KEMENTERIAN RISET,TEKNOLOGI DAN PERGURUAN TINGGI

POLITEKNIK NEGERI JEMBER

JURUSAN PRODUKSI PERTANIAN

LAPORAN KEGIATAN PRAKTIKUMKULTUR JARINGAN

Acara Praktikum : Pembuatan Media MS 0

Tujuan : Mahasiswa diharap mampu :

- Mengetahui bagaimana cara membuat media tanam MS0 pada teknik kultur jaringan.

Nama Praktikan : Winarto

NIM : A31140500

Program Studi : Produksi Tanaman Hortikultura

Golongan : A

Hari/Tanggal : Selasa, 03 November 2015

Tempat : Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember

Pembimbing : 1. Ir. Djenal,M.P

2. Dr.Ir Kasutjianingati M, Si

Tekniksi : P. Didik

POLITEKNIK NEGERI JEMBERPRODUKSI TANAMAN HORTIKULTURA

2015

Telah diperiksa

BAB ILATAR BELAKANG

1.1 Latar Belakang

Kultur in vitro atau kultur jaringan tanaman merupakan suatu teknik untuk

mengisolasi bagian tanaman (sel, jaringan, dan organ tanaman), untuk ditumbuhkan pada

media dengan kondisi aseptik agar bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri dan

membentuk tanaman yang sempurna (Gunawan 1992). Sukmadjadja dan Mariska (2003)

menyatakan bahwa terdapat beberapa kelebihan dari penggunaan teknik kultur jaringan

dibandingkan dengan cara konvensional yaitu faktor perbanyakan tinggi, tidak tergantung

pada musim karena lingkungan tumbuh in vitro terkendali, bahan tanaman yang digunakan

sedikit sehingga tidak merusak pohon induk, tanaman yang dihasilkan bebas dari penyakit

meskipun dari induk yang mengandung patogen internal serta tidak membutuhkan tempat

yang sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak.

Media dasar dan zat pengatur tumbuh diperlukan dalam metode perbanyakan tanaman

secara in vitro. Media yang seing digunakan dalam kultur in vitro adalah media Murashige

dan Skoog atau media Gamborg (B5) (Gamborg 1995). Menurut Wattimena (1988), peran

ZPT dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur adalah mengawali reaksi-reaksi biokimia

dan mengubah komposisi kimia di dalam media tanam, yang mengakibatkan terbentuknya

organ tanaman. Dalam media diberikan berbagai garam mineral, air, gula, asam amino, zat

pengatur tumbuh, pemadat media untuk pertumbuhan dan perkembangan, serta kadang-

kadang arang aktif untuk mengurangi efek penghambatan dari persenyawaan polifenol (warna

coklat-hitam) yang keluar akibat pelukaan jaringan pada jenis-jenis tanaman tertentu. Gula,

asam amino, dan vitamin ditambahkan karena eksplan yang ditanam tidak lagi sepenuhnya

hidup secara autotrof (hidup dari bahan-bahan anorganik dari alam). Dalam kultur in vitro,

segmen tanaman hidup secara heterotrof (mendapat suplai bahan organik) (Gunawan 1995).

Komposisi nutrisi medium kultur dapat dikatagorikan dalam : garam-garam mineral,

karbohidrat, vitamin dan bahan organik lain zat tumbuh dan senyawa-senyawa organik

kompleks seperti air kelapa, sari tomat, ekstrak yeast dan lain-lain (Hattmann and Kaster

1968). media kultur yang memenuhi syarat adalah media yang mengandung nutrien makro

dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, serta sumber tenaga (umumnya digunakan

sukrosa). Garam-garam anorganik atau garam-garam mineral terdiri atas : unsur-unsur makro

nitrogen, phospor, potasium, kalsium, magnesium dan sulfur sangat penting untuk seluruh

jaringan tanaman dan pertumbuhan bagian tanaman secara in vitro. Dan unsur-unsur mikro

yaitu B, Co, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, penting di tambahkan tetapi pada beberapa media dapat

dihilangkan. Unsur-unsur esensial dalam suatu media berfungsi untuk mengatur proses-proses

fisiologis, serta mengaktifkan enzim dan mengatur kecepatan proses enzim (Epstein 1972).

Disamping itu juga untuk mengatur proses-proses metabolisme. Kekurangan unsur-unsur

esensial akan menimbulkan gangguan fisiologis.

Dalam praktikum ini dilakukan pembuatan media tanam kultur jaringan dan

melakukan pengamatan jumlah media yang steril dan kontam. Pengamatan media dilakukan

pada perbanyakan cepat tanaman pada tanaman Krisantimum karena media yang dibuat

digunakan untuk perbanyakan tanaman krisantimum.

1.2 Tujuan

Mengetahui bagaimana cara membuat media tanam MS0 pada teknik kultur jaringan.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran

zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit

untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat

mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media

pertumbuhannya.

 (Indra, 2008)

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang

disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan

mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis

mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada

medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber

karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium

yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks

lainnya.

 (Volk, dan Wheeler,1993)

Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan

substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah

degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus

memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan

faktor tumbuh.

(Label, 2008).

Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus dapat

menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk melakukannya haruslah

dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh bakteri dan juga macam lingkungan

fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya tersebut.

 (Pelczar, 1986)

Adapun macam-macam media Pertumbuhan antara lain:

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media

menjadi padat..

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi

sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya

pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran

sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free

Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan dibawah permukaan

media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga

bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth,

kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga

diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient

Broth), LB (Lactose Broth).

2. Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya

secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti,

misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.

Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi

senyawa penyusunnya

Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui

secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice

Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya

Nutrient Broth, Blood Agar.

Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media

tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba

yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin

untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka,

Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus

agalactiae yang toleran terhadap garam.

Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan

mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media

diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam

media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi

membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum

Agar, dll.

Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.

Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan

menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-

kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya

adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter

spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron

Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan

perubahan warna media di sekeliling koloni.

(Indra, 2008)

Meskipun telah dijabarkan berbagai macam jenis dari medium, perlu diiingat bahwa

tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi untuk semua bakteri di

laboratorium. Bakteri amat beragam, baik dari persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa

berapa bakteri memiliki persyaratan nutrient yang sederhana, sedang yang lain memiliki

persyaratan yang rumit. Karena alsan ini kondisi harus disesuaikan sedemikian rupa sehingga

bisa menguntungkan bagi kelompok bakteri yang sedang ditelaah.

 (Pelczar, 1986)

Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam susunannya sesuai

dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan. Beberapa bakteri dapat hidup baik pada

medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber

karbon organik, seperti gula. Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks

yang kepadanya ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lain – hampir semua media

yang biasa dipakai sehari-hari dapat di beli secara komersil sebagai tepung kering. Jadi, untuk

membuat suatu medium, yang harus dilakukan hanyalah menimbang jumlah tepung yang

diperlukan, menambahkan air, dan mensterilkan sebelum dipakai.

 (Volk and Wheler, 1988)

Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi,

ekstrak khamir, tripton, dan darah juga dapat disebut medium buatan atau medium kompleks

(artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita mengacu pada medium yang rumus

kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintetis (synththetical

medium) atau medium yang ditentukan (defined medium). Medium sintetis mungkin sangat

rumit dan sangat berbeda sesuai dengan organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk

sebagian besar, medium sintetis hanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di

laboratorium penelitian. Media agar merupakan substrat yang baik untuk memisahkan

campuran mikroorganisme, sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-pisah. Teknik

yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkan setiap

sel berhimpun menjadi koloni. Semua sel dalam koloni itu dianggap kesemuanya merupakan

keturunan (progeni) suatu organisme dan karena itu mewakili apa yang disebut mikrobiologi

biakan murni.

(Dwidjosputro, 1990)

Di samping itu, gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental dan memang

dahulu orang memakainya tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-

agar baru mencair pada suhu 950 C, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 250 C.

Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih

dingin dari pada suhu kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.

 (Volk and Wheeler, 1988)

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Tempat dan Waktu

Hari/tanggal : Selasa, 03 November 2015

Pukul : 07.00 - 09.00 WIB

Pelaksanaan : Halaman Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember

3.2 Bahan dan Alat

Tabung reaksi

Cawan petri

Beaker glass

Erlenmeyer

Gelas ukur

Gelas pengaduk

Timbangan

Hot plate

Ph meter

Autoclave

Pipet

Medium Nutrien Agar (NA) dengan komposisi (g/l)

Agar dan Aquades

3.3 Prosedur Keja Pembuatan Media MS0

1. Larutkan 15 gram gula dengan menambahkan akuades sebanyak 500 ml dan campurkan

ke dalam labu takar.

2. Tambahkan 10 ml larutan stok A dan B, masukkan ke dalam labu takar.

3. Tambahkan 2,5 ml masing-masing larutan stok C, stok D, stok E

4. Tambahkan 5 ml masing-masing larutan stok F, Myo dan Vitamin

5. Tera PH media dengan menambahkan HCl 1 N atau KOH 1 N sampai mencapai 5,9

6. Tambahkan media ke dalam tempat yang volumenya ± 1 liter, lalu tambahkan 3,5 gram

agar-agar.

7. Panaskan media sampai agar-agar larut (sambil diaduk)

8. Tuangkan media ke dalam botol kultur steril

9. Sterilisasi media selama 15-20 menit, pada suhu 121 C tekanan 17,5 psi

Untuk media MS13 setelah langkah ke 4 ditambahkan dengan Zat Pengatur Tumbuh dan

langkah selanjutnya sama.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Sebelum di masukkan ke autoclav

Sesudah di masukkan ke autoclav

4.2 Pembahasan

Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi

terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk

kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang

teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu

penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia

(etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin).

Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk

menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan

seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air

sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke

dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan

agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus

Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang

lebih 43oC. Agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode

bacteriaological.

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik

dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari

lingkungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel

beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler. Bakteri

dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya

akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti

meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri

dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap

milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi

dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk

dinding sel baru .

Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat.

Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio

cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu

dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-

400c

PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam

pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok

untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut.

Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium

masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang

steril juga menentukan .

Nutrient agar (NA) termasuk medium semi alamiah karena tersusun atas bahan alami

(daging) dan bahan sintesis (pepton dan agar). Fungsi bahan yang digunakan pada medium

NA :

- Agar : Untuk memadatkan medium NA.

- Aquadest : Untuk melarutkan agar, pepton, dan daging.

Sama halnya dengan pembuatan media dengan Nutrien Agar, pembuatan dengan BHI

atau Brain Heart Infusion hasilnya adalah berupa medium padat berbentuk agar. Setelah

diambil dari autoclave, kemudian  diletakkan di cawan petri, maka sekitar 10-15 menit akan

membeku menjadi agar. Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium

sama halnya dengan yang digunakan pada medium NA yang juga berperan sebagai media

tumbuh yang ideal bagi mikroba.

Di dalam dunia medis, penting untuk mempelajari tentang pembuatan media karena

hal ini akan sangat diperlukan untuk melakukan penelitian terhadap mikroorganisme yang

merupakan salah satu penyeab penyakit pada manusia. Dengan praktikum pembuatan media

diharapkan dapat menumbuhkan, mengisolasi dan menguji sifat fisiologi atau perhitungan

mikroorganisme tertentu.

 

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dalam pembuatan media harus dilakukan dengan baik dan benar supaya menghasilkan

perbanyakan tanaman banyak dan tidak terkontaminasi.

5.2 Saran

Sebaiknya dalam praktikum pembuatan media MS0 ini praktikan lebih hati-hati dalam

memegang alat atau yang lainnya soalnya kebanyakan alat-alatnya terbuat dari kaca yang

mudah pecah.

DAFTAR PUSTAKA

Epstein E. 1972. Mineral Nutrition of Plants. Principles and Perspectives. New York: John Wiley and Sons. Inc.

Hartmann HT, Kester DE. 1968. Plant Propagation, Principles and Practices. New York: Prentice Hall. Inc

Gamborg, O.L. 1995. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Dalam L.R. Wetter dan F. Constabel (Eds). Metode Kultur Jaringan Tanaman. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hal 1-13.

Gunawan, L. W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Departemen Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor. 165 hal.

Dwijoseputro, 1990. Dasar-Dasar Mikorobiologi. Penerbit Djambatan. : Jakarta .

Indra., 2008, http//ekmon-saurus/bab-2-Media- pertumbuhan/.htm . diakses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar .

Label, Caray.,2008, http//Caray label makalah –dan – skripsi pembuatan-media- agar dan-sterilisasi/htm .diakses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar .

Pelczar, Michael, 1986, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Universitas Indonesia : Jakarta .

Volk, dan Wheeler., 1993, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Erlangga : Jakarta .