preservasi dna genom manusia asal saliva dengan

PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA

DENGAN ANTIBIOTIKA DAN ANTIFUNGI

SKRIPSI

OLEH:

CHAIRUNNISA SIREGAR

170100243

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2021

Universitas Sumatera Utara

PRESERVASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA

DENGAN ANTIBIOTIKA DAN ANTIFUNGI

SKRIPSI

Diajukan sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar

Sarjana Kedokteran

OLEH:

CHAIRUNNISA SIREGAR

170100243

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2021


i


ii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim

Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-

Nya yang senantiasa menyertai penulis sehingga penelitian ini dapat diselesaikan

dengan baik. Shalawat dan salam penulis sampaikan kepada utusan-Nya, Nabi

Muhammad SAW. Semoga kelak kita mendapatkan syafa’at Beliau di hari akhir

nanti. Aamiin Aamiin yaa Rabbal’Alamiin.

Karya tulis ilmiah ini berjudul “Preservasi DNA genom manusia Asal

saliva dengan Antibiotika dan Antifungi” merupakan salah satu syarat kelulusan

pendidikan pada Program Studi Pendidikan dan Profesi Dokter, Fakultas

Kedokteran, Universitas Sumatera Utara. Dalam proses penyelesaian penelitian

ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dan dukungan baik moriil maupun

materiil dari berbagai pihak. Oleh sebab itu penulis ingin mengucapkan

terimakasih dan penghargaannya kepada:

1. Kepada ibunda dan ayahanda, atas cinta, kasih sayang, do’a, upaya, dan

pengorbanannya sehingga bisa mengantarkan penulis sampai pada titik ini.

Terimakasih juga kepada Abang Marihot Siregar dan Fachrurrozi Farraz Al-

khusein Siregar atas perhatian dan dukungannya selama ini kepada penulis

sehingga penulis tetap semangat untuk menjalani perkuliahan dan

menyelesaikan penelitian ini dengan baik dan tepat waktu.

2. dr. Zulham, M. Biomed, PhD selaku dosen pembimbing yang telah

membiayai penelitian, memberikan banyak arahan, masukan, dan motivasi

dalam membimbing penulis untuk dapat menyelesaikan skripsi ini dengan

baik.

3. dr. Ranti Permatasari, Sp.PK(K) selaku ketua penguji dan Dr. dr. Bintang

Y.M. Sinaga, M.Ked(Paru), SpP selaku dosen penguji yang telah banyak

memberikan masukan dan saran sehingga skripsi ini bisa menjadi lebih baik.

4. Teman- teman sejawat FK USU angkatan 2017 yang telah memotivasi dan

membantu terselesainya skripsi ini khususnya Lisa Yiha, Keni Yolani dan

Wudya yang selalu bersama-sama berjuang dalam belajar, saling

mendukung, memberikan motivasi, serta ilmunya kepada penulis.


iii

5. Sahabat penulis Nazla Azzahra dan Mowra Shanti Nayla yang selalu

mendengar keluh kesah penulis, memberi semangat dan selalu mendukung

segala impian penulis.

Penulis menyadari bahwa karya tulis ilmiah ini belum sempurna, baik dari

segi materi maupun tata cara penulisan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan

kritik dan saran yang membangun agar lebih baik. Semoga karya ilmiah ini

bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang

kedokteran.

Medan, 10 Desember 2020

Penulis

Chairunnisa Siregar

NIM. 170100243


iv

DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. I

KATA PENGANTAR ........................................................................................ II

DAFTAR ISI ...................................................................................................... IV

DAFTARGAMBAR .......................................................................................... VI

DAFTAR TABEL ............................................................................................ VII

DAFTAR SINGKATAN ............................................................................... VIII

ABSTRAK .......................................................................................................... IX

ABSTRACT .......................................................................................................... X

BAB I

PENDAHULUAN ................................................................................................ 1

1.1. LATAR BELAKANG ............................................................................... 1 1.2. RUMUSAN MASALAH .......................................................................... 2

1.3. TUJUAN PENELITIAN ........................................................................... 3 1.3.1. Tujuan Umum ..................................................................................... 3 1.3.2. Tujuan Khusus .................................................................................... 3

1.4. MANFAAT PENELITIAN ....................................................................... 3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 4

2.1. GENOM .................................................................................................... 4

2.2. SALIVA .................................................................................................... 5 2.3. FLORA NORMALSALIVA ..................................................................... 5

2.3.1. Bakteria ............................................................................................... 6 2.3.2. Fungi (Candidaalbicans) .................................................................... 7

2.4. DNASE DAN INHIBITOR DNASE ........................................................ 7 2.4.1. DNase .................................................................................................. 8 2.4.2. Inhibitor DNase ................................................................................... 9

2.5. ISOLASI DNA ........................................................................................ 11

2.6. PCR .......................................................................................................... 12

2.7. KERANGKA TEORI .............................................................................. 14

BAB III

METODE PENELITIAN ................................................................................. 15

3.2. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN ............................................... 15 3.2.1. Tempat Penelitian ............................................................................. 15 3.2.2. Waktu Penelitian ............................................................................... 15

3.3. SUBYEK UJI .......................................................................................... 15

3.4. PENGUMPULAN DAN PERLAKUAN SALIVA ................................ 15 3.5. ISOLASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA .......................... 16 3.6. KUANTITAS DAN KUALITAS DNA GENOM SALIVA ................... 17


v

3.7. PRIMER PCR .......................................................................................... 17

3.8. KONDISI PCR DAN VISUALISASI .................................................... 17 3.9. DIAGRAM ALUR PENELITIAN .......................................................... 18

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 19

4.1. HASIL PENELITIAN ............................................................................. 19 4.1.1. Ekstraksi DNA Asal Saliva ............................................................... 19 4.1.2. Kualitas DNA Hasil Ekstraksi .......................................................... 20 4.1.3. Pengaruh Gentamicin terhadap Kualitas DNA Genom Manusia Asal

Saliva ................................................................................................ 20 4.2. PEMBAHASAN ...................................................................................... 21

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 23

5.1. KESIMPULAN ....................................................................................... 23

5.2. SARAN .................................................................................................... 23

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 24

LAMPIRAN A ................................................................................................... 30

LAMPIRAN B ................................................................................................... 31

LAMPIRAN C ................................................................................................... 32

LAMPIRAN D ................................................................................................... 33


vi

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

3.1 Ekstraksi DNA Metode Spin-column…………….. 17

4.1 Hasil Elektroforesis Gel…………………………... 22

4.2 Hasil Elektroforesis PCR Gen Human β-actin…… 23


vii

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

Tabel 3.1 Kondisi PCR untuk ACTB……………………… 19

Tabel 4.1 Absorbansi, Kemurnian, dan Konsentrasi DNA

Asal Saliva………………………………………..

21


viii

DAFTAR SINGKATAN

CO2 :Karbondioksida

dATP :Deoksiadenosintrifosfat

dCTP :Deoksisitidintrifosfat

dGTP :Deoksiguanosintrifosfat

DNA :Deoxyribonucleicacid

dNTP :Deoksiribonukleotidatrifosfat

dTTP :Deoksitimidintrifosfat

Fe2+ :Besi

Mg2+ :Magnesium

MgCl : Magnesium klorida

mL :Mililiter

mM : Milimolar

PCR : Polymerase chain reaction

TNE : Tris-NaClEDTA

μL : Mikroliter

μM :Mikromolar


ix

ABSTRAK

Latar belakang: Genom merupakan satu set DNA lengkap dari suatu organisme. Preservasi

DNA genom akan melindungi dan menyimpan DNA agar tahan lama dalam wadah

penyimpanansehingga DNA dapat digunakan sewaktu-waktu. Saliva mengandung sel manusia

dari rongga mulut dan flora normal seperti bakteri, fungi, dan mungkin amoeba. Penggunaan

antibiotika dan antifungi dapat mematikan flora normal sekaligus melindungi DNA genom

manusia dalam saliva. Selain itu, antibiotika seperti gentamisin mampu menghambat aktivitas

DNase dalam saliva. Tujuan: Penelitian ini mengkaji cara mempreservasi DNA saliva untuk

jangka waktu 14 hari. Metode: Penelitian eksperimental ini menggunakan desain pretest and

posttest. Saliva dikumpul dengan meludah kedalam pot saliva. Saliva dipreservasi dengan

konsentrasi akhir 1500 µg/mL gentamisin dan 100 µM ketoconazol dan disimpan pada suhu

ruang dalam variabel waktu 0, 3 , 7, 10, dan 14 hari.Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode

spin-column. Kuantitas dan kemurnian DNA diukur dengan spektrofotometri. Keberadaan DNA

genom manusia ditentukan dengan PCR pada gen ACTB. Hasil: Rata-rata konsentrasi DNA

saliva adalah 1,50+3,43 µg/mL (1,46-30,6 µg/mL). Rata-rata kemurnian DNA hasil ekstraksi

adalah 1,67+1,72 (1,58-1,84). Elektroforesis gel hasil PCR menunjukkan band 335 bpgen ACTB

pada lama preservasi 0 dan 3 hari, dan band 300 bp pada lama preservasi 10 dan 14 hari.

Kesimpulan: Kuantitas dan kualitas DNA saliva hasil ektraksi adalah cukup bagus. Pemberian

gentamisin dan ketoconazol kepada saliva dapat mengawetkan DNA genom manusia asal saliva.

Kata kunci : DNA,Genom, Preservasi,Saliva.


x

ABSTRACT

Background: The genome is a complete set of DNA in an organism. DNA preservation will

protect and provide DNA for long term storage in a container so that DNA can be used at any

time. Saliva contains human cells from oral mucosa. Saliva contains epithelial cells and

leucocytes, along with normal flora such as bacteria, fungi, and possibly amoeba. Antibiotics

and anti-fungi can kill normal flora while protecting the human genomic DNA in saliva. In

addition, antibiotics such as gentamicin can inhibit DNase activity in saliva. Objective: This

study examines how to preserve salivary DNA for a period of 14 days. Methods: This

experimental study used a pretest and posttest design. Saliva is collected by spitting into a saliva

pot. Saliva was preserved with a final concentration of 1500 µg/mL gentamicin and 100 µM

ketoconazole and stored at room temperature for time variables of 0, 3, 7, 10, and 14 days. DNA

extraction was carried out using the spin-column method. The quantity and purity of DNA is

measured by spectrophotometry. The presence of human genomic DNA was determined by PCR

on the ACTB gene.Results: The mean salivary DNA concentration was 1.50 + 3.43 µg/mL (1.46-

30.6 µg/mL). The mean purity of the extracted DNA was 1.67 + 1.72 (1.58-1.84). The gel

electrophoresis of PCR ampliconsshowed 335 bp bands of ACTB gene at 0 and 3 days of

preservation, and 300 bp bands at 10 and 14 days of preservation. Conclusion: The quantity and

quality of extracted salivary DNA is quite good. Gentamicin and ketoconazole addition to saliva

can preserve the human genomic DNA from saliva.

Keywords: DNA,Genome, Preservation,Saliva.


1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANG

Genom merupakan satu set deoxyribonucleic acid (DNA) lengkap dari

suatu organisme. Genom mengandung semua informasi yang diperlukan untuk

membentuk dan menjalankan fungsi organisme. Dalam satu sel manusia,

setidaknya ada 3 milyar pasangan DNA, dan semuanya ini terdapat di dalam

nukleus (Marwayana, 2015).

DNA merupakan kode genetik yang membuat keunikan individu. DNA

berbentuk seperti pasangan dari dua pita panjang yang terpuntir (double helix).

Masing-masing pita merupakan susunan dari unit bernama basa. Terdapat empat

jenis basa DNA yaitu adenine (A), cytosine (C), guanine (G), dan thymine (T); A

berikatan dengan T sementara G berikatan dengan C. Ikatan ini membentuk

struktur menyerupai tangga di antara pita DNA. Urutan dari unit basa itulah yang

menjadi kode genetik, yakni instruksi dari semua fungsi tubuh seluruh makhluk

hidup (Siswanto et al., 2016).

Preservasi adalah kegiatan untuk mengumpulkan, melestarikan bahan

penelitian. Tujuan preservasi DNA adalah menyediakan, melindungi,

mengumpulkan, dan menyimpan DNA agar tahan lama pada wadah

penyimpanan sehingga DNA dapat terjaga selamanya dan dapat digunakan

sewaktu-waktu. Faktor jauhnya jarak sumber DNA dengan fasilitas biologi

molekuler atau waktu yang lama dalam pengiriman sampel DNA dapat menjadi

masalah isolasi DNA karena deteriorasi sampel yang dapat terjadi secara cepat

dan munculnya senyawa inhibitor maupun senyawa/organisme yang merusak

DNA sehingga memengaruhi kualitas dan kuantitas DNA (Nejat dan Vadamalai,

2013).

Sampel DNA yang sering digunakan dalam penelitian adalah darah.

Konsentrasi DNA dalam darah dapat mencapai 10-15 µg/mL darah.

Pengambilan sampel DNA dari darah terkadang kurang disukai karena

venipuncture dapat menimbulkan penularan penyakit, membutuhkan tenaga ahli


2

untuk pengambilan sampel (Quinque et al., 2006), dan invasif (Cascella et al.,

2015). Faktor penting lain yang perlu dipertimbangkan ketika menggunakan

sampel darah adalah adanya ion besi (Fe2+) yang bersaing dengan ion Mg2+, yang

dapat menghambat polymerase chain reaction (PCR) (Aidar dan Line 2007).

Selain itu, mungkin ada hambatan budaya untuk mengekstraksi darah, dan

perawatan luar biasa dilakukan ketika mengirim sampel darah dari lokasi yang

berbeda. Terakhir, menganalisis DNA genom dari penerima transplantasi

sumsum tulang tidak mungkin dilakukan (Hosono et al., 2003).

Saliva mengandung sel manusia dari lapisan mulut (Quinque et. al.,

2006). Pelepasan lapisan superfisial sel epitel pada mukosa mulut manusia yang

terjadi kira-kira setiap 2,7 jam akhirnya mengarah ke saliva. Saliva terdiri dari ~

75% sel epitel (~ 430.000 sel/mL5) dan ~ 25% leukosit (2 hingga 136.000

sel/mL). Selain sel dari individu itu, saliva mengandung berbagai flora normal

seperti bakteri, fungi, dan mungkin amoeba (Thiede et al., 2000). Küchler et al.

(2012) mengevaluasi hasil dan kualitas DNA genom yang diperoleh dari saliva

segar dan saliva yang disimpan selama 4 dan 8 hari pada suhu kamar. Tidak ada

perbedaan signifikan antara periode penyimpanan yang berbeda. Pembekuan

mungkin berpengaruh terhadap penyimpanan DNA jangka panjang, yang

merupakan kepentingan mendasar bagi penciptaan sebuah bank saliva di pusat-

pusat penelitian besar.

Penelitian ini mengkaji cara mempreservasi DNA saliva untuk jangka

waktu 14 hari dengan menghambat senyawa/organisme dalam saliva yang

mungkin merusak DNA genom manusia seperti bakteri, fungi, dan Dnase.

Gentamisin berfungsi untuk menghambat aktivitas DNase (McGuire et al., 2015)

dan juga mampu membunuh bakteria/flora normal dalam saliva (Pereira, 2015).

Pada konsentrasi di atas 35 μg/mL gentamisin menyebabkan penghambatan

aktivitas DNase secara parsial (McGuire et al., 2015).

1.2. RUMUSAN MASALAH

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Apakah gentamisin sulfat dapat mempreservasi DNA manusia dalam saliva?


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5393535/#B16

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5393535/#B16

3

2. Bagaimana hasil validasi DNA saliva hasil preservasi dengan PCR?

1.3. TUJUAN PENELITIAN

1.3.1. Tujuan Umum

Mempreservasikan DNA genom manusia yang berasal dari saliva.

1.3.2. Tujuan Khusus

Tujuan penelitian khusus adalah sebagai berikut:

1. Menentukan kuantitas DNA genom manusia asal saliva hasil preservasi

dengan spektrofotometer.

2. Menentukan kemampuan gentamisin sulfat mempreservasi DNA genom

manusia asal saliva.

3. Menentukan kualitas DNA saliva hasil preservasi dengan elektroforesis gel

agarosa dan PCR.

1.4. MANFAAT PENELITIAN

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk pembuatan kit

koleksi DNA saliva jangka lama dan bank DNA berasal dari saliva.


4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. GENOM

Genom adalah keseluruhan informasi genetik (asam nukleat) yang

dimiliki suatu sel (Alberts et al., 2002). Secara fisik genom dapat terbagi

menjadi molekul- molekul asam nukleat yang berbeda (kromosom atau plasmid)

sementara secara fungsi genom dapat terbagi menjadi gen-gen (Lewin, 2008).

Setiap organisme memiliki genom yang diperlukan untuk membangun tubuhnya,

mempertahankan hidupnya, dan diwariskan ke generasi berikutnya. Dengan

sejumlah interaksi kompleks, urutan nukleotida komponen penyusun asam

nukleat digunakan untuk membuat semua protein pada suatu organisme pada

waktu dan tempat yang sesuai (Brown, 2002).

Kebanyakan genom manusia dan makhluk hidup bersel, eukaryota dan

prokaryota lainnya, terbuat dari DNA, namun sejumlah virus memiliki genom

RNA (Brown, 2002). Saat ini sekuens (urutan) nukleotida pada genom sejumlah

organisme telah dipetakan seluruhnya dengan teknik sekuensing, dengan urutan

DNA manusia diselesaikan dalam proyek genom manusia pada tahun 2003.

Perbandingan genom organisme dapat memberikan informasi mengenai

karakteristik, evolusi, dan berbagai proses biologi organisme tersebut (Campbell,

2008).

Genom prokariotik (contohnya bakteri) biasanya berupa molekul tunggal

dsDNA sirkuler dengan tambahan DNA ekstra kromosom berupa plasmid

sirkuler. Istilah genom (nuclear genom) nukleus pada eukaryota mengacu pada

informasi genetik berupa kromosom dan kadang juga berupa fragmen DNA

ekstra kromosom didalam nukleus.

Genom ekstranuklear sel eukoriotia mencakup genom mitokondria dan

kloroplas yang berupa molekul dsDNA sirkuler. Kebanyakan prokariota

memiliki satu kromosom saja karena prokariota umumnya mengandung satu

salinan setiap gen dan dengan demikian bersifat haploid. Eukariota umumnya

memiliki dua salinan setiap gen dan secara genetik bersifat diploid


5

(Madigan et al., 2010). Ada pula organisme pada tumbuhan yang memiliki lebih

dari dua set kromosom dalam nucleus atau disebut bersifat poliploid (Campbell

et al.,2008).

2.2. SALIVA

Saliva adalah cairan oral yang kompleks, terdiri dari campuran sekresi

yang berasal dari kelenjar ludah besar (mayor) dan kecil (minor) yang ada pada

mukosa oral (Kidd dan Bechal, 1992). Saliva tersusun dari 75% sel epitel

(430,000 sel/ mL dan 25% leukosit (2 hingga 136.000 sel/ mL) tergantung pada

kesehatan mulut setiap individu. Terdapat sekitar 58% dari sel epitel dalam

sampel air liur yang dikumpulkan (Kidd dan Bechal, 1992).

Dawes (2003) menunjukkan bahwa air liur memiliki 430.000 sel

epitel/mL, dan rata-rata setiap sel epitel memiliki sekitar 80-100 bakteri yang

menempel. Setiap satu mL saliva mengandung campuran DNA dari sel epitel,

leukosit dan 1,7 x 107 bakteri dan mikroorganisme lain di rongga mulut.

Komponen lain dari saliva adalah enzim, hormon, imunoglobulin, dan

biomolekuler lainnya yang dapat mengganggu kualitas dan kuantitas DNA

genom pada proses ekstraksi DNA (Choo et al., 2006).

2.3. FLORA NORMAL SALIVA

Flora normal adalah sekumpulan mikroorganisme yang hidup pada kulit

dan selaput lendir/mukosa manusia yang sehat maupun sakit. Pertumbuhan flora

normal pada bagian tubuh tertentu dipengaruhi oleh suhu, kelembaban, nutrisi

dan adanya zat penghambat. Keberadaan flora normal pada bagian tubuh tertentu

mempunyai peranan penting dalam pertahanan tubuh karena menghasilkan suatu

zat yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Adanya flora normal

pada bagian tubuh tidak selalu menguntungkan. Dalam kondisi tertentu flora

normal dapat menimbulkan penyakit (Brooks et al., 2008).

Interaksi flora normal dapat berupa mutualisme maupun komensalisme.

Flora normal berperan menutupi tempat penempelan potensial untuk invasi

mikroba patogen, resistensi kolonisasi, menempati lingkungan mikro secara


6

lebih efektif daripada pathogen, memproduksi nutrisi (vitamin K, asam folat,

pyridoxine, biotin, riboflavin), sebagai komensal, dan menghasilkan senyawa

yang beracun untuk mikroorganisme lainnya (Vasanthakumari,2007).

Jenis flora normal dalam saliva berbentuk bakteria, fungi, dan amoeba.

Jenis bakteri dalam saliva diantaranya Streptococcus mutans/Streptococcus

viridans, Staphylococcus sp dan Lactobacillus sp (Jawetz, 2005). Pada keadaan

tertentu bakteri-bakteri tersebut bisa berubah menjadi patogen karena adanya

faktor predisposisi yaitu kebersihan rongga mulut. Sisa-sisa makanan dalam

rongga mulut akan diuraikan oleh bakteri yang menghasilkan asam. Bakteri flora

normal mulut bisa masuk aliran darah melalui gigi yang berlubang atau karies

gigi dan gusi yang berdarah sehingga terjadi bakteremia (Harvey, 2007).

2.3.1. Bakteria

Streptococcus mutans/Streptococcus viridans

Streptococcus viridians memiliki karakteristik coccus, susunan berderet,

tidak berflagel, tidak berspora, tidak berkapsul, gram positif. Morfologi koloni

pada media agar darah memiliki karakterisitik berupa koloni bulat, ukuran 1-2

mm, tidak berwarna (jernih), permukaan cembung, tepi rata, dan membentuk

hemolisa α, Sifat fisiologinya antara lain anaerob fakultatif, tumbuh baik pada

suasana CO2 10% dan suhu 37°C, resisten terhadap optochin, dan tidak larut

dalam empedu. Contoh spesies Streptococcus lainnya adalah Streptococcus β

hemolyticus dan Streptococcus γ hemolyticus (Brooks et al., 2008).

Staphylococcus sp.

Genus Staphylococcus terdiri dari sekurangnya 30 spesies. Tiga spesies

utama yang penting secara klinik adalah S. aureus, Staphylococcus epidermis,

dan Staphylococcus saprophyticus. S. aureus merupakan bentuk koagulasi

positif. Hal ini membedakannya dengan spesies lain (Brooks et al., 2008).

S. aureus adalah bakteri Gram positif yang menghasilkan pigmen kuning,

bersifat aerob fakultatif, tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya

tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter sekitar 0,8-1,0 µm.


7

S. aureus tumbuh dengan optimum pada suhu 37C dengan waktu

pembelahan 0,47 jam. (Brooks et al., 2008). Bakteri ini berbentuk sferis, bila

berkumpul dalam susunan yang tidak teratur mungkin sisinya agak rata karena

tertekan. Pada sediaan langsung yang berasal dari nanah, S. aureus dapat terlihat

sendiri, berpasangan, berkumpul dan bahkan tersusun seperti rantai pendek.

Susunan gerombolan yang tidak teratur biasanya ditemukan pada sediaan yang

dibuat dari pembenihan padat, sedangkan dari pembenihan kaldu biasa

ditemukan tersendiri atau tersusun sebagai rantai pendek (Brooks et al., 2008).

Lactobacillus sp.

Morfologi sel dari Lactobacillus berbentuk batang pendek, tidak

berspora, tidak berflagel, tidak berkapsul dan Gram positif. Morfologi koloni

pada media agar darah berbentuk koloni bulat kecil, warna putih susu, cembung,

tepi rata dan permukaan mengkilap. Sifat fisiologi dari Lactobacilus bersifat

anaerob fakultatif, dengan suhu optimal 45oC, mereduksi nitrat menjadi nitrit,

memfermentasi glukosa, laktosa dan sakarosa, dan tidak mempunyai enzim

katalase. Contoh spesiesnya adalah Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus

lactis, dan Lactobacillus casei.

2.3.2. Fungi (Candida albicans)

Candida albicans merupakan jamur terbanyak yang terisolasi dari tubuh

manusia sebagai flora normal dan penyebab infeksi oportunistik (Hakim et.al.,

2015). Candida albicans terdapat sekitar 30-40% pada rongga mulut orang

dewasa sehat, 45% pada neonatus, 45-65% pada anak-anak sehat, 50-65% pada

pasien yang memakai gigi palsu lepasan, 65-88% pada orang yang

mengkonsumsi obat- obatan jangka panjang, 90% pada pasien leukemia akut

yang menjalani kemoterapi, dan 95% pada pasien HIV/AIDS (Williams dan

Lewis, 2011).


8

2.4. DNASE DAN INHIBITOR DNASE

2.4.1. DNase

Deoxyribonucleases (DNase) merupakan kelas enzim yang memiliki sifat

heterogen yang dapat mengkatalisis hidrolisis DNA. Dua jenis utama DNase

adalah DNase I dan DNase II, keduanya memiliki endonuklease yang

menghasilkan 30 oligonukleotida dan 50 oligonukleotida. Pembelahan

DNase1L1 terjadi pada membran melalui glikosilfosfatinositol. Dnase1L2

bekerja secara intraseluler selama diferensiasi keratinosit. Dnase1L3 pada

intraseluler dan memiliki peran yang lebih lemah dari pada ekstraseluler.

Keluarga DNase I pada manusia terdiri dari empat DNase yaitu: DNase I,

DNAse X, DNase g dan DNAS1L2. DNase I, DNase X, dan DNase g adalah

endonuklease netral yang menunjukkan aktivitas maksimumnya pada pH netral

(masing-masing 6,8, 6,8, dan 7,2), sedangkan DNAS1L2 adalah endonuklease

asam yang menunjukkan aktivitas maksimum pada pH rendah (Tsuruta et al.,

2008). DNase I adalah endonuclease yang bergantung pada Ca2+/Mg2+dalam

aktivitasnya. Setelah akuisisi domain terminal, DNase g dan DNase X

dipertahankan secara intraseluler namun DNase I atau DNAS1L2 yang

dikeluarkan ke ekstraseluler (Shiokawa et al., 2001). Berdasarkan struktur

kiminya, semua DNases I adalah golongan glikoprotein.

Berdasarkan distribusi jaringan, terdapat tiga jenis DNase I pada

mamalia. Jenis DNase I yang pertama terdapat pada pankreas manusia dan babi.

Disebut sebagai tipe pankreas karena memiliki aktivitas DNase I tertinggi dalam

pankreas. Jenis ini lebih sensitif terhadap nilai pH rendah dari pada jenis DNase I

lainnya. Jenis DNase I yang kedua terdapat pada kelenjar parotis tikus dan

disebut tipe parotis karena memiliki aktivitas tertinggi di kelenjar parotis. Jenis

DNase I ketiga terdapat pada sapi dan kelinci dan disebut jenis parotis pankreas

(tipe campuran) karena aktivitas DNase I tertinggi terdapat pada kelenjar

pankreas dan parotis (Takeshita et al., 2000).

Keluarga DNaseII terdiri dari DNase yang sangat homolog dengan

distribusi jaringan lisosom dan optimal pada pH rendah tanpa kation divalen.

Enzim DNaseII memiliki fungsi dalam proses degradasi DNA yang diperantarai


9

oleh engulfment sebagai mekanisme utama penghancuran DNA (Evans et al.,

2003). L-DNase II merupakan enzim yang terlibat dalam apoptosis yang berasal

dari leucocyte elastase inhibitor (LEI) babi, protein dari keluarga super serpin.

LEI dalam bentuk asli, tidak mendegradasi DNA karena aktivitasnya sebagai

anti- protease. Selama apoptosis, penurunan pH intraseluler menginduksi

modifikasi pasca translasi LEI yang melibatkan perubahan berat molekul LEI,

diikuti oleh hilangnya aktivitas anti-protease, dan kemunculan aktivitas L-DNase

II. Hal ini mengarah pada aktivitas degradasi dua jalur yang terlibat dalam

apoptosis: jalur protease dan nuklease (Torriglia et al., 1998).

DNase I dan DNase II diekspresikan dalam jumlah terbatas

dalamjaringan. Hal ini disebabkan karena sifat enzimatik protein, tingkat

ekspresi yang lebih rendah bisa relevan secara biologis. DNase I paling banyak

diekspresikan dalam sel-sel eksokrin saluran pencernaan. DNase I juga

didapatkan di darah dengan terutama disekresikan oleh sel-sel myeloid untuk

membantu membersihkan DNA bebas dari peredaran darah (Sisirak et al., 2016).

Sumber utama DNaseIL3 terdapat pada sel myeloid hati dan limpa (Keyel,2017).

2.4.2. Inhibitor DNase

DNase merupakan enzim yang penting untuk fungsi sel normal dan

apoptosis. Aktivitas optimal DNase dikendalikan oleh inhibitor DNase yang

terdapat dalam sel. Peningkatan atau penurunan aktivitas inhibitor DNase

menyebabkan perubahan dalam proses metabolisme yang mengarah pada

pengembangan berbagai penyakit. Banyak senyawa dapat bertindak sebagai

inhibitor DNase. Mereka berbeda dalam asal organism (manusia, hewan,

tumbuhan, dan mikroorganisme), sintetis, struktur kimia, efisiensi, kekuatan, dan

selektivitas.

Terdapat beberapa jenis dari inhibitor DNase, diantaranya adalah sebagai

berikut (Kolarevic et.al,2014):

1. Natural DNase inhibitors

a. Natural DNase Iinhibitors, telah diisolasi dari berbagai macam sumber:

manusia: somatostatin, kolesterol sulfat bersamaan dengan asam empedu,


10

inhibitor dalam leukosit, dan protein dari sel KB (Iwamori, 2000); (2)

hewan: aktin, anti sera anti-DNase, protein dari limpa, dan timus (Liu

etal., 1997);(3) mikroorganisme: antibiotik yang diisolasi dari bakteri

genus Streptomyces (aktinomisin D, nogalamisin, daunomisin, neomycin

B, paromomycin, dan gentamicin), dan metabolit dari Micromonospora

echinospora; (4) tanaman: protein dari sel Nicotianatabacum

(Woegerbauer et al., 2000).

b. Natural DNase II inhibitors, protein ini ditemukan pada jaringan hewan

dan beberapa senyawa nukleotida dan metabolit mikroorganisme.

c. Natural DFF40/CAD inhibitors, beberapa senyawa yang terbentuk

secara alami, seperti DFF45/ICAD, DFF35/ICADS, kompleks Akt/Ebp1

dan curcumin, mampu menghambat DFF40/CAD dan dengan demikian

mencegah fragmentasi DNA selama apoptosis. Inhibitor homolog dengan

ICAD telah diidentifikasi dalam ekstrak telur Xenopus laevis dan sel D.

melanogaster (DREP-1/dICAD).

d. Natural DNase inhibitors lainnya. Berbagai senyawa dari

mikroorganisme menunjukkan efek penghambatan terhadap DNase.

Beberapa vitamin juga dapat memengaruhi aktivitas DNase (Taper,

2008).

2. Synthetic DNase inhibitors

a. Synthetic DNase I inhibitors, beberapa turunan dari asam 2-nitro-5-

thiobenzoic, hydroxybiphenyls, nitrogen mustard, crystal violet, dan

beberapa polyelectrolytes anionik ditemukan bertindak sebagai inhibitor

DNase I (Zhou etal., 2012).

b. Synthetic DNase g inhibitors. Berbagai turunan triazine menunjukkan

efek penghambatan terhadap DNaseg (Sunaga et al., 2004).

c. Synthetic DNase II inhibitors, beberapa poli elektrolitanionik (PES,

HEMA dan amoniak etilen maleat anhidrida) dalam jumlah 10 mg

mampu sepenuhnya menghambat aktivitas DNase II pada pH 5.0.

3. Inorganic DNase inhibitors

Inorganic DNase inhibitors dapat bersumber dari ion emas Au (III) yang

menunjukkan efek penghambatan terhadap DNase I pada pH netral. Aktivitas


11

DNase I dihambat oleh 10 ekuivalen molar ion Au (III) diikuti oleh

perubahan konformasi DNase. Ion Au (III) adalah oksidan kuat, namun

DNase I tidak teroksidasi olehnya, tetapi dikomplekskan dengan ion Au (III)

sehingga kehilangan aktivitasnya (Maruyama et al., 2007).

2.5. ISOLASI DNA

Ekstraksi DNA merupakan upaya mendapatkan DNA dari sel/virus.

Secara umum, ekstraksi DNA meliputi beberapa tahapan proses mulai tahap

persiapan hingga akhirnya diperoleh ekstrak DNA yang dilarutkan dalam larutan

dapar Tris-EDTA (TE). Larutan dapar TE digunakan untuk menyimpan dan

mempertahankan kondisi DNA secara kualitatif dan kuantitatif dalam jangka

waktu yang relatif lama. Secara kualitatif berarti larutan TE harus

mempertahankan kualitas DNA TE terlarut dalam kondisi baik. Secara

kuantitatif berarti larutan TE harus mempertahankan jumlah DNA dalam jumlah

tetap (tidak terdegradasi) dan dapat digunakan dalam proses selanjutnya tanpa

mengalami penurunan kuantitas DNA.

Proses ekstraksi DNA dimulai dari persiapan sampel, pemilihan metode

ekstraksi yang tepat, hingga didapatkan ekstrak DNA. Proses isolasi DNA

genom dilakukan dengan mengambil dari semua bahan biologis yang

mengandung nuklei seperti darah, semen, saliva, otot, rambut, tulang, dan lain-

lain. Bahan yang paling mudah digunakan untuk isolasi DNA adalah saliva

karena saliva relatif mudah diperoleh. Prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan

DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein

dan karbohidrat (Phillips et al.,2012).

Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik

dan kimia. Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan mekanik yaitu secara freeze

thaw, bead mill homogenization, dan resonansi (misalnya dengan

sonikasi).Secara kimia sel dirusak dengan larutan dapar lisis berisi senyawa

kimia yang dapat merusak integritas membran sel seperti fenol dan

cetyltrimethylammonium bromide (Cheng et al., 2003).

Kualitas DNA genom yang baik merupakan hal penting yang dibutuhkan

dalam aplikasi biologi molekuler. Keberhasilan isolasi DNA dapat diukur


12

melalui dua proses: 1) pengecekan keberadaan band DNA dengan metode

elektroforesis atau 2) pengukuran konsentrasi DNA terlarut dengan metode

spektrofotometri (Phillips et al., 2012). DNA menyerap cahaya UV pada 260

nm, sedang kontaminan protein dalam larutan fenol menyerap cahaya pada 280

nm. Kemurnian DNA diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi

dengan nilai absorbansi 280 (A260/A280). DNA yang murni memiliki rasio

A260/A280 antara 1,8-2,0 (Fatchiya et al., 2011).

2.6. PCR

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk

mengamplifikasi secara eksponensial suatu segmen DNA secara in vitro

(Yuwono, 2006). Amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR menyebabkan

analisis DNA pada sampel biologis hanya membutuhkan sedikit sampel.

Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi tersebut dapat dilakukan

dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya

DNA cetakan sekitar 5 ng, primer hanya 1 mM, dan reaksi tersebut biasa

dilakukan dalam volume 25-50 μL (Yuwono,2006).

Lima komponen utama pada PCR adalah: (1) DNA cetakan yaitu

fragmen DNA yang akan diamplifikasi, (2) primer, yaitu suatu sekuen nukleotida

pendek (15-20 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai

DNA, (3) enzim Taq DNA polimerase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi

sintesis rantai DNA, dan (4) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri

atas deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), dCTP

(deoksisitidin trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat), dan (5) MgCl2.

Primer oligonukleotida akan membentuk basa komplemen yang spesifik

dengan DNA cetakan. dATP akan membentuk basa nukleotida adenin, dTTP

akan membentuk basa komplemen timin, dCTP akan membentuk basa

komplemen sitosin, dan dGTP akan membentuk basa komplemen guanin

(Yuwono, 2006).

Siklus PCR rutin terdiri atas tiga tahap utama yaitu denaturasi, annealing

primer, dan ekstensi. Denaturasi merupakan pemisahan DNA untai ganda


13

menjadi untai tunggal yang dilakukan pada suhu 90-95oC. Annealing merupakan

pelekatan primer pada kedua untai tunggal DNA pada suhu 50-60oC. Beberapa

peristiwa yang terjadi pada tahap annealing yaitu pelekatan primer pada situs

yang tepat, pelekatan DNA polimerase sehingga terjadi pembentukan beberapa

basa, dan terbentuknya ikatan hidrogen yang sangat kuat antara primer dan DNA

cetakan (Russel, 1994). Ekstensi dilakukan pada suhu 72oC dengan Taq

polymerase memanjangkan segmen DNA yang diamplifikasi. Panjang siklus

PCR biasanya 35 siklus. Pasca PCR, suhu dipertahankan pada 4oC.


14

Pengumpulan

Saliva

Antibiotika dan

Antifungi

Penghambat

Flora Normal

dan DNase

Isolasi

DNA

Kualitas DNA

manusia saliva

hasil

preservasi.

2.7. KERANGKATEORI

2.8.KERANGKAKONSEP


15

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. RANCANGAN PENELITIAN

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik.

Rancangan penelitian yang digunakan adalah pretest and posttest.

3.2. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN

3.2.1. Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu, Fakultas Kedokteran,

Universitas Sumatera Utara.

3.2.2. Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli-September 2020.

3.3. SUBYEK UJI

Subjek dalam penelitian ini adalah mahasiswa. Jumlah subjek ditetapkan

5 orang. Setelah mendapatkan penjelasan, semua calon subjek uji diminta untuk

mengisi dan menyetujui surat persetujuan pasien (informed consent) untuk

menjadi subjek penelitian. Persetujuan etika atas penelitian ini diberikan oleh

Komite Etik Penelitian USU melalui Surat No. 383/KEP/USU/2020 (Lampiran

B).

3.4. PENGUMPULAN DAN PERLAKUAN SALIVA

Pengumpulan saliva dilakukan pada pagi hari. Sebelum pengumpulan

saliva subjek diinstruksikan untuk tidak makan dan minum selama 90 menit.

Subjek diminta untuk duduk dengan nyaman dan berkumur dengan listerine™

untuk membersihkan sisa makanan terlebih dahulu. Selanjutnya, subjek

meludahkan salivanya ke dalam pot saliva. Pengumpulan saliva dilakukan


16

sebanyak 2 kali untuk masing-masing subjek. Pengumpulan saliva kedua

dilakukan 5 menit dari pengambilan saliva pertama. Saliva yang dikumpulkan

minimal bervolume 40 mL untuk setiap subjek. Saliva yang telah tertampung

dalam pot saliva ditutup dengan penutup pot saliva kemudian dibawa ke

laboratorium untuk dilakukan preservasi dan pengujian DNA genom.

Saliva yang dikumpulkan dibagi menjadi 5 kelompok: segar (H0),

penyimpanan 3 hari (H3), penyimpanan 7 hari (H7), penyimpanan 10 hari (H10),

penyimpanan (H14). Setiap kelompok akan diberi 1500 μg/mL gentamisin sulfat

dan 100 μM ketoconazol H0 akan segera menjalani proses ekstraksi DNA. H3,

H7, H10, H14 disimpan dalam suhu ruang yaitu 25oC.

3.5. ISOLASI DNA GENOM MANUSIA ASAL SALIVA

Sebanyak 2 mL sampel saliva disentifugasi pada kecepatan 3000 g

selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet

diambil untuk digunakan dalam isolasi DNA.

Isolasi DNA dilakukan dengan metode spin column (Gambar 3.1). Pelet

dilarutkan dalam 640μL dapar lisis (mengandung 200 μL larutan resuspensi, 200

μL larutan lisis, 20 μL proteinase K,20 μL RNase, dan 200 μL ethanol). Pelet

dilarutkan dengan 200 μL larutan resuspensi kemudian ditambah 200 μL larutan

lisis dan dicampurkan menggunakan vortex, setelah itu ditambah 20 μL

Proteinase K lalu diinkubasi pada 55°C selama 2 jam, 20 μL RNase ditambahkan

dan ditunggu 2 menit. Tambahkan 200 μL ethanol kemudian vortex untuk

mencampur sebelum larutan dipindahkan , terlebih dahulu tambahkan 500 μL

column prepare solution untuk membersihkan binding column dan di

sentrifugasi >6500 g selama 1 menit setelah itu pindahkan 640 μL ke binding

column dan disentrifugasi pada kecepatan >6500 g, pada suhu ruang selama 1

menit kemudian pindahkan binding column ke tabung pengumpulan yang baru.

Tambahkan 500 μL column wash solution kemudian sentrifugasi >6500 g selama

1 menit. Pindahkan binding column ke tabung yang baru dan ditambahkan 500

μL column wash solution yang kedua dan di sentrifugasi dengan kecepatan

>12.000 g selama 3 menit untuk mengeringkan binding column. Setelah itu

disimpan dalam suhu-20°C.


17

Gambar 3.1 Ekstraksi DNA Metode Spin-column

3.6. KUANTITAS DAN KUALITAS DNA GENOM SALIVA

Kuantitas dan Kemurnian DNA ditentukan pada kelompok H0, H3, H7,

H10, H14) menggunakan spektrofotometer Multiskan Go (Thermo Scientific).

Kualitas DNA ditentukan dengan cara elektroforesis gel agarosa dan PCR

terhadap hasil ekstraksi DNA saliva semua kelompok. Elektroforesis DNA

dilakukan dengan agarose gel 2% pada 80V, 400 mA selama 60 menit . Pada

masing-masing lane telah diisi 10 µL DNA hasil ekstraksi dari subjek H-7.

Elektroforesis dilakukan dalam agarose gel 2%. PCR dilakukan terhadap gen

beta globin (ACTB).

3.7. PRIMER PCR

Primer beta globin (Gene Bank Acession Number AH001475.2) didesain

menggunakan software Primer-BLAST. Primer dibeli dari perusahaan First base.

Panjang amplicon yang diperkirakan adalah 335 bp.

Forward primer GTATCATGCCTCTTTGCACCATT

Reverse primer TGATAGGTGTGGCTGCACTGG

3.8. KONDISI PCR DAN VISUALISASI

PCR dilakukan dengan menggunakan campuran reaksi PCR yang

mengandung 9,13μL (H0), 5,83μL (H3), 6,64μL (H7), 3,89μL (H10), 7,30μL

(H14) DNA genom saliva sebagai DNA template, 0,5 μM untuk setiap primer,

KAPA2G 25μL, dan ddH20 14,87μL (H0), 18,17 μL (H3), 17,36μL (H7),


18

• Penyimpanan sampel saliva dengan

tambahan gentamisin sulfat dan

ketoconazole pada suhu ruang

• Ekstraksi DNA saliva dan PCR.

• Penilaian kuantitas dan kualitas DNA

saliva segar dan hasilpenyimpanan.

• Pengumpulan saliva

• Koleksi DNA saliva jangka lama

Bank DNA saliva

3,89μL (H10), 7,30μL (H14). PCR dijalankan dengan langkah denaturasi awal

pada 94oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus PCR terdiri dari 94oC

selama 2 menit, annealing pada 58oC selama 1 menit, ekstensi pada 72oC selama

30 detik, dan dihentikan pada suhu 4oC (Tabel 3.1). Pasca PCR, amplicon gen

beta globin divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 2% dan etidium

bromida dengan kondisi 80 V, 60 menit, dan 400 mA. Rekaman dari run gel

agarosa dibuat menggunakan geldoc.

Tabel 3.1 Kondisi PCR untuk ACTB

Kondisi Suhu (oC) Waktu

Denaturasi awal 94 5 menit

Denaturasi 94 2 menit

Annealing 58 1 menit

Extension 72 30 detik

Denaturasi akhir 72 2 menit

3.9. ALUR PENELITIAN

Proses

Input

Output


19

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. HASILPENELITIAN

4.1.1. Ekstraksi DNA Asal Saliva

Seluruh saliva diisolasi berdasarkan lama penyimpanan. DNA untuk

kontrol (H0) segera diekstraksi setelah pemberian gentamicin dan ketoconazol.

Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh bervariasi dalam lama

penyimpanan dan subjek sumber saliva (Tabel 4.1). Rata-rata konsentrasi DNA

adalah 1,50+3,43 µg/mL dalam rentang 1,46-30,6 µg/mL. Rata-rata kemurnian

DNA hasil ekstraksi adalah 1,84+1,74 µg/mL dengan rentang 1,58-1,84.

Tabel 4.1 Absorbansi, Kemurnian dan Konsentrasi DNA Asal Saliva Lama Hari

Penyimpanan

(Subjek)

A260 A280 A320 A260:A280 Kemurnian

DNA

Konsentrasi

DNA

(µg/mL)

H0(1) 0,0292 0,0186 0,0048 1,57 1,77 1,46

H0(2) 0,0301 0,0205 0,0086 1,47 1,81 1,50

H0(3) 0,6112 0,5953 0,5678 1,03 1,58 30,6

H0(4) 0,0438 0,0291 0,0117 1.51 1,84 2,19

H0(5) 0,0220 0,0176 0,0110 1,25 1,67 1,10

H3(1) 0,0677 0,0437 0,0161 1,55 1,87 3,38

H3(2) 0,0783 0,0554 0,0238 1,41 1,72 3,91

H3(3) 0,0644 0,0472 0,0233 1,36 1,72 3,22

H3(4) 0,0686 0,0500 0,0271 1,37 1,81 3,43

H3(5) 0,0687 0,0472 0,0215 1,46 1,84 3,43

H7(1) 0,0621 0,0464 0,0269 1,34 1,81 3,11

H7(2) 0,0523 0,0374 0,0195 1,40 1,83 2,62

H7(3) 0,0576 0,0458 0,0283 1,26 1,67 2,88

H7(4) 0,0602 0,0497 0,0315 1,21 1,58 3,01

H7(5) 0,0678 0,0555 0,0369 1,22 1,66 3,39

H10(1) 0,0725 0,0547 0,0327 1,33 1,81 3,63

H10(2) 0,0862 0,0642 0,0394 1,25 1,65 4,01

H10(3) 0,0762 0,0571 0,0325 1,33 1,78 3,81

H10(4) 0,1028 0,0877 0,0678 1,17 1,76 5,14

H10(5) 0,1130 0,1020 0,0869 1,11 1,73 5,65

H14(1) 0,0712 0,0581 0,0387 1,23 1,68 3,56

H14(2) 0,0758 0,0609 0,0397 1,24 1,70 3,79

H14(3) 0,0677 0,0514 0,0314 1,32 1,82 3,38

H14(4) 0,0548 0,0442 0,0292 1,24 1,71 2,79

H14(5) 0,0587 0,0489 0,0335 1,20 1,68 2,94 H3(1) adalah DNA dari subjek 1 dengan lama penyimpanan 3 hari dengan perlakuan gentamicin


20

dan ketoconazol. A(260) adalah 0,0677 A(280) adalah 0,0437 A(320) adalah 0,0161 A260:A280

adalah 1,55 Kemurnian DNA ditentukan dengan menghitung (A260-A320):(A280-A320).

4.1.2. Kualitas DNA Hasil Ekstraksi

Satu elektroforesis gel agarose dilakukan untuk menentukan kualitas

DNA genom pasca ekstraksi. Pada semua sampel, DNA tampak utuh dan tidak

terdapat fragmentasi DNA (Gambar 4.1).

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis gel DNA dapat ditemukan pada semua sampel hasil penyimpanan. Dua smear DNA terdapat pada

lane 2 dan 3. Semua DNA tampak utuh dan tidak ada fragmentasi DNA. Lane 1 adalah sampel

dari H0. Lane 2 adalah sampel dari H3. Lane 3 adalah sampel dari H7. Lane 4 tidak

mengandung sampel. Lane 5 adalah sampel dari H10. Lane 6 adalah sampel dariH14.

4.1.3. Pengaruh Gentamicin terhadap Kualitas DNA Genom Manusia Asal

Saliva

Elektroforesis gel agarose hasil PCR menunjukkan multiple bands dan

primer dimer(Gambar 4.2). Expected bands (335 bp) dari gen human ACTB

tampak pada lane 2, 3, 5, dan 6. Kontrol negatif (lane 1) menunjukkan adanya

primer-dimer. Kesamaan pola kontrol negatif (lane 1) dan lane 4 menunjukkan

ketiadaan DNA pada lane 4 sehingga tidak tampak adanya expected band. Lane

2, 3, 5, dan 6 menunjukkan pola bands yang nyaris sama dengan kekuatan sinyal

yang berbeda.


21

Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis PCR gen human ACTB. Expected band dari gen human β-actin (335 bp) berada pada lane 2 dan 3. Lane 5 dan 6

menunjukkan band berukuran 300 bp.Lane 4 tidak menunjukkan expected band.M adalah

marker, 1 adalah kontrol negatif, 2 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 0 hari, 3 adalah DNA

saliva hasil penyimpanan 3 hari, 4 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 7 hari,5 adalah DNA

saliva hasil penyimpanan 10 hari, 6 adalah DNA saliva hasil penyimpanan 14 hari.

4.2. PEMBAHASAN

DNA saliva yang didapatkan melalui ekstraksi DNA diamati kuantitas

dan kualitasnya. Analisis kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui kemurnian

dan konsentrasi DNA. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui

perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Hasil isolasi DNA dikatakan murni

apabila rasio perbandingan A260 nm dan A280 nm adalah 1,8-

2,0(Murtiyaningsih, 2017). Kemurnian DNA pada penelitian ini berkisar antara

1,58-1,84. Pada penelitian lain rata-rata kemurnian DNA berkisar sekitar1,8-2,0

(Wahab et al., 2017). Jika sampel yang mempunyai hasil rasio sekitar 1,8 atau

mendekati 1,8 yaitu sampel DNA relative murni (Garbieri et al., 2017). Ha litu

terjadi karena penurunan integritas DNA genom akibat aktivitas DNase yang

menurunkan sampel DNA (Wahab et al., 2017). Rasio kemurnian DNA didalam

penelitian ini menunjukkan relative murni karna berkisar 1,58-1,84. Konsentrasi

DNA pada penelitian ini memiliki rentang 1,46-30,6 µg/mL dengan volume

saliva 2 mL dengan metode spin column. Pada penelitian lain dengan volume 1

mL menggunakan metode kit Oragene ™ memiliki hasil konsentrasi DNA lebih


22

rendah yaitu 10 ng/µL (Garbieri et al., 2017). Hasil konsentrasi DNA lebih

tinggi tergantung pada volume salivanya, jika semakin banyak volume saliva

maka konsentrasi semakin tinggi. Hasil preservasi DNA di penelitian ini dalam

jangka waktu 14 hari berhasil akan tetapi pada elektroforesis PCR menunjukkan

H7 tidak terdapat band pada gambar 4.2 karena saliva tidak homogen pada H7.

Pada gambar 4.2 juga terdapat smear. Smear merupakan sisa dari larutan-larutan

yang masih terbawa selama proses isolasi atau juga dapat berupa DNA yang

terdegradasi pada proses isolasi.

Kemurnian DNA yang memadai tidak menjamin amplifikasi gen yang

berhasil karena faktor-faktor lain seperti konsentrasi DNA juga perlu

dipertimbangkan (Abdel-Latif dan Osman, 2017). Beberapa peneliti menyimpan

air liur pada suhu -20°C. DNA yang layak dapat diekstraksi dari air liur yang

disimpan tanpa batas pada suhu antara -15°C dan -20°C dan disimpan selama

beberapa waktu dalam suhu ruang (Brozoski dan Santos, 2017). Secara khusus,

hasil dari penelitian ini memiliki konsentrasi DNA dalam rentang 1,46-30,6

µg/mL.

Hal yang valid, sebelum penelitian ini, adalah bahwa air liur mungkin

mengandung proporsi DNA yang signifikan dari bakteri mulut dan/atau

makanan. Konsentrasi sebenarnya dari DNA manusia yang ditambahkan ke

setiap pengujian akan berada di bawah konsentrasi yang dihitung dan kecepatan

keseluruhan akan berkurang secara proporsional (Abraham et al.,2012).


23

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. KESIMPULAN

1. Kuantitas DNA genom manusia asal saliva hasil preservasi dengan

spektrofotometer menunjukkan rata-rata konsentrasi DNA yaitu 1,50+3,43

µg/mL dan rata-rata kemurnian DNA yaitu 1,84+1,74.

2. Kadar 1500 µg/mL gentamisin sulfat dan 100 µM ketoconazol

mempreservasi DNA genom manusia dalam kondisi penyimpanan suhu

ruang selama 14 hari.

3. Kualitas DNA saliva hasil preservasi adalah baik dengan tidak adanya

fragmentasi DNA dan PCR dapat mengamplifikasi gen human β-actin dari

DNA hasil preservasi.

5.2. SARAN

1. Penambahan volume saliva untuk preservasi sehingga konsentrasi DNA yang

diperoleh mencapai rendemen yang lebih tinggi.

2. Upaya homogenisasi sampel saliva perlu dilakukan agar seluruh sampel

berisi DNA.

3. Uji spektrofotometri untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA

dilakukan segera setelah ekstraksi DNA saliva.

4. Optimasi kondisi PCR perlu dilakukan pada konsentrasi primer dan jumlah

DNA untuk menghilangkan primer dimer.


24

DAFTAR PUSTAKA

Abdel-Latif, A., & Osman, G. (2017). Comparison of three genomic DNA extraction

methods to obtain high DNA quality from maize. Plant Methods, 13(1), 1–9.

Abraham, J. E., Maranian, M. J., Spiteri, I., Russell, R., Ingle, S., Luccarini, C., Earl, H.

M., Pharoah, P. P. D., Dunning, A. M., & Caldas, C. (2012). Saliva samples are

a viable alternative to blood samples as a source of DNA for high throughput

genotyping. BMC Medical Genomics, 5.

Brozoski, D. T., & Santos, C. F. (2017). Human DNA extraction from whole saliva that

was fresh or stored for 25(2), 147–158.

Garbieri, T. F., Brozoski, D. T., Dionísio, T. J., Santos, C. F., & Neves, L. T. das.

(2017). Human DNA extraction from whole saliva that was fresh or stored for 3,

6 or 12 months using five different protocols. Journal of Applied Oral Science,

25(2), 147–158. https://doi.org/10.1590/1678-77572016-0046

Murtiyaningsih, H. (2017). Isolasi Dna Genom Dan Identifikasi Kekerabatan Genetik

Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic.Agritrop, 15(1),

84–93.

Wahab, R. M. A., Nasri, F. A. M., Abidin, I. Z. Z., Ariffin, Z. Z., Yazid, M. D., &

Ariffin, S. H. Z. (2017). Kesan Penyimpanan Sampel Air Liur Terhadap Kualiti

DNA Genom. Sains Malaysiana, 46(6), 909–915.

Aguiar S.I., Serrano I., Pinto F.R., Melo-Cristino J., Ramirez M. 2008. The presence of

the pilus locus is a clonal property among pneumococcal invasive isolates. BMC

Microbiol. 8,41.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002. From DNA to RNA.

Garland Science.

Aidar, M., and Line, S. R. 2007. A Simple and Cost-Effective Protocol for DNA

Isolation from Buccal Epithelial Cells. Brazilian Dental Journal, 18, 148- 152.

BG. Katzung. Farmakologi dasar dan klinik. 10th ed. Jakarta. EGC; 2009.p479 489

Brooks., et al. 2008. Mikrobiologi Kedokteran. Ed. 23. Jakarta: EGC.

Brown, T. A. 2002. Pengantar Kloning Gena. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.

Brozoski, D. T., & Santos, C. F. (2017). Human DNA extraction from whole saliva that

was fresh or stored for 3 , (2), 147–158.


25

Cascella, R., Foti Cuzzola V., Lepre, T. 2015. Full sequencing of the FLG gene in

Italian patients with atopic eczema: evidence of new mutations, but lack of an

association. J Invest Dermatol, 131: 982-984.

Campbell, N. A., dan J. B. Reece. 2008. Biologi. Edisi ke 8, Jilid 1. (diterjemahkan dari

Biology Eighth Edition, penerjemah: D.T. Wulandari). Jakarta:Erlangga

Cheng YJ, Guo WW, Yi HL, Pang XM & Deng X. 2003. An efficient protocol for

genomic DNA extraction from citrus species. Journal Plant Molecular Biology

Reporter 21: 177a-177g.

Choo, J. H., Rukayadi, Y., and Hwang, J-K. 2006. Inhibition of bacterial quorum

sensing by vanilla extract. Letters in Applied Microbiology, 42(6): 37-41.

Dawes, S. B. 2003. Book Reviews: Seeing the Psalms. The Expository Times, 114(12),

430–430.

Dhanya and S. Hegde, Salivary glucose as a diagnostic tool in Type II diabetes mellitus:

A case-control study, Niger. J. Clin. Pract., 19(4), pp. 486–490, 2016.

Diaz, J., ten Have A., and van Kan JA. 2002. The role of ethylene and wound signaling

in resistance of tomato to Botrytis Cinerea. Plant Physiol, 129(3): 1341-51.

Dodd, C. L., Greenspan D., Katz M.H., Westenhouse J.L., Feigal D.W., and

GreenspanJ.S.1991.Oral Candidiasis in HIV Infection: Pseudomembranous and

Erythematous Candidiasis Show Similar Rates of Progression to AIDS. 5:1339–

1343.

Efendi, F. 2009. Keperawatan Kesehatan Komunitas: Teori dan Praktek dalam

Keperawatan. Jakarta: SalembaMedika.

Evans, Cory J., and Aguilera, R. J. 2003. DNase II: Genes, Enzymes and Function.Gene,

Dec 11; 322:1-15. doi: 10.1016/j.gene.2003.08.022.

Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyarti, S., dan Rahayu, S. 2011.Biologi Molekular

Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Funakoshi, H. Wakasugi, M. Nakamura, Y. Takagi, H. Ibayashi, Biochemical and

clinical studies on human pancreatic deoxyribonuclease I inhibitor,

Gastroenterol. Jpn. 14 (1980).

Harvey, R. A., Champe, P. C., Fisher, B. D. 2007. Microbiology, 2nd Ed. USA:

Lippincot Williams & Wilkins.

Hosono,A.,Ozawa,A.,Kato,R.,etal.2003.Dietary fructo oligosaccharides induce


26

immunoregulation of intestinal IgA secretion by murine Peyer’s patch cells.

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67: 758-764.

Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A., 2005, Mikrobiologi Kedokteran,

diterjemahkan oleh Mudihardi, E., Kuntaman, Wasito, E. B.,Mertaniasih, N. M.,

Harsono, S., Alimsardjono, L., Edisi XXII, 327-335, 362-363, Jakarta: Salemba

Medika.

Kawane, K., Fukuyama, H., Kondoh, G., Takeda, J., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y.,

Nagata,S.2001.Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the

mouse fetal liver. Science. 292:1546-1549.

Keyel, Peter A. 2017. Dnases in Health and Disease. Developmental Biology,

429(2017): 1-11.

Kidd EAM, Joyston-Bechal S. 1992. Dasar-dasar karies: Penyakit dan

penanggulangannya. Alih Bahasa Sumawinata N. Jakarta: EGC.

Kolarević, S., Heberger, K., Kracun-Kolarević, M., et al. 2014. Evaluation of single-cell

gel electrophoresis data: Combination of variance analysis with sum of ranking

differences. Mutation Research, Genetic Toxicology and Enviromental

Mutagenesis, 177: 15-22.

Küchler EC, Tannure PN ,Falagan-Lotsch P ,Lopes TS, Granjeiro JM, AmorimLM.

2012. Buccal cells DNA extraction to obtain high quality human genomic DNA

suitable for polymorphism genotyping by PCR-RFLP and Real-Time PCR. J

Appl Oral Sci.20(4):467–471.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V. & Clark, D.P. 2010. Brock Biology of

Microorganisms. 12th ed. San Francisco: Pearson Education.

Maruyama, S. Sonokawa, H. Matsushita, M. Goto, Inhibitiory effects of gold(III) ions

on ribonuclease and deoxyribonuclease, J. Inorg. Biochem. 101 (2007) 180e186.

Marwayana, O N. 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel

Jaringan Otot. Jurnal Oseana, Volume XL, Nomor 2, Tahun 2015: 1-9

McGuire, A. L. et al. (2015) ‘Preclinical assessment of adjunctive tPA and DNase for

peritoneal dialysis associated peritonitis’, PLoS ONE, 10(3).

Nejat N, Vadamalai G. 2013. Diagnostic techniques for detection of phytoplasma

diseases: past and present. J Plant Dis Prot. 120(1):16–25.

Phillips, K.., N. McCallum, and L. Welch. 2012. A comparison of methods for forensic


27

DNA extraction: Chelex-IOO and the QIAGEN DNA investigator kit (manual

and automated). Journal Forensic Science International: Genetics,6(2), 282-285.

Pereira, A. L. dos S. (2015), Ekp, 13(3), pp. 1576–1580.

Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M. and Nasidze, I. 2006. Evaluation Of

Saliva As A Source Of Human DNA For Population And Association Studies.

Analytical Biochemistry, 353, 272-277.

Radisavljevic, A.V. Nagorni, G. Kocic, G.B. Bjelakovic, A.S. Petrovic, A.R. Veljkovic,

S.R. et al. 2013. The activities of acid DNase and 50 nucleotidase in erosive

reflux esophagitis and Barrett's epithelium,Hepatogastroenterology

601073e1076.

Russel, P.J. 1994. Fundamentals of Genetics. New York; Harper Collins College

Publisher

Scully, C., and Felix, D. H. 2005. Oral Medicine – Update for the Dental Practitioner,

Mouth Ulcers of More Serious Connotation. British DentalJournal, l. 199 (6), :

339-343.

Shetti A., Ishita G., and Shivyogi M.C. 2011. Oral Candidiasis: Aiding in the Diagnosis

of HIV—A Case Report.

Shiokawa, K., Kubota, M., Otsuka, Y., Ejiri, Y., Ogawa, T., Sakanoi, H. Fukunishi, M.

Yamamoto, S. Fukao, and A. Saito, Traveling ionospheric disturbances observed

in the OI 630‐nm nightglow images over Japan by using a multi‐point imager

network during the FRONT campaign, Geophys. Res. Lett., 24, 4037–4040,

2001.

Sisirak, V., Sally, B., D’Agati, V., Martinez-Ortiz, W., Ozcakar, Z.B, David, J., et al.

2016. Digestion of Chromatin in Apoptotic Cell Microparticles Prevents

Autoimmunity. Cell, 166: 88-101.

Siswanto,J.E.,et.al.2016.Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada

Bayi Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks

Kemurnian. Jurnal Sari Pediatri, Vol. 18, No.4.

Sleat, David E., Zheng, H., Qian, M., and Lobel, P. 2006. Identification of Sites of

Mannose 6-Phosphorylation on Lysosomal Proteins. Molecular & Cellular

Proteomics, 5(4): 686-701.

Sunaga, T. Kobayashi, A. Yoshimori, D. Shiokawa, S. Tanuma, A novel inhibitor that


28

protects apoptotic DNA fragmentation catalyzed by DNase g, Biochem.

Biophys. Res. Commun. 325 (2004) 1292e1297.

Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. 2000. Identification and Characterization of the New

Osteoclast Progenitor With Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate

Into Mature Osteoclasts. J Bone Miner Res, 15(8): 1477-88.

Taper. 2008. Altered deoxyribonuclease activity in cancer cells and its role in nontoxic

adjuvant cancer therapy with mixed vitamins C and K3, Anticancer Res. 28

2727e2732.

Thiede C, Prange-Krex G, Freiberg-Richter J, Bornhäuser M, Ehninger G. 2000. Buccal

swabs but not mouth wash samples can be used to obtain pre transplant DNA

finger prints from recipients of allogeneic bone marrow transplants. Bone

Marrow Transplant.25(5):575–577.

Torriglia, A., Lepretre, C., Ivana, A., Shah, G.M. 1998. Regulation of poly (ADP-

ribose) polymerase-1 functions by leukocyte elastase inhibitor/LEI-derived

DNase II during caspase-independent apoptosis. The International Journal of

Biochemistry & CellBiology,41(5):1046-54.

Tsuruta,K.,Kume,T.,Komatsu,H.,et al. 2008. Relationship Between Tree Height and

Transpiration for Individual Japanese Cypress (Chamaecyparis Obtusa). Journal

of Japan Society of Hydrology & Water Resource. 21(6):414-422.

Turner, M.D dan Ship, J.A. 2007. Dry Mouth and Its Effect on The Oral Health of

Elderly People. JADA. 138, (9 suppl.), 155-205.

Vasanthakumari, R. 2007. Textbook of Microbiology. New Delhi: BIPublications.

Wahab, R. M. A., Nasri, F. A. M., Abidin, I. Z. Z., Ariffin, Z. Z., Yazid, M. D.,

&Ariffin,

S. H. Z. (2017). Kesan Penyimpanan Sampel Air Liur Terhadap Kualiti DNA Genom.

Sains Malaysiana, 46(6), 909–915.

Woegerbauer, H. Burgmann, J. Davies, W. 2000. Graninger, DNase I induced

DNAdegradation is inhibited by neomycin, J. Antibiot. 53 276e285.

Yasuda, Y. Kawai, M. Uekia, K. Kishi. (2005). Clinical applications of DNase I, a

genetic marker already used for forensic identification, Leg. Med. 7:274-

277. Yuwono T. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University

Press.


29

Zhou, C. Zhu, J. Ren, S. Dong, A. 2012. graphene-based real-time fluorescent assay of

deoxyribonuclease I activity and inhibition, Anal. Chim. Acta 740 88e92.


30

LAMPIRAN A

CURRICULUM VITAE

Nama : ChairunnisaSiregar

NIM : 170100243

Tempat/tanggallahir : Medan, 22 Oktober 1999

Agama : Islam

NamaAyah : Saiful Bahri Siregar

NamaIbu : Intan MenggalawatiHarahap

Alamat : Jalan Pasar V Gg. Mentimun 4 No. 4, Percut Sei Tuan,

Deli Serdang,SUMUT.

Riwayat Pendidikan:

1. TK SWASTA HIKMATUL FADHILLAH (2004-2005)

2. SD SWASTA HIKMATUL FADHILLAH (2005-2009)

3. SD NEGERI NO. 101080 GUNUNG TUA (2009-2011)

4. SMP SWASTA AL-ULUM TUASAN (2011-2014)

5. SMA NEGERI 1 MEDAN (2014-2017)

6. FAKULTAS KEDOKTERAN USU (2017- sekarang)

Riwayat Pelatihan:

1. Peserta PKKMB (Pelaksanaan Pengenalan Kehidupan Kampus Bagi

Mahasiswa Baru) Fakultas Kedokteran USU tahun2017

2. Peserta MMB (Manajemen Mahasiswa Baru) FK USU tahun2017

3. Peserta LKMM (Latihan Kepemimpinan dan Manajemen Mahasiswa)

FK USU 2017

4. Peserta “Seminar Infeksi Saluran Kemih dan Workshop Sirkumsisi

SCORA FK USU2018”

Riwayat Organisasi:

1. Anggota Palang Merah Remaja tahun2015-2017

2. Anggota SCORA FK USU 2018

Riwayat Kepanitiaan:

1. Panitia Seminar “Dampak Dunia Maya Terhadap Kesehatan Reproduksi

dan Workshop Sirkumsisi” SCORA FK USU2019

2. Panitia Pengabdian Masyarakat SCORA FK USU2020


31

LAMPIRAN B


32

LAMPIRAN C


33

LAMPIRAN D


preservasi dna genom manusia asal saliva dengan

Documents