmiah yang diterbitkan dapat

memberikan informasi tambahan dalam proses pemodelan.

Validasi skala besar dengan menggunakan uji klinis multicenter

akan memastikan sensitivitas dan spesifisitas yang diperlukan

untuk setiap penanda untuk memasuki pasar diagnosis prenatal.

E. Expert Commentary & Five-year View : Future

Directions for Poteomics in Fetal

Diagnostics/Screening

Heterogenitas dalam jangka panjang mungkin terbukti

menjadi penghalang utama bagi klinis proteomik. Ulasan saat ini

telah menunjukkan bahwa sejumlah besar protein yang

ditemukan untuk diubah selama gangguna yang berhubungan

dengan kehamilan mulai dari aneuploidy terhadap pre-eklampsia

berat dan persalinan premature. Di sebagian besar penyakit

yang diteliti menggunakan teknik multidimensional canggih,

beberapa protein penanda ditemukan tumpang tindih untuk

kondisi penyakit yang berbeda. Tantangan tersebut akan

mendeteksi kandidat protein utama melalui pendekatan

kombinasi untuk mendiagnosa penyakit tertentu secara akurat

selama awal trimester pertama kehamilan. Pendekatan ini akan

menghasilkan peningkatan sensitivitas dan spesifisitas test

dikembangan dengan menggunakan pendekatan ini.

Kandidat penanda diidentifikasi melalui beberapa platform

proteomik juga harus divalidasi pada jumlah yang lebih dari

sampel pasien melalui uji klinis, karena prevalensi kondisi

penyakit tersebut pada populasi normal adalah sangat rendah.

Teknologi seperti microarray protein, seluruh proteome scan dan

22

system analisis utuh protein dapat membantu untuk lebih

memahami lingkungan proteome janin secara global. Masa

depan dapat terus bisa untuk pengembangan panel atau array

penanda untuk mengatasi kondisi penyakit janin tertentu.

Platform proteomic tersebut bisa memastikan bahwa biomarker

tertentu dengan sensitivitas yang lebih tinggi dan spesifisitas

dapat diidentifkasi untuk mendiagnosis kelainan janin berada

pada tahap awal.

23

DAFTAR PUSTAKA

1. Cuckle H. Time for total shift to first-trimester screening for

Down’s Syndrome. Lancet 358(9294), 1658-1659 (2001).

2. Lo YMD, Lun FM, Chan KC et al. Digital PCR for the molecular

detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc.Natl Acad.Sci.

USA 104, 13116-13121 (2007).

3. Fan HC, Quake SR. Detection of aneuploidy with digital

polymerase chain reaction. Anal. Chem. 79(19), 7576-7579

(2007).

4. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR.

Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun

sequencing DNA from maternal blood. Proc, Natl Acad. Sci. USA

105(42), 16266-16271 (2008).

5. Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A et al. Progress with

gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma

genitalium. Electrophoresis 7, 1090-1094 (1995).

6. Aldred S, Grant MM, Griffiths HR. The use of proteomics for the

assessment of clinical samples in research. Clin. Biochem.

37(11), 943-952 (2004).

7. Kolialexi A, Tsangaris GT, Papantoniu N et al. Application pf

proteomics for the identification of differentially expressed

protein markers for Down Syndrome in mzteran plasma. Prenat.

Diagn. 28(8), 691-698 (2008).

8. Liotta L, Kohn EC, Petricoin EF. Clinical proteomics : personalized

molecular medicine. JAMA 286,2211-2214 (2001).

9. Lau AT, He QY, Chiu JF. Proteomic technology and its biomedical

applications. Acta Biochemica 35,965-975 (2003).

24

10. Avent ND, Plummer ZE, Madgett TE, Maddocks DG, Soothill PW.

Post-genomics studies and their application to non-invasive

prenatal diagnosis. Semin. Fetal Neonatal Med. 13(2),91-98

(2008).

11. Shimizu C, Bryant-Greenwood P. Post-genome molecular

diagnostics in obstetrics. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 16(2), 167-

177 (2004).

12. Nagalla SR, Canick JA, Jacob T et al. Proteomic analysis of

maternal serum in Down syndrome: identification of novel

protein biomarkers. J. Proteome Res. 6(4), 1245-1257 (2007).

13. Michel PE, Crettaz D, Morier P et al. Proteome analysis of human

plasma and amniotic fluid by off-gel isoelectric focusing followed

by nano-LC-MS/MS. Electrophoresis 27(5-6), 1169-1181 (2006).

14. Tsagaris GT, Karamessinis P, Kolialexi A et al. Proteomic analysis

of amniotic fluid in pregnancies with Down syndrome,

Proteomics 6(15), 4410-4419 (2006).

15. Nicolaider KH. Nuchal translucency and other first-trimester

sonographic markers of chromosomal abnormalities. Am. J.

Obstet. Gynecol. 191(1), 45-67 (2004).

16. Spencer K. Aneuploidy screening in the first trimester.

Am.J.Med.Genet. C Semin. Med,Genet. 145C(1), 18-32 (2007).

17. Mizejewski GJ. α-fetoprotein as a biologic response modifier:

relevance to domain and subdomain structure. Proc. Soc. Exp.

Biol. Med. 215,333-362 (1997).

18. Brock DJ, Scrimgeour JB, Steven J, Barron L, Watt M. Maternal

plasma α-fetoprotein screening for fetal neural tube defects.

Br.J.Obstet.Gynaecol. 85(8), 575-581 (1978).

19. Bartha JL, Ilanes S, Gonzales-Bugatto F, Abdel-Fattah SA.

Maternal Serum transformed α-fetoprotein levels in women with

intrauterine growth retardation. Fetal diagn. Ther. 22(4), 294-

298 (2007).

25

20. Wald NJ, Kennard A, Hackshaw A, McGuire A. Antenatal

screening for Down syndrome. J. Med. Screen. 4(4), 181-246

(1997).

21. Canick JA, MacRae AR. Second trimester serum markers. Semin.

Perinatol. 29(4), 203-208 (2005).

22. Spencer K, Crossley JA, Aitken DA, Nicolaides KH. Second

trimester levels of pregnancy-associated plasma protein-A and

free β-hCG in pregnancies with trisomy 13. Prenat. Diagn. 25(5),

358-361 (2005).

23. Underwood MA, Gilbert WM, Sherman MP. Amniotic fluid : not

just fetal urine anymore. J. Perinatiol. 25(5), 341-348 (2005).

24. Schwartz M, Schwartz S, Wenk RE, Cohen M. Amniotic fluis and

advances in prenatal diagnosis. Clin. Lab. Med. 5(2), 371-387

(1985).

25. Page NM, Kemp CF, Nutin DJ, Lowry PJ. Placental peptides

as ,arkers of gestational disease. Reproduction 123(4), 487-495

(2002).

26. Michaels JE, Dasari S, Pereira L et al. Comprehensive proteomic

analysis of the human amniotic fluid proteome gestational age-

dependent changes. J. Proteome Res. 6(4), 1277-1285 (2007).

27. Karumanchi SA, Lindheimer MD. Advances in the understanding

of eclampsia. Curr. Hypertens. Rep. 10(4), 305-312 (2008).

28. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in the understanding

preeclampsia. Science 308(5728), 1592-1594 (2005).

29. Anastasakis E, Paraskeves KI, Papantoniou N et al. Association

between abnormal uterine artery Doppler flow velocimetry, risk

of preeclampsia, and indices of arterial structure and function : a

pilot study. Angiology 59(4), 493-499 (2008).

30. Huppertz B, Sammar M, Chefez I, et al. Longitudinal

determination of serum placental protein 13 during development

pf preeclmpsia. Fetal diagn. Ther. 24(3), 230-236 (2008).

26

31. Pettker CM, Buhimschi IA, Magloire LK, et al. Value of placental

microbial evaluation in diagnosing intraamniotic infection.

Obstet, Gynecol. 109(3), 739-749 (2007).

32. Ruetchi U, Rosen A, Karlsson G et al. Proteomic analysis using

protein chips to detect in cervical and amniotic fluid in women

with intraamniotic inflammation. J. Proteome Res. 4(6), 2236-

2242 (2005).

33. Crawford JT, Pereira L, Buckmaster J et al. Amniocentesis results

and novel proteomic analysis on a case of occult candida

chorioamnionitis. J. Matern. Fetal neonatal med. 19(10), 667-670

(2006).

34. Pereira L, Ressy AP. Jacob et al. Identification of novel protein

biomarkers of preterm birth in human cervical-vaginal fluid. J.

Proteome Res. 6(4), 1269-1276 (2007).

35. Vuadens F, Benay C, Crettaz D et al. Identification of biologic

markers of the premature rupture of the fetal membranes :

proteomic approach. Proteomics 3(8), 1521-1525 (2003).

36. Tsangasris GT, Kolialexi A, Karamessinis PM et al. The normal

human amniotic fluis supernatant proteome. In Vivo 20(4), 479-

490 (2006).

37. Mavrou A, Anagnostopulos AK, Kolialexi A et al. Protemic

analysis of amniotic fluid in pregnancies with Turner Syndrome

fetuses. J. Proteome Res. 7(5), 1862-1866 (2008).

38. Wu WW Wang G, Baek SJ, Shen RF. Comparative study of three

proteomic quantitative methods, DIGE, cICAT, & iTRAQ, using

2D-gel- or LC-MALDI TOF/TOF. J. Proteome Res. 5(3), 651-658

(2006).

39. Queloz PA, Crettaz D, Thadikkaran L et al. Proteomic analyses of

amniotic fluid : potential applications in health and diseases. J.

Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 850(1-2), 336-

343 (2007).

27

40. Wang TH, Chang YL, Peng HH et al. Rapid detection of fetal

aneuploidy using proteomics approaches on amniotic fluid

supernatant. Prenat. Diagn. 25(7), 559-566 (2005).

41. Mange A, Desmetz C, Bellet V, Molinari N, et al. Proteomic profile

determination of autosomal aneuploidies by mass spectrometry

on amniotic fluids. Proteome Sci. 6,1 (2008).

42. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA et al. Use of proteomic

patterns in seum to identify ovarian cancer. Lancet 359_9306),

572-577 (2002).

43. Buhimschi IA, Christner R, Buhimschi CS. Proteomic biomarker

analysis of amniotic fluid for identification intraamniotiv

inflammation. BJOG 112(2), 173-181 (2005).

28