PRAKTIKUM I

PENGENALAN ALAT DAN BAHAN

TANGGAL PRAKTIKUM : SENIN, 19 APRIL 2010

PEMBIMBING : IBU TITA SUSANTI

Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian tanaman

(akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi

invitro (di dalam gelas/botol). Keuntungan dati kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu,

dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam

dengan induknya. Contoh tanaman yang sudah lazim diperbanyak secara kultur jaringan adalah

tanaman anggrek.

Pada pelaksanaan kultur jaringan, terdapat banyak bahan-bahan dan peralatan yang diperlukan.

Setiap tahapan proses kultur jaringan memerlukan peralatan dan bahan yang berbeda. Peralatan

ini akan digunakan dalam pembuatan media, persiapan eksplan (inisiasi), penanaman (inokulasi),

inkubasi dan aklimatisasi.

I. PERALATAN DAN BAHAN

A. Peralatan yang dibutuhkan untuk melaksanakan kultur jaringan :

1. Alat Pembuatan Media

2. Alat Persiapan Eksplan (Inisiasi)

3. Alat Penanaman (Inokulasi)

4. Alat Inkubasi

5.Alat Aklimatisasi

Masing-masing peralatan mempunyai fungsi tersendiri. Adapun fungsi masing-masing peralatan

yang digunakan :

1. Alat Pembuatan Media

NO ALAT FUNGSI

1. Gelas becker/piala Untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan

kimia dan air aquades dalam pembuatan media.

Ukuran gelas piala bervariasi, 100ml, 300ml,

1000ml, 2000ml.

2. Pipet Untuk mengambil cairan.

3. Timbangan Untuk menimbang bahan kimia yang diperlukan

dalam pembuatan media kultur.

4. Spatula Untuk mengambil bahan kimia yang diperlukan

dalam pembuatan media kultur.

5. Indicator pH/ lakmus Untuk mengukur pH media ketika membuat

media.

6. Sendok kaca Untuk mengaduk media saat persiapan dan saat

pemanasan.

7. Panci Tempat memasak media.

8. Kompor Untuk pemanas saat memasak media.

9. Autoklaf

Untuk mensterilkan semua peralatan dan media

kultur yang dipakai dalam kegiatan kultur

jaringan.

10. Botol kultur Tempat untuk mengkulturkan atau menanam

eksplan.

11. Plastik dan karet tahan panas Untuk penutup pada botol kultur dan sebagai

pengikat plastik dengan botol kultur.

2. Alat Penyiapan Eksplan (Inisiasi)

NO ALAT FUNGSI

1. Botol kultur Tempat untuk mengkulturkan atau menanam

eksplan.

2. Scalpel Untuk pemotongan eksplan

3. Gunting Untuk memotong eksplan

3. Alat Penanaman (Inokulasi)

NO ALAT FUNGSI

1. Laminar air flow/enkas

Untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam

kondisi steril atau melakukan sub kultur yang

dilengkapi dengan blower dan lampu UV.

2. Pinset Untuk mengambil eksplan.

3. Spatula Untuk mengambil eksplan berupa biji/plb

anggrek.

4. Petridish Tempat untuk memotong-motong eksplan yang

akan di tanam dalam botol kultur.

5. Bunsen

Untuk menggarang/membakar alat-alat kultur,

seperti alat-alat diseksi ketika melakukan

penanaman sehingga peralatan tersebut tetap

steril.

4. Alat Inkubasi

NO ALAT FUNGSI

1. Rak kultur

Tempat untuk menyimpan botol-botol berisi

eksplan hasil inokulasi dan mengoptimalkan

pemanfaatan ruangan yang ada.

2. Air conditioner (AC) Untuk menjaga suhu ruangan agar tetap stabil

sesuai dengan kondisi suhu untuk kultur jaringan.

3. Lampu Untuk memberikan penerangan dan cahaya bagi

pertumbuhan tanaman.

4. Timer listrik Untuk mengatur waktu penyinaran pada tanaman

kultur.

5. Termometer suhu ruangan Untuk mengetahui suhu ruangan

5. Alat Aklimatisasi

NO ALAT FUNGSI

1. Ember Untuk tempat plantlet yang telah dikeluarkan dari

botol yang akan dicuci.

2. Gelas becker/piala Tempat perendaman plantlet dengan fungisida dan

bakterisida.

3. Pinset Untuk mengeluarkan plantlet dari botol kultur.

4. Timbangan Untuk menimbang fungisida dan bakterisida.

5. Pengaduk kaca Untuk mengaduk larutan fungisida dan

bakterisida.

6. Pot try Tempat menanam plantlet.

7. Kertas koran Alas untuk mengeringkan tanaman yang sudah di

rendam.

B. Bahan yang digunakan dalam praktek kultur jaringan antara lain:

Bahan yang digunakan dalam proses kultur jaringan berbeda satu sama lain tergantung dari

proses yang akan dilakuakan. Setiap tahap tersebut membutuhkan bahan tersendiri, diantaranya :

1. Bahan untuk membuat media MS praktis

2. Bahan persiapan dan sterilisasi Eksplan

3. Bahan penanaman (Inokulasi)

4. Bahan aklimatisasi

Gambar peralatan dan bahan kultur jaringan

Adapun bahan yang digunakan dalam pelaksanaan praktek kultur jaringan, antara lain :

NO JENIS BAHAN

media ms Persiapan dan sterilisasi

eksplan

inokulasi aklimatisasi

1 Media MS jadi Eksplan Alcohol Tanaman

2 bahan kimia untuk

pembuatan media

Air Aquadest Air

3 hyponex Fungisida Betadin Fungisida

4 Gula Bakterisida eksplan Bakterisida

5 Agar HgCl2 - Media (pakis,

arang)

6 air Pemutih pakaian - -

7 - alkohol - -

II. STERILISASI ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-

alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting

dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus

untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi

tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara

sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah; Pinset, Gunting, -

Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong, Jarum, Pipet

Autoklaf

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam mulai dari yang

sederhana sampai yang Programable. Autoklaf yang sederhana menggunakan

sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan kedalam autoklaf. Pemanasan

air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini

tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoklaf ini adalah

bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual.

Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari

aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang,

serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Media dan Aquades

Media dan aquadest yang akan digunakan dalam kultur jaringan (kuljar)juga disterilisasikan

dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer

250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan

waktu untuk sterilisasi alat-alat yaitu 1 jam pada tekanan 17,5 psi.

Untuk media kultur

Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile,

sterilisasi C, tekanan antara 15-17.5dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121 psi dengan

waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media

dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan tekanan 15 psi dengan

waktu 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu

yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan

sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan

diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile

Untuk bahan-bahan kultur jaringan (kuljar) yang heat-labile, dalam bentuk larutan, sterilisasi

dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 dm.

Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk

volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat

labile seperti: GA3, Thiamin-HCI, Ca-panthothenate dan antibiotik: carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya

disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan

dipanaskan selama 4 jam pada C.temperatur 160 Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan.

Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus

ditutup dengan aluminium foil.

Enkas

Sebelum digunakan enkas kultur jaringan harus disterilisasi dengan menggunakan hand sprayer

berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70% dengan perbandingan 1:1. Setelah

enkas tersebut disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih lebih 10 menit, baru

kemudian boleh digunakan. Sebab, bila enkas yang baru disemprot tersebut langsung digunakan.

Maka formalin yang belum kering bila terkena api spirtus dapat meledak sehingga memecahkan

enkas.

Laminar

Penggunaaan formalin dalam laminar air flow dalam kultur jaringan,

"penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus

kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air

flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70%. "

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas

yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow

cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan

selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja.

Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat

kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.

III. RUANGAN YANG ADA DALAM KULTUR JARINGAN

Ruangan yang dibutuhkan dalam proses kultur jaringan pada dasarnya di bagi 3 kelompok, yaitu

ruang persiapan (preparasi), ruang penanaman (inikulasi), ruang pentimpanan (inkubasi). Selain

ketiga ruangan tersebut, ada beberapa rungan yang biasanya ada di laboratorium kultur jaringan

tergantung dari kebutuhan. Adapun penjelasan dari masing-masing ruangan yaitu sebagai

berikut:

a. Ruang persiapan

Untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman : penimbangan,

pengeceran, penuangan kedalam wadah kultur dan sterilisasi.

Sebagaitempat pencucian : kotoran bahan dari lapangan, pembuangan dan

pemotongan bagian yang tidak diperlukan dan sebagai perlakuan awal untuk

menghindari kontaminasi.

Tempat penyimpanan alat-alat kultur jaringan.

Gambar dalam ruang persiapan

b. Ruang transfer

Ruang transfer dimana pekerjaan aseptic dimulai

Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi bagian tanaman, sterilisasi, dan

penanaman eksplan dalam media.

Ruangan ini sedapat mungkin bebas debu dan serangga dan ruangan ini tersekat.

Pintu penghubung harus selalu tertutup, ber AC dan punya pintu penghubung

antara ruangan yang satu dengan yang lainnya.

c. Ruang kultur atau inkubasi

Ruangan ini merupakan ruangan penyimpanan hasil inisiasi eksplan.

Gambar ruang inkubasi

Alat Fungsi

Rak kultur Tempat untuk menyimpan botol-botol

berisi eksplan hasil inokulasi dan

mengoptimalkan pemanfaatan ruangan

yang ada.

Air conditioner (AC) Untuk menjaga suhu ruangan agar tetap

stabil sesuai dengan kondisi suhu untuk

kultur jaringan.

Lampu Untuk memberikan penerangan dan cahaya

bagi pertumbuhan tanaman.

Timer listrik Untuk mengatur waktu penyinaran pada

tanaman kultur jaringan.

Termometer suhu ruangan Untuk mengetahui suhu ruangan

d. Ruang penyimpanan bahan kimia

Ruangan ini digunakan untuk menyipan bahan-bahan kimia yang akan digunakan untuk

kultur jaringan.

Ruang penyimpanan bahan kimia