PRAKTIKUM 1

PENGECATAN GRAM BAKTERI KOKUS GRAM POSITIF

I. Tujuan praktikum

Mahasiswa dapat melakukan pengecatan dan mengidentifikasi bakteri gram positif (Streptococcus dan Staphilococcus).

II. Dasar teori praktikum

Secara garis besar pemeriksaan terhadap kuman / bakteri dibagi menjadi 2, yaitu pemeriksaan secara makroskopik dan mikroskopik. Pemeriksaan secara makroskopik dapat kita lakukan dengan mengamati bentuk / jenis/ ukuran koloni dan sifat sifatnya pada pembenihan padat.pemeriksaan secara microskopik dapat kita lakukan dengan melihat bentuk, susunan dan ada tidaknya gerakan serta sifat sifat bakteri terhadap pewarnaan di bawah mikroskop.

Pemeriksaan mikroskopik terhadap bakteri dapat dilakukan dalam keadaan hidup maupun mati. Pemeriksaan terhadap bakteri dalam keadaan hidup dapat dikerjakan dengan membuat preparat tetes gantung atau dengan melihat bakteri dalam mikroskop medan gelap. Dalam keaadaan mati, bakteri dapatdibuat preparat dengan cara pengecatan.

Bahan pemeriksaan yang dikirim langsung diperiksa untuk diketahui adanya kuman penyebab penyakit. Untuk itu dibuat suatu preparat dan bahan pemeriksaan dengan pengecatan atau tidak, kemudian diperiksa di bawah mikroskop.

Pada umumnya pengecatan dibagi 3 cara:

1. Pewarnaan sederhanamerupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

2. Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

3. Pewarnaan Diferensial (Gram)adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Zat warna yang dipakai terdiri lebih dari satu bahan zat warna. Oleh karena ada perbedaan sifat fisik dan biokimiawi dan kuman maka dengan campuran zat warna tersebut dapat dibedakan berbagai jenis bakteri berdasarkan reaksinya terhadap zat warna yang diikat dari campuran itu.

Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Staphilococcus.

Staphilococcus adalah kuman berbantuk bulat, gram +, biasanya tersusun dalam kelompok kelompok tidak teratur. Kuman ini mudah tumbuh pada berbagai media, meragi beberapa karbohidrat, membentuk pigmen yang bervariasi dan putih sampai kuningb tua kadang ungu. Beberapa diantaranya tergolong flora normal kulit dan selaput lendir manusia, tapi ada yang dapat menyebabkan pernanahan abses bahkan septikemia yang fatal. Staphilococcus patogen sering menghemolisa darah, mengoagulasi plasma dan menghasilkan enzim dan toksin. Beberapa spesies menyebabkan keracuman makanan dengan memproduksi enterotoksin yang menyebabkan keracuman makanan dengan memproduksi enterotoksin yang bersifat tahan panas. Staphilococcus cepat resisten terhadap banyak anti mikrobia dan menyebabkan kesulitan dalam pengobatan.

a. Morfologi

Bentuk: bulat diameter 1mm

Sifat pengecatan : gram + makin tua makin ke arah gram

Susunan : biasanya mempunyai susunan yang khas menggerombol seperti buah anggur. Tapi dapat juga tunggal, berpasangan, membentuk rantai pendek (3-4 sel) atau berempat. Susunan yang tidak khas tersebut terutama bila preparat dibuat dari media cair.

b. Sifat pertumbuhan

Staphilococcus menghasilkan enzim katalase, sifat ini dapat membedakannya dengan streptococcus. Meragikan banyak karbohidrat secara lambat, menghasilkan asam laktat tetapi tidak menghasilkan gas. Staphilococcus relatif resisten terhadap pengeringan, panans (kuman ini tahan 50C selama 30menit). Dan terhadap 9% NaCl, tetapi dihamabt oleh zat-zat kimia seperti heksaklorofen 3%.

Enzim katalase akan menghasilkan hydrogen peroksida menjadi air danoksigen.

2H2O2 2H2 + O2

c. Struktur antigen

Staphilococcus mengandung antigen polisakarida dan protein yang memungkinkan penggolongan strain-strain dalam batas tertentu. Asam teikoat (polimer gliserol atau ribitol fosfat) yang berkaitan dengan peptidoglikan dapat bersifat antigenik. Kebanyakan zat ekstraseluller yang dihasilkan oleh staphilococcus juga merupakan antigen.

Streptococcus.

Streptococcus adalah kuman berbentuk bukat, gram +, tersusun khas berderet seperti rantai. Beberapa diantaranya merupakan flora normal manusia lainnya dihubungkan dengan penyakit penyakit penting pada manusia. Terjadinya penyakit tersebut, penyakit tersebut dapat berupa infeksi atau hipersensitivitas. Kuman ini menghasilkan berbagai zal ekstraseluler dan enzim enzim. Kemampuannya menghemolisa sel sel darah merah dalam berbagai tingkatan adalah salah satu dasar penting untuk klasifikasi.

a. Morfologi.

Kuman berbentuk bulat atau bulat telur, kadang menyerupai batang, tersusun berderet seperti rantai. Panjang rantai bervariasi dan sebagian besar ditentukan oleh faktor lingkungan. Rantai akan lebih panjang pada media cair dibanding media padat. Pada pertumbuhan tua atau kuman yang mati sifat gram positifnya akan hilang dan menjadi gram - .

Sebagian besar strain group A, B dan C menghasilkan kapsul yang terdiri dari asam hialuronat. Kapsul paling nyata pada biakan yang sangat muda. Kapsul ini menghalangi fagositosis. Dinding sel streptococcus mengandung protein protein (antigen M, T, R), karbohidrat (spesifik group) dan peptodoglikan. Pili seperti rambut menonjol malalui kapsul streptococcus group A. Pili tersebut sebagian besar terdiri dari protein M dan ditutupi asam lipotheikoat. Asam lipotheikoat sangat penting untuk membantu perlekatan streptococcus pada sel epitel.

b. Klasifikasi

Klasifikasi streptococcus secara praktis dalam kategori kategori utama dapat didasarkan pada :

1. Morfologi koloni dan hemolisa pada agar darah.

2. Tes tes biokimia dan resistensi terhadap faktor faktor fisik dan kimia

3. Sifat sifat imunologik

4. Gambaran ekologik.

Dengan kombinasi dari ke 4 hal tersebut di atas dapatlah disusun klasifikasi sebagi berikut :

1. Streptococcus Beta hemolitik

Kuman ini menghasilkan hemolisin yang dapat dikenal dengan mudah pada agar darah dan juga menghasilkan karbohidrat C. Kuman kuman dibawah ini adalh beberapa group streptococcus beta hemolitik yang ada hubungannya dengan kedokteran :

a. Group A

Streptococcus pyegenes, saling patogen dibanding streptococcus yang lain. Dapat menyebabkan infeksi lokal atau sistemik dan berakibat kelainan paska streptococcus. Kuman ini biasanya sensitif terhadap basitrasin. Pada agar darah kambing koloninya khas dengan adanya daerah hemolisa beta yang lebar.

b. Group B

Streptococcus agalactica, flora normal dan saluran kelamin wanita. Dapat menjadi penyebab yang penting pada sepsis dan meningitis neotal. Kuman ini menghidrolisa natrium hipurat, jarang pekan terhadap basitrasin, dan memberikan respon yang positif terhadap tes CAMP ( christie, atkins, much-petersen).

c. Group D

Termasuk enterococcus (misalnya streptococcus faecalis, streptococcus faecium) dan non enterococcus (misalnya streptococcus bovis, streptococcus aquinus).

III. Alat dan Bahan

a. Alat

Objek glases

Ose Bulat

Pembakar spiritus

Mikroskop

Kapas

Tisue

b. Bahan

Aquades

Alkohol 70%

Suspensi bakteri Streptococcus dan staphilococcus.

Larutan Gram A (violet)

Larutan Gram B ( logol)

Larutan Gram C ( alkohol asam 3% atau asam kuat { HCl, HCO4, alkohol }

Larutan gram D (safranin)

IV. Cara Kerja

A. Pembuatan preparat smear.

1. Siapkan 2 objek glass yang sudah diusapkan dengan kapas ber alkohol 70%.

2. Fiksasi / Panaskan dibagian yang telah dibersihkan

3. Tandai objek glas dengan spidol permanen pada bagian bawah.

4. Ambil cairan suspensi dengan menggunakan jarum ose :

A. Preparat suspensi bakteri stapilococcus

B. Preparat suspensi bakteri streptococcus

5. Kedua preparat dibiarkan kering angin hingga terbentuk selaput putih.

6. Kedua preparat di fiksasi (dilewatkan diatas api spiritus 3-5 kali )

B.Pengecatan Gram

1. Beri larutan gram A selama 3 menit

2. Kemudian bilas dengan Akuades

3. Beri larutan gram B selama 1 menit

4. Kemudian bilas dengan Akuades

5. Beri larutan gram C selama 30 detik

6. Kemudian bilas dengan aquades

7. Beri larutan gram D selama 3 menit

8. Kemudin bilas dengan Akuades

9. Terakhir keringkan dengan tisu secara hati hati

C. Pengamatan Mikroskop

1. Ambil objek glass yang telah jadi.

2. Lalu beri minyak imersi

3. Lihat dimikroskop dengan perbesaran 10x100.

V. Hasil Pengamatan

Coccus Berderet ( Streptococus )

Coccus bergerombol ( Staphylococcus )

VI. Kesimpulan

Dari hasil praktikum ditemukan dua bakteri gram positif dari hasil pengecatan , yaitu Streptococcus dengan ciri : tersusun khas berderet seperti rantai dan Staphylococcus dengan ciri : bergerombol. Warna hasil pengecatan adalah ungu karena bakteri gram positif.