Produksi insulin manusia pada Escherichia coli. Ada dua perlakuan untuk kloning

molekuler ekspresi gen pada bakteri. Yang paling umum dimulai dengan messenger RNA

(mRNA) dan menggunakan reverse transcriptase untuk membuat salinan DNA (cDNA), yang

kemudian dikloning. Digunakan metode itu karena dapat digunakan kode genetik dari dua gen

kecil yang berisi tepat sequence nukleotida untuk membuat sel bakteri menghasilkan insulin

manusia. Gen dirancang dan dibuat memiliki urutan nukleotida yang berbeda dari urutan

pengkodean alami insulin manusia.

Skema gambaran dari strain dan prosedur untuk produksi insulin manusia oleh bakteri.

Dua Escherichia coli strain yang dibangun mensintesis insulin A-atau gen rantai-B dimasukkan

ke (2-galaktosidase gen/3-GAI) dari vektor kloning plasmid. Secara in vivo, protein menyatu

dibuat seperti fi-galaktosidase, tetapi dengan ekor insulin bergabung dengan metionin. Secara In

vitro, rantai peptida insulin terpotong oleh sianogen bromida. Setelah pemurnian terpisah, insulin

A-dan B-rantai bergabung dengan oksidasi udara.

Dua perlakuan untuk kloning molekul gen sehingga memproduksi bakteri hormon

mamalia dan protein.

Gen-gen untuk insulin manusia, B-dan A-rantai, yang dirancang dari sekuens asam amino dari

polipeptida manusia. Ujung 5 'dari setiap gen memiliki termini kohesif beruntai tunggal untuk

EcoRl dan Bam saya pembatasan endonuckases untuk

pemasangan yang benar dari setiap gen ke dalam plasmid pBR322. Sebuah situs pengakuan / / /

endonuklease Hind dimasukkan ke tengah rantai-B gen untuk sekuens asam amino Glu-Ala

untuk memungkinkan amplifikasi dan verifikasi setiap setengah dari gen terpisah sebelum

pembangunan seluruh gen rantai-B. The B-dan gen A-rantai dirancang untuk dibangun dari 29

oligodeoxyribonucleotides yang berbeda, bervariasi dari decamers untuk pentoda camers. Setiap

panah menunjukkan fragmen disintesis dengan metode phosphotriester ditingkatkan, HI ke H8

dan BJ B12 untuk gen rantai-B, dan

A / All untuk gen A-rantai

F / G. 4. Sintesis kimia oligodeoxyribonuckotides oleh im-

terbukti metode Triester.

5

Hal ini jelas bahwa teknik telah dikembangkan ke titik

di mana gen untuk mengubah bakteri dapat dibuat dengan hubungan-

tively sederhana usaha. Sebenarnya, teknik telah im-

terbukti jauh sejak proyek insulin dan jauh lebih sedikit

waktu akan dibutuhkan sekarang.

Gambar 4 mengilustrasikan metode sintesis kimia Triester

yang digunakan untuk membuat gen insulin.

5

  Dimulai dengan nu-

cleosides, perpustakaan trimer Triester sepenuhnya dilindungi, seperti

1 dan 2, yang dibuat. Tipe 2 trimer, dengan anisol 3'-

gugus pelindung, akan menjadi ujung 3 'dari oligonucleo-

pasang. Tipe 1 trimer adalah bifunctional, dan tergantung pada

pengobatan (baik ringan atau asam basa), akan baik akhir 5 '

komponen atau komponen urutan internal. karena

kelompok melindungi chloropehnyl dipasang ester linkage

kelompok fosfat (membentuk phosphotriesters), yang

trimer dan oligonukleotida menengah (misalnya, 3, 4, 5, 6,

7) tidak larut dalam air. Oleh karena itu, semua kondensasi dan

pemurnian dilakukan dalam pelarut berair seperti kloro-

bentuk. Trimer dapat terkondensasi untuk menghasilkan hexamers (misalnya,

3 + 4 hasil 6) dan nexamers dapat terkondensasi untuk menghasilkan do-

decamers (misalnya, 6 + 7 hasil 8, masih sepenuhnya dilindungi Triester

bentuk). Langkah berikutnya-untuk-terakhir dalam sintesis khas adalah re-the

moval dari semua kelompok melindungi oleh pengobatan dengan asam asetat

dan NH4OH, menghasilkan yang diinginkan larut dalam air single-

terdampar fragmen DNA. Langkah terakhir adalah purifica-hatition dari fragmen DNA dengan

kromatografi cair kinerja tinggi-

matography.

Gambar 5 menggambarkan bagaimana insulin Sebuah rantai-dihimpun,

kloning, dan diposisikan pada akhir beta-galaktosidase. langkah

1 (ditunjukkan dalam Gambar 5) telah bergabung dengan kecil (13 Rata-rata dasar)

oligonukleotida. Karena mereka dirancang untuk memiliki com-

tumpang tindih plementary, mereka berkumpul sendiri dan

bergabung untuk memberikan DNA dupleks oleh aksi DNA T4

ligase. Gen ini dirancang untuk memiliki enzim restriksi

situs pada setiap akhir (EcoRI di sebelah kiri dan BamHI pada

kanan). Langkah 2 adalah persiapan kloning DNA plasmid

vektor pBR322. Persiapan meliputi pengobatan dengan EcoRI

dan BamHI enzim restriksi, yang memotong sepotong kecil

dari plasmid dan menyediakan sebuah situs untuk penyisipan syn-

thetic Sebuah gen. Pada langkah 3, plasmid dipersiapkan dan sintetis

DNA dicampur dan bergabung dengan ligase T4, diikuti oleh trans-

pembentukan E. coli dan kloning molekuler. Clone adalah ob-

verifikasi dipelihara yang berisi insulin yang benar gen A, sebagaimana yang dijabarkan oleh

sekuensing DNA langsung. Selanjutnya, fragmen DNA yang mengandung

sebagian besar E. coli lac operon, termasuk promotor lac,

operator, dan pertama 1006 kodon asam amino beta-galac-

tosidase, dimasukkan (langkah 4, 5, dan 6). Hal ini menyebabkan klon

membuat insulin-beta-galaktosidase protein menyatu.

Gambar. 5. Pembangunan DNA plasmid yang mengandung sintetis insu-

lin gen Sebuah rantai-disisipkan pada akhir (gen 3-galaktosidase. The prosedur

prosedur di dijelaskan dalam teks, dan rincian diberikan dalam Goeddel et al.

2

Hanya penjelasan dari simbol-simbol yang diberikan di sini. Simbol A perwakilan-

sents gen Sebuah rantai-sintetis. pBR322 adalah plasmid baik ditandai

vektor kloning yang mengandung dua gen resistensi antibiotik, ampisilin

(Amp) dan tetrasiklin (Tet), dan beberapa pembatasan nyaman endonu-

situs clease termasuk Eco Rl (Rl) dan Bam HI (Bam). Lambda adalah plac

lambda pentransduksi fag membawa seluruh E. coli operon, yang dalam-

cludes promotor lac (?), operator lac (O), dan seluruh (i-galac-

tosidase gen struktural (Z). Ada Rl situs endonuklease Eco ke

kiri operon dan abo satu di dekat akhir (gen i-galaktosidase;

dengan demikian, operon lac fragmen DNA dapat segera diperoleh. The fenotipe

jenis strain bakteri berhasil terinfeksi plasmid yang diinginkan

ditampilkan. Sebagai contoh, strain A-rantai produksi akan ampisilin

tahan (AMPR

), Tetrasiklin sensitif (Tet

s

), Dan koloni akan

Biru pada agar indikator khusus yang disebut XG