Download - print bro
KEMENTERIAN RISET,TEKNOLOGI DAN PERGURUAN TINGGI
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
JURUSAN PRODUKSI PERTANIAN
LAPORAN KEGIATAN PRAKTIKUMKULTUR JARINGAN
Acara Praktikum : Pembuatan Media MS 0
Tujuan : Mahasiswa diharap mampu :
- Mengetahui bagaimana cara membuat media tanam MS0 pada teknik kultur jaringan.
Nama Praktikan : Winarto
NIM : A31140500
Program Studi : Produksi Tanaman Hortikultura
Golongan : A
Hari/Tanggal : Selasa, 03 November 2015
Tempat : Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember
Pembimbing : 1. Ir. Djenal,M.P
2. Dr.Ir Kasutjianingati M, Si
Tekniksi : P. Didik
POLITEKNIK NEGERI JEMBERPRODUKSI TANAMAN HORTIKULTURA
2015
Telah diperiksa
BAB ILATAR BELAKANG
1.1 Latar Belakang
Kultur in vitro atau kultur jaringan tanaman merupakan suatu teknik untuk
mengisolasi bagian tanaman (sel, jaringan, dan organ tanaman), untuk ditumbuhkan pada
media dengan kondisi aseptik agar bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri dan
membentuk tanaman yang sempurna (Gunawan 1992). Sukmadjadja dan Mariska (2003)
menyatakan bahwa terdapat beberapa kelebihan dari penggunaan teknik kultur jaringan
dibandingkan dengan cara konvensional yaitu faktor perbanyakan tinggi, tidak tergantung
pada musim karena lingkungan tumbuh in vitro terkendali, bahan tanaman yang digunakan
sedikit sehingga tidak merusak pohon induk, tanaman yang dihasilkan bebas dari penyakit
meskipun dari induk yang mengandung patogen internal serta tidak membutuhkan tempat
yang sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak.
Media dasar dan zat pengatur tumbuh diperlukan dalam metode perbanyakan tanaman
secara in vitro. Media yang seing digunakan dalam kultur in vitro adalah media Murashige
dan Skoog atau media Gamborg (B5) (Gamborg 1995). Menurut Wattimena (1988), peran
ZPT dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur adalah mengawali reaksi-reaksi biokimia
dan mengubah komposisi kimia di dalam media tanam, yang mengakibatkan terbentuknya
organ tanaman. Dalam media diberikan berbagai garam mineral, air, gula, asam amino, zat
pengatur tumbuh, pemadat media untuk pertumbuhan dan perkembangan, serta kadang-
kadang arang aktif untuk mengurangi efek penghambatan dari persenyawaan polifenol (warna
coklat-hitam) yang keluar akibat pelukaan jaringan pada jenis-jenis tanaman tertentu. Gula,
asam amino, dan vitamin ditambahkan karena eksplan yang ditanam tidak lagi sepenuhnya
hidup secara autotrof (hidup dari bahan-bahan anorganik dari alam). Dalam kultur in vitro,
segmen tanaman hidup secara heterotrof (mendapat suplai bahan organik) (Gunawan 1995).
Komposisi nutrisi medium kultur dapat dikatagorikan dalam : garam-garam mineral,
karbohidrat, vitamin dan bahan organik lain zat tumbuh dan senyawa-senyawa organik
kompleks seperti air kelapa, sari tomat, ekstrak yeast dan lain-lain (Hattmann and Kaster
1968). media kultur yang memenuhi syarat adalah media yang mengandung nutrien makro
dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, serta sumber tenaga (umumnya digunakan
sukrosa). Garam-garam anorganik atau garam-garam mineral terdiri atas : unsur-unsur makro
nitrogen, phospor, potasium, kalsium, magnesium dan sulfur sangat penting untuk seluruh
jaringan tanaman dan pertumbuhan bagian tanaman secara in vitro. Dan unsur-unsur mikro
yaitu B, Co, Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, penting di tambahkan tetapi pada beberapa media dapat
dihilangkan. Unsur-unsur esensial dalam suatu media berfungsi untuk mengatur proses-proses
fisiologis, serta mengaktifkan enzim dan mengatur kecepatan proses enzim (Epstein 1972).
Disamping itu juga untuk mengatur proses-proses metabolisme. Kekurangan unsur-unsur
esensial akan menimbulkan gangguan fisiologis.
Dalam praktikum ini dilakukan pembuatan media tanam kultur jaringan dan
melakukan pengamatan jumlah media yang steril dan kontam. Pengamatan media dilakukan
pada perbanyakan cepat tanaman pada tanaman Krisantimum karena media yang dibuat
digunakan untuk perbanyakan tanaman krisantimum.
1.2 Tujuan
Mengetahui bagaimana cara membuat media tanam MS0 pada teknik kultur jaringan.
BAB IITINJAUAN PUSTAKA
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran
zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit
untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat
mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media
pertumbuhannya.
(Indra, 2008)
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang
disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis
mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada
medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber
karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium
yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks
lainnya.
(Volk, dan Wheeler,1993)
Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan
substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah
degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus
memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan
faktor tumbuh.
(Label, 2008).
Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium , pertama- tama kita harus dapat
menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk melakukannya haruslah
dimengerti jenis- jenis nutrient yang disyartakan oleh bakteri dan juga macam lingkungan
fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya tersebut.
(Pelczar, 1986)
Adapun macam-macam media Pertumbuhan antara lain:
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media
menjadi padat..
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi
sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya
pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran
sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free
Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan dibawah permukaan
media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga
bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth,
kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga
diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient
Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya
secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti,
misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang.
Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi
senyawa penyusunnya
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui
secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice
Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya
Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media
tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba
yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin
untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka,
Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus
agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan
mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media
diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam
media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum
Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.
Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan
menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-
kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya
adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter
spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron
Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan
perubahan warna media di sekeliling koloni.
(Indra, 2008)
Meskipun telah dijabarkan berbagai macam jenis dari medium, perlu diiingat bahwa
tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi untuk semua bakteri di
laboratorium. Bakteri amat beragam, baik dari persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa
berapa bakteri memiliki persyaratan nutrient yang sederhana, sedang yang lain memiliki
persyaratan yang rumit. Karena alsan ini kondisi harus disesuaikan sedemikian rupa sehingga
bisa menguntungkan bagi kelompok bakteri yang sedang ditelaah.
(Pelczar, 1986)
Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam susunannya sesuai
dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan. Beberapa bakteri dapat hidup baik pada
medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber
karbon organik, seperti gula. Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks
yang kepadanya ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lain – hampir semua media
yang biasa dipakai sehari-hari dapat di beli secara komersil sebagai tepung kering. Jadi, untuk
membuat suatu medium, yang harus dilakukan hanyalah menimbang jumlah tepung yang
diperlukan, menambahkan air, dan mensterilkan sebelum dipakai.
(Volk and Wheler, 1988)
Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi,
ekstrak khamir, tripton, dan darah juga dapat disebut medium buatan atau medium kompleks
(artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita mengacu pada medium yang rumus
kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintetis (synththetical
medium) atau medium yang ditentukan (defined medium). Medium sintetis mungkin sangat
rumit dan sangat berbeda sesuai dengan organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk
sebagian besar, medium sintetis hanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di
laboratorium penelitian. Media agar merupakan substrat yang baik untuk memisahkan
campuran mikroorganisme, sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-pisah. Teknik
yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkan setiap
sel berhimpun menjadi koloni. Semua sel dalam koloni itu dianggap kesemuanya merupakan
keturunan (progeni) suatu organisme dan karena itu mewakili apa yang disebut mikrobiologi
biakan murni.
(Dwidjosputro, 1990)
Di samping itu, gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental dan memang
dahulu orang memakainya tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-
agar baru mencair pada suhu 950 C, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 250 C.
Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih
dingin dari pada suhu kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.
(Volk and Wheeler, 1988)
BAB IIIMETODOLOGI
3.1 Tempat dan Waktu
Hari/tanggal : Selasa, 03 November 2015
Pukul : 07.00 - 09.00 WIB
Pelaksanaan : Halaman Laboratorium Kultur Jaringan Politeknik Negeri Jember
3.2 Bahan dan Alat
Tabung reaksi
Cawan petri
Beaker glass
Erlenmeyer
Gelas ukur
Gelas pengaduk
Timbangan
Hot plate
Ph meter
Autoclave
Pipet
Medium Nutrien Agar (NA) dengan komposisi (g/l)
Agar dan Aquades
3.3 Prosedur Keja Pembuatan Media MS0
1. Larutkan 15 gram gula dengan menambahkan akuades sebanyak 500 ml dan campurkan
ke dalam labu takar.
2. Tambahkan 10 ml larutan stok A dan B, masukkan ke dalam labu takar.
3. Tambahkan 2,5 ml masing-masing larutan stok C, stok D, stok E
4. Tambahkan 5 ml masing-masing larutan stok F, Myo dan Vitamin
5. Tera PH media dengan menambahkan HCl 1 N atau KOH 1 N sampai mencapai 5,9
6. Tambahkan media ke dalam tempat yang volumenya ± 1 liter, lalu tambahkan 3,5 gram
agar-agar.
7. Panaskan media sampai agar-agar larut (sambil diaduk)
8. Tuangkan media ke dalam botol kultur steril
9. Sterilisasi media selama 15-20 menit, pada suhu 121 C tekanan 17,5 psi
Untuk media MS13 setelah langkah ke 4 ditambahkan dengan Zat Pengatur Tumbuh dan
langkah selanjutnya sama.
BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Sebelum di masukkan ke autoclav
Sesudah di masukkan ke autoclav
4.2 Pembahasan
Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi
terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk
kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang
teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu
penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia
(etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin).
Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk
menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan
seperti jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air
sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke
dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel silika. Bahan
agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak dari alga genus
Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang
lebih 43oC. Agar merupakan media tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode
bacteriaological.
Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik
dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari
lingkungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel
beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler. Bakteri
dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya
akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti
meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri
dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap
milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi
dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk
dinding sel baru .
Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat.
Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio
cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu
dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-
400c
PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam
pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok
untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut.
Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium
masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang
steril juga menentukan .
Nutrient agar (NA) termasuk medium semi alamiah karena tersusun atas bahan alami
(daging) dan bahan sintesis (pepton dan agar). Fungsi bahan yang digunakan pada medium
NA :
- Agar : Untuk memadatkan medium NA.
- Aquadest : Untuk melarutkan agar, pepton, dan daging.
Sama halnya dengan pembuatan media dengan Nutrien Agar, pembuatan dengan BHI
atau Brain Heart Infusion hasilnya adalah berupa medium padat berbentuk agar. Setelah
diambil dari autoclave, kemudian diletakkan di cawan petri, maka sekitar 10-15 menit akan
membeku menjadi agar. Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium
sama halnya dengan yang digunakan pada medium NA yang juga berperan sebagai media
tumbuh yang ideal bagi mikroba.
Di dalam dunia medis, penting untuk mempelajari tentang pembuatan media karena
hal ini akan sangat diperlukan untuk melakukan penelitian terhadap mikroorganisme yang
merupakan salah satu penyeab penyakit pada manusia. Dengan praktikum pembuatan media
diharapkan dapat menumbuhkan, mengisolasi dan menguji sifat fisiologi atau perhitungan
mikroorganisme tertentu.
BAB VPENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dalam pembuatan media harus dilakukan dengan baik dan benar supaya menghasilkan
perbanyakan tanaman banyak dan tidak terkontaminasi.
5.2 Saran
Sebaiknya dalam praktikum pembuatan media MS0 ini praktikan lebih hati-hati dalam
memegang alat atau yang lainnya soalnya kebanyakan alat-alatnya terbuat dari kaca yang
mudah pecah.
DAFTAR PUSTAKA
Epstein E. 1972. Mineral Nutrition of Plants. Principles and Perspectives. New York: John Wiley and Sons. Inc.
Hartmann HT, Kester DE. 1968. Plant Propagation, Principles and Practices. New York: Prentice Hall. Inc
Gamborg, O.L. 1995. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Dalam L.R. Wetter dan F. Constabel (Eds). Metode Kultur Jaringan Tanaman. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hal 1-13.
Gunawan, L. W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tanaman. Departemen Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor. 165 hal.
Dwijoseputro, 1990. Dasar-Dasar Mikorobiologi. Penerbit Djambatan. : Jakarta .
Indra., 2008, http//ekmon-saurus/bab-2-Media- pertumbuhan/.htm . diakses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar .
Label, Caray.,2008, http//Caray label makalah –dan – skripsi pembuatan-media- agar dan-sterilisasi/htm .diakses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar .
Pelczar, Michael, 1986, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Universitas Indonesia : Jakarta .
Volk, dan Wheeler., 1993, Dasar- Dasar Mikrobiologi, Erlangga : Jakarta .