plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · d. bahan penelitian ... pewarna rambut adalah sediaan...

VALIDASI METODE ANALISIS PARA-PHENYLENEDIAMINE (PPD)

DALAM FORMULASI PEWARNA RAMBUT OKSIDATIF

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Cynthia Feliana

NIM : 118114104

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“The will to win, the desire to succeed, the urge to

reach your full potential... these are the keys that will

unlock the door to personal excellence.”

- Confucius -

“Live as if you were to die tomorrow. Learn as if you

were to live forever.”

- Mahatma gandhi –

Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga,

sahabat, kekasih, dan almamaterku tercinta.


http://www.goodreads.com/author/show/33394.H_Jackson_Brown_Jr_

v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas cinta

dan berkatnya yang luar biasa, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Validasi Metode Analisis Para-Phenylenediamine (PPD) Dalam

Formulasi Pewarna Rambut Oksidatif” sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

Penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak dengan

adanya motivasi, kritik, saran, diskusi, dan bimbingan. Oleh karena itu penulis

ingin mengucapkan terimakasih kepada:

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen pembimbing dan penguji yang

telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, motivasi, kritik,

dan saran selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

2. Jeffry Julianus, M.Si. dan F. Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen

penguji yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini.

3. Aris Widayati, M.Si., Ph. D., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma atas teladan yang diberikan.

4. Pak Sanjaya yang telah banyak meluangkan waktunya untuk mendampingi,

memotivasi, membantu, dan menjadi teman bagi penulis selama penelitian

dan penulisan skripsi ini.

5. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

atas ilmu, pengalaman, dan persahabatan yang dibagikan.

6. Papa, mama, koko dan seluruh anggota keluargaku yang tercinta yang selalu

memberikan semangat dan doa untuk keberhasilanku.


viii

7. Kekasih sekaligus sahabat yang selalu memberikan semangat dan doa selama

penelitian dan penulisan skripsi ini.

8. Sahabat-sahabatku tercinta Centel, Nyahti, Pika, Anka, Dea, dan Gabby atas

persahabatan, doa, dan semangatnya selama ini.

9. Aphui, Bayi, dan Cancan selaku sahabat dalam perjuangan penelitian dan

penulisan skripsi ini.

10. Cingap, Elyn, Evi, Ester, Siska, Empit, Kingkong, Berle, Ahen, dan Loren

Cik Lulu, Cik Anis, Cik Steph, Cik Maria, dan Valen selaku teman-teman

baikku selama di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas

persahabatan dan semangat yang telah diberikan.

11. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bantuan ,

semangat, dan doa sehingga penulis bisa sampai pada tahap ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan

skripsi ini atas segala keterbatasan yang dimiliki penulis. Untuk itu penulis

mengharapkan saran dan kritik yang dapat membangun dari semua pihak. Akhir

kata, penulis mempersembahkan skripsi ini demi kemajuan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 5 Juni 2015

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ………………………………………………….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………………. ii

HALAMAN PENGESAHAN ………………………………………… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ……...……………………………….. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...…………………………….. v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...……………………….. vi

PRAKATA …………………………………………………………….. vii

DAFTAR ISI …………………………………………………………... ix

DAFTAR TABEL ……………………………………………………... xii

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………….. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………………... xiv

INTISARI ……………………………………………………………… xvii

ABSTRACT …………………………………………………………….. xviii

BAB I PENGANTAR ………………………………………………..... 1

A. Latar Belakang …………………………………………………….... 1

1. Permasalahan …………………………………………………... 3

2. Keaslian Penelitian ……………………………………………... 3

3. Manfaat Penelitian ……………………………………………… 4

B. Tujuan Penelitian ………………………………………………….... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA …………………………………. 5

A. Pewarna Rambut ……………………………………………………. 5

1. Para-phenylenediamine (PPD) ………………………………... 6

2. Ekstrak Henna (Lawsonia inermis) ……………………………. 7


x

3. Sodium Perborat Tetrahidrat …………………………………... 8

4. Asam Sitrat …………………………………………………….. 8

5. Ekstrak Acacia concina ………………………………………... 9

6. Ekstrak Emblica officinalis ……………………………………. 9

B. Solid Phase Extraction (SPE) ……………………………………... 10

C. Kromatografi ………………………………………………………... 11

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ……………………….... 12

E. Validasi Metode Analisis ……………………………………………. 14

F. Landasan Teori ……………………………………………………… 16

G. Hipotesis ……………………………………………………………. 17

BAB III METODE PENELITIAN ……………………………………. 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………………... 18

B. Variabel Penelitian …………………………………………………... 18

1. Variabel bebas ………………………………………………….. 18

2. Variabel tergantung …………………………………………… 18

3. Variabel pengacau Terkendali ………………………………… 18

C. Definisi Operasional ………………………………………………… 18

D. Bahan Penelitian …………………………………………………….. 19

E. Alat Penelitian ……………………………………………………….. 20

F. Tata Cara Penelitian ………………………………………………… 20

1. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif ………………… 20

2. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M …………….. 20

3. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8 ………….. 21

4. Pembuatan fase gerak untuk KCKT …………………......…… 21

5. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT ……………. 21


xi

6. Identifikasi para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna

rambut dan perbandingan ekstrak sampel pewarna rambut

sebelum dan sesudah clean-up dengan KCKT ………………… 22

7. Optimasi clean-up dengan SPE C18 …………………..……… 23

8. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18 …………….. 23

9. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar

adisi .................................................................................... 24

10. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna

rambut dengan metode standar adisi …………………………. 25

G. Analisis Hasil ………………………………………………………. 26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………. 30

A. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif …………………….. 30

B. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT ……………….. 31

C. Identifikasi para-phenylenediamine dalam pewarna rambut

oksidatif …………………………………………………………… 34

D. Perbandingan antara ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan

sesudah clean-up dengan SPE C18 ………………………………. 36

E. Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18 ………… 37

F. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE

C18 ………………………………………………………………… 42

G. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar

adisi ……………………………………………………………...… 44

H. Pengaruh matriks pewarna rambut dalam penetapan kadar

para-phenylenediamine (PPD) ………………………………….…. 47

I. Penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut dengan KCKT …….. 48


xii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………….. 49

A. Kesimpulan ……………………………………………………....... 49

B. Saran ……………………………………………………………….. 49

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………... 50

LAMPIRAN …………………………………………………………… 52

BIOGRAFI PENULIS ………………………………………..……….. 60


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Nilai r dan n kurva baku eksternal……..…………………. 33

Tabel II. Nilai r dan n kurva baku adisi metode clean-up dengan

SPE C18…………………………………………………….. 43

Tabel III. Rata-rata % perolehan kembali dan nilai CV perolehan

kembali metode SPE C18………………………………….. 44

Tabel IV. Nilai r dan n kurva baku adisi metode

standar adisi ………..………………………………….…… 45

Tabel V. Nilai % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali

metode penetapan kadar dengan metode standar

adisi ………………………….……………………………... 46

Tabel VI. Kadar PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif ……. 48


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur p-Phenylenediamine ………………………...….. 6

Gambar 2. Struktur molekul sodium perborat …………..………….... 8

Gambar 3. Struktur molekul asam sitrat …...…………………………. 8

Gambar 4. Proses Skematik Prosedur SPE ………………………….. 10

Gambar 5. Instrumen standar dalam KCKT ………………………... 13

Gambar 6. Kurva hubungan seri massa baku PPD dan respon

instrumen (AUC) ……………………………………….. 32

Gambar 7. (A) Kromatogram larutan sodium metabisulfit,

(B) Kromatogram baku PPD 8 µg/mL, (C) Kromatogram

sampel pewarna rambut oksidatif setelah clean-up………. 35

Gambar 8. (A) Kromatogram ekstrak sampel sebelum dilakukan

clean-up dengan SPE C18, (B) Kromatogram sampel

sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18…………… 37

Gambar 9. Skema untuk pemilihan jenis SPE ……………………… 39

Gambar 10. (A) Kromatogram dengan volume loading sampel 100µL,

(B) Kromatogram dengan volume loading sampel 1 mL,

(C) Kromatogram baku PPD ……………………………... 41

Gambar 11. Kurva hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon

instrumen metode clean-up dengan SPE …………………. 43

Gambar 12. Kurva hubungan antara massa baku adisi PPD dan respon

instrumen metode standar adisi replikasi

1,2 dan 3 ………………………………………………… 45


xv

Gambar13. Perbandingan antara kurva baku eksternal dan kurva

adisi ……………………………………………………… 47


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku para-phenylenediamine ……….. 53

Lampiran 2. Data penimbangan untuk perhitungan keseragaman

bobot sampel pewarna rambut oksidatif ……...………… 54

Lampiran 3. Tabel hubungan n dan r

(Pearson’s correlation coefficient test) ……………….. 55

Lampiran 4. Perhitungan Resolusi (Rs) …………………………….. 55

Lampiran 5. Persamaan regresi linear kurva baku eksternal

replikasi 1, 2, 3, dan kumulatif ………………………… 56

Lampiran 6. Kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE C18 .… 56

Lampiran 7. Perolehan kembali metode clean-up dengan SPE C18…. 57

Lampiran 8. Kurva baku metode standar adisi ……………………... 57

Lampiran 9. Perhitungan uji signifikansi slope kurva baku adisi

3 replikasi dengan ANOVA satu arah ………………… 58

Lampiran 10. Perolehan kembali dengan metode standar adisi ……….. 58

Lampiran 11. Penetapan kadar PPD dalam sampel pewarna rambut

oksidatif dengan metode standar adisi ………………… 59

Lampiran 12. Uji signifikansi (uji t) antara slope kurva baku eksternal

dan kurva baku adisi …………………………………… 59


xvii

INTISARI

Para-phenylenediamine (PPD) merupakan salah satu komponen dalam

pewarna rambut oksidatif. Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi

kandungan PPD dalam sediaan pewarna rambut yang diperbolehkan yaitu 6%.

Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis PPD dalam formulasi

pewarna rambut oksidatif.

Analisis PPD dalam pewarna rambut menggunakan metode KCKT yang

disertai dengan ekstraksi padat-cair dan clean-up dengan SPE C18. Ekstraksi

dilakukan dengan pelarut sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Pada SPE volume

loading sampel yang digunakan yaitu 100 µL. Sistem KCKT yang digunakan

yaitu fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACN : aquades/

ammonium hidroksida 10% (10:90), laju alir 0,5 mL/ menit dan detektor UV

dengan λ 254 nm.

Parameter validasi yang ditentukan yaitu spesifisitas, linearitas, akurasi,

presisi, dan sensitivitas. Hasil menunjukkan bahwa metode analisis PPD: spesifik

dengan nilai Rs ≥ 1,5; linear dengan koefisien korelasi (r) pada replikasi 1, 2 dan 3

berturut-turut sebesar 0,9915, 0,9942 dan 0,9932; tidak akurat dengan nilai

%perolehan kembali sebesar 104,3 – 180,0% (CV= 14,5 – 85,6%); tidak presisi

dinyatakan dengan f hitung 5,54 > f tabel sebesar 3,68, nilai DL yang diperoleh

sebesar 686 – 942 ng/mL; nilai QL yang diperoleh sebesar 2288 – 3138 ng/mL.

Kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif yaitu 2,92 – 4,58% b/b.

Kata kunci : para-phenylenediamine, pewarna rambut oksidatif, clean-up, solid

phase extraction, KCKT, validasi metode.


xviii

ABSTRACT

Para-phenylenediamine (PPD) is a compound found in oxidative hair

dyes formulation. According to Dirjen POM RI (2008), maximum concentration

of PPD in hair dyes is 6%. The purpose of this study is to validate the PPD

analysis method in oxidative hairdye formulation.

Analysis PPD in hairdye is conducted using HPLC method followed by

solid-liquid extraction and clean-up using SPE C18. Solvent for extraction is

Sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. For SPE method, volume for sample loading is

100 µL. Reversed-phase HPLC system in this study uses C18 column, mobile

phase composition of ACN : aquadest/ ammonium hidroxide 10% (10:90), flow

rate 0,5 mL/minute and UV detector at wavelength 254 nm.

Validation parameters examined are specificity, linearity, accuracy,

precision, and sensitivity. The results show validity: specific with Rs ≥ 1,5; linear

with r for replication 1, 2 and 3 in consecutive order are 0,9915, 0,9942 and

0,9932; not accurate with % recovery is 104,3 – 180,0%, not precise with f

calculated 5,54 > f table 3,68, DL is 686 – 942 ng/mL,and QL is 2288 – 3138

ng/mL. Concentration of PPD in oxidative hair dye formulation is 2,92 – 4,58%

b/b.

Key words: para-phenylenediamine, oxidative hair dyes, clean-up, solid phase

extraction, HPLC, method validation.


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Pewarna rambut adalah sediaan kosmetik yang digunakan dalam tata rias

rambut untuk mewarnai rambut atau untuk mengembalikan warna rambut asalnya

(Dirjen POM, 1985). Pewarna rambut diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu

pewarna rambut temporer, pewarna rambut semi-permanen, pewarna rambut

permanen (Azis dan Muktiningsih, 1999). Dalam pewarna rambut permanen

penyusun utamanya adalah para-phenyelenediamine atau para-aminophenol.

Para- phenyelenediamine (PPD) ini mempercepat proses pewarnaan rambut dan

mungkin dapat menyebabkan efek toksik lokal maupun sistemik saat

diaplikasikan secara topikal atau tertelan (Sutrapu, Jagadeeshwar, Nagulu, dan

Vidyasagar, 2010).

Penggunaan PPD dosis tinggi dalam jangka pendek (efek akut) dapat

menimbulkan dermatitis, mata iritasi dan berair, asma, gastritis, gagal ginjal,

vertigo, tremor, kejang, dan koma pada manusia. Dermatitis kontak eczematous

mungkin terjadi dalam penggunaan jangka panjang (efek kronis) pada manusia.

Menurut Scientific Committee on Consumer Products (SCCP), PPD merupakan

agen sensitisasi kulit yang sangat kuat. Para-phenylenediamine (PPD) merupakan

suatu alergen; bahkan apabila seseorang tidak menimbulkan reaksi saat

penggunaan pertama, mereka dapat menjadi tersensitisasi oleh PPD dan dapat

terjadi reaksi buruk saat penggunaan berulang (Al-Suwaidi dan Ahmed, 2010).

Menurut Dirjen POM RI (2008), batas konsentrasi kandungan PPD

dalam sediaan yang diperbolehkan yaitu 6%. Pada kenyataannya, konsentrasi


2

kandungan PPD pada pewarna rambut jarang dicantumkan. Pada penelitian ini,

penulis ingin melakukan validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut

oksidatif. Penelitian ini akan melalui serangkaian proses yang mencakup

identifikasi PPD dalam pewarna rambut dengan KCKT, perbandingan sebelum

dan sesudah clean-up dengan SPE C18, optimasi clean-up PPD dengan SPE C18,

validasi metode clean-up SPE C18, validasi metode penetapan kadar PPD dengan

metode standar adisi dan penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif.

Untuk menjamin bahwa metode yang digunakan dalam penelitian

berkualitas dan dapat dipercaya, maka perlu dilakukan validasi. Proses validasi

yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi parameter spesifisitas linearitas,

sensitivitas, akurasi, dan presisi.

Isolasi PPD dari matriks sampelnya menggunakan ekstraksi solven air

karena PPD mudah larut dalam air (log Kow = -0,25). Setelah dilakukan ekstraksi,

perlu dilakukan clean-up untuk mendapatkan analit yang terpisah dari matriks

sampel. Metode clean-up yang yang digunakan adalah metode Solid Phase

Extraction (SPE) dengan fase diam C18. Metode SPE C18 dipilih karena C18

bersifat non-polar sehingga diharapkan mampu menahan ko-ekstraktan pada

sampel.

Hasil yang optimal dalam clean-up dapat dicapai dengan melakukan

optimasi terlebih dahulu. Optimasi yang dilakukan yaitu dengan memvariasi

volume loading sampel. Metode clean-up dengan SPE dikatakan berhasil jika

puncak senyawa pengotor berkurang dan tidak mengganggu puncak analit. Hasil


3

clean-up diinjeksikan pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang

metodenya telah dioptimasi dan divalidasi oleh Emelia (2015).

1. Permasalahan

a. Apakah matriks formulasi pewarna rambut oksidatif terdiri dari campuran

yang kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode

pemisahan yang sesuai?

b. Apakah ko-ekstraktan dapat tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga

kurva adisi pada hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku

eksternal?

c. Apakah metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif dengan

ekstraksi larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up C18-air dapat

memenuhi kriteria validitas?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran literatur, penelitian mengenai para-phenylenediamine

pernah dilakukan. Vincent, Bordin, dan Rodriguez (2002) melakukan penelitian

mengenai validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut dengan

menggunakan sistem KCKT dengan kolom C8, fase gerak asam asetat yang

ditambah 10% amonia hingga pH 5,9 dan clean-up sampel menggunakan liquid-

liquid extraction (LLE) dengan pelarut heksan. Al-Suwaidi dan Ahmed (2010)

melalukan penelitian mengenai identifikasi dan kuantifikasi para-

phenylenediamine dalam tato temporer. Dengan demikian, penelitian mengenai

validasi metode analisis PPD dengan sistem KCKT menggunakan kolom C18,


4

fase gerak ACN: aquadest (10:90), dan clean-up menggunakan SPE C18 belum

pernah dilakukan dalam suatu sediaan pewarna rambut.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi mengenai metode analisis PPD dengan clean-up menggunakan

SPE C18 beserta parameter validasinya.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

terkait optimasi clean-up dengan SPE C18 dan memberikan informasi

bahwa metode clean-up dengan SPE C18 dapat digunakan untuk

menetapkan kadar PPD dalam pewarna rambut dengan parameter

validitasnya.

B. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui apakah matriks pewarna rambut oksidatif terdiri dari campuran

yang kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode pemisahan

yang sesuai.

2. Mengetahui apakah ko-ekstraktan tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga

kurva adisi pada hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku

eksternal.

3. Mengetahui validitas metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif

dengan ekstraksi larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up dengan C18-

air.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Pewarna Rambut

Sediaan pewarna rambut adalah sediaan kosmetik yang digunakan dalam

tata rias rambut untuk mewarnai rambut atau untuk mengembalikan warna rambut

asalnya (Dirjen POM, 1985). Pewarna rambut diklasifikasikan menjadi tiga jenis,

yaitu pewarna rambut temporer, pewarna rambut semi-permanen, pewarna rambut

permanen (Azis dan Muktiningsih, 1999).

Pewarna rambut permanen dikenal sebagai pewarna rambut oksidatif,

dan penyusun utamanya adalah para-phenyelenediamine atau para-aminophenol.

Pada umumnya, pewarna ini terdiri dari dua komponen yang harus dicampurkan

ketika akan digunakan. Dua komponen tersebut adalah alkaline agent (colorant)

dan hidrogen peroksida (developer). Alkaline agent memiliki efek membuka

lapisan rambut luar sehingga agen pengoksidasi dapat lebih mudah terpenetrasi

pada batang rambut. Selain alkaline agent, juga terdapat material yang disebut

prekursor warna, yang berguna untuk membentuk warna baru. Agen pengoksidasi

akan bereaksi dengan prekursor warna, dimana reaksi ini dikatalisis oleh alkaline

agent dan akan menghasilkan oksigen. Selanjutnya, agen pengoksidasi akan

menghilangkan warna alami dan terjadi pembentukan molekul berwarna oleh

prekursor warna dalam korteks rambut. Molekul ini resisten terhadap pencucian

sehingga dapat memberikan warna permanen. Oksigen yang dihasilkan akan

meringankan pigmen melanin alami dalam rambut sehingga warna baru dapat


6

terlihat menggantikan warna alami rambut. Kebanyakan proses pewarnaan rambut

meliputi dua proses yang berlangsung secara berkesinambungan, dimana pada

awalnya terjadi penghilangan warna alami rambut, diikuti proses pemberian

warna baru (Helmenstine, 2003). Para-phenylendiamine (PPD) atau disebut juga

1,4-diaminobenzen atau 1,4-fenilendiamin adalah suatu amin aromatik yang

digunakan dalam hampir setiap cat rambut di pasaran (Pardede, Nababan, dan

Mahadi, 2008). Komposisi pewarna rambut oksidatif pada penelitian ini terdiri

dari:

1. Para-phenylendiamine (PPD)

Gambar 1. Struktur p-Phenylenediamine (National Center for Biotechnology

Information, 2015)

PPD digunakan dalam cat rambut karena memberikan hasil yang tampak

alami, menguatkan warna yang gelap dan warnanya tahan lama. PPD juga

dapat dijumpai pada pewarna pakaian dan bulu, kosmetik, tato temporer, tinta,

karet hitam, minyak dan pelumas. PPD yang terdapat dalam cat rambut

biasanya dalam konsentrasi 6% (Pardede, Nababan, dan Mahadi, 2008).

Berdasarkan Daftar Bahan yang Diizinkan Digunakan dalam Kosmetik dengan

Pembatasan dan Persyaratan Penggunaan pada Peraturan Kepala Badan

Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor HK.00.05.42.1018


7

tentang Bahan Kosmetik (2008), kadar maksimum PPD yang diperbolehkan

dalam pewarna rambut adalah 6%.

PPD memiliki bobot molekul 108,14 g/mol, berwujud serbuk kristal

berwarna putih hingga sedikit merah, dan dapat menjadi lebih gelap saat

terpapar udara (United States Department of Labor, 1991).

PPD memiliki titik didih 267oC, titik leleh145-147

oC, densitas >1, dan

log Kow -0,25. PPD dapat larut dalam 100 bagian air, larut dalam alkohol,

kloroform, ether, dan larut dalam benzen panas. Kelarutan dalam air pada 25oC

yaitu 4% (g/100 mL). Saat terpapar udara, PPD teroksidasi menjadi warna

ungu dan hitam. (National Center for Biotechnology Information, 2015).

Panjang gelombang maksimum: 281.9 nm (Scientific Committee on Consumer

Safety, 2012). PPD mempunyai dua nilai pKa yaitu 6,42 dan 3,04 (ChemAxon,

2014).

2. Ekstrak henna (Lawsonia inermis)

Henna atau hina (Lawsonia inermis, famili Lythraceae) merupakan

tanaman berbunga yang tumbuh di daerah sub-tropis dan tropis di Afrika dan

Asia Selatan. Henna secara komersial dikembang biakkan di Moroko, Sudan,

India, Pakistan, Yemen, dan negara lainnya.

Henna mengandung molekul pewarna, lawsone (2-hidroksi -1,4-

naftokuinon). Molekul ini memiliki kemampuan untuk mengikat protein dan

secara luas digunakan untuk mewarnai kulit (tato), rambut, kuku, dan untuk

mewarnai kain dan wol. Warna yang dihasilkan kuning oranye sampai merah.


8

Untuk menghasilkan warna hitam, biasanya ditambahkan PPD sebagai

pewarna oksidasi (Al-Suwaidi dan Ahmed, 2010).

3. Sodium Perborat Tetrahidrat

Gambar 2. Struktur molekul sodium perborat tetrahidrat (Chemical Books, 2010)

Sodium perborat tetrahidrat merupakan kristal putih yang tidak berbau

dengan berat molekul 153,86 g/ mol dan berat jenis 1,73 g/ mL. pH dalam

larutan 1% pada suhu 25oC adalah 10,2. Kelarutan sodium perborat tetrahidrat

dalam air 21,5 g/L (18oC). Tekanan uap 6,2 mmHg pada suhu 20

oC. Titik leleh

pada suhu 65oC dan titik didih 130-150

oC. pKa sodium perborat tetrahidrat

yaitu 8,5 (FMC, 2006).

Menurut Scientific Committee on Consumer Safety (2010), sodium perborat

dalam air pada suhu ruang mengalami kesetimbangan menjadi hidrogen

peroksida dan sodium metaborat mengikuti persamaan reaksi sebagai berikut:

[NaBO2(OH)2 x 3 H2O]2 ⇆ 2NaBO2 + 2H2O2 + 6 H2O (1)

4. Asam Sitrat

Gambar 3. Struktur molekul asam sitrat (National Center for Biotechnology Information,

2015)


9

Asam sitrat berbentuk padat atau berupa serbuk kristal, tidak berbau,

rasanya asam. Asam sitrat mempunyai berat molekul 192,12 g/mol, berat jenis

1,665 g/mL dan titik leleh 153oC. Asam sitrat lebih larut dalam air dengan log

Kow = -1,7. Sangat larut di etanol, larut di eter, etil asetat, tidak larut dalam

benzene dan kloroform (National Center for Biotechnology Information, 2015).

5. Ekstrak Acacia concina

Acacia concina berasal dari family Acaciaceae, dikenal dengan sebutan

buah untuk rambut. Acacia concina biasa digunakan sebagai perawatan untuk

rambut di India. Bagian tanaman yang biasa digunakan untuk ekstrak yaitu

kulit pohon dan buah. Tanaman ini sudah biasa ditemukan di hutan di India.

Kulit pohonnya mempunyai kandungan saponin yang tinggi yang

merupakan foaming agent. Selain saponin terdapat juga kandungan alkaloid,

flavonoid, fitosterol, tannin, senyawa fenolic, gum, dan mucilage (Todkar,

Chavan, and Kulkarni, 2010).

6. Ekstrak Emblica officinalis

Emblica officinalis biasa disebut dengan Indian Gooseberry. Di India

tanaman ini dikenal dengan sebutan amla yang digunakan untuk pengobatan

ayurveda. Amla dapat ditemukan di atas ketinggian 5000 kaki di India. Bagian

yang biasa digunakan dalam tanaman ini yaitu buah segar, buah kering, daun,

daun, biji, akar, kulit batang dan bunga.

Tanaman ini mempunyai banyak manfaat yaitu untuk penambah daya

tahan tubuh, mengontrol diabetes, gangguan respirasi, kelainan jantung,

kelainan mata, untuk diet, anti-aging, batuk-batuk, diare, dan sebagai tonik


10

rambut. Pada penggunaan untuk rambut amla berfungsi untuk membantu

pertumbuhan rambut dan pigmentasi. Bagian yang digunakan untuk rambut

yaitu bagian buah. Kandungan kimia yang terdapat dalam tanaman ini yaitu

apigenin, asam galat, asam elagat, asam chebulinic, kuarsetin, asam

chebulagic, corilagin, isostrictiniin, metil galate, and luteolin (Kumar et. al.,

2012).

B. Solid Phase Extraction (SPE)

SPE merupakan metode praperlakuan sampel atau untuk clean-up sampel

seperti sampel yang mengandung garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain-

lain. Ada dua strategi dalam SPE yaitu (1) dengan melakukan pemilihan pelarut

yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan,

sementara untuk senyawa - senyawa penganggu akan terelusi (2) dengan

mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara untuk

senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 5. Proses Skematik Prosedur SPE (Watson, 1999)


11

Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:

a. Pengkondisian

Kolom dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap

dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan kimia yang

tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Penjerap

nonpolar dan penjerap penukar ion dikondisikan dengan menggunakan

metanol lalu dengan aquadest. Penjerap - penjerap polar seperti diol, siano,

amino, dan silika harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen

klorida.

b. Retensi sampel

Larutan sampel dilewatkan ke kolom baik untuk menahan analit yang

diharapkan, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen

yang tidak diharapkan sementara analit yang diharapkan terelusi.

c. Pembilasan

Tahap ini bertujuan untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak

tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi

Tahap terakhir untuk mengambil analit yang dikehendaki jika analit tersebut

tertahan pada penjerap

(Gandjar dan Rohman, 2007).

C. Kromatografi

Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang menggunakan fase

diam dan fase gerak. Teknik kromatografi digunakan untuk memisahkan dan


12

mengkuantifikasi berbagai macam komponen, baik komponen organik maupun

komponen anorganik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan

menjadi kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion,

kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi ukuran, dan kromatografi

afinitas. Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, yang keduanya sering disebut

dengan kromatografi planar, kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) (Gandjar dan Rohman, 2007).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT merupakan teknik yang

sering digunakan dalam analisis kimia dengan kemampuannya dalam

memisahkan, menganalisis dan memurnikan suatu senyawa. Karakter KCKT

adalah dengan menggunakan pompa bertekanan tinggi untuk mempercepat

pemisahan, kolom yang dapat disesuaikan dalam memisahkan senyawa, kolom

yang dapat digunakan berulang kali, serta hasilnya lebih presisi dan reprodusibel

(Snyder, Kirkland, and Dorlan, 2010).

Sejumlah bidang yang menggunakan KCKT antara lain farmasi,

lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT

merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis

kualitatif maupun kuantitatif. Kelemahan metode KCKT ini adalah untuk

identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa


13

(MS) dan jika sampel sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh

(Gandjar dan Rohman, 2007).

KCKT merupakan teknik dimana solute-solut terpisah oleh perbedaan

kecepatan elusi, karena solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.

Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase

diam. Keberhasilan dalam menggunakan metode KCKT dipengaruhi pemilihan

jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak,

suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Instrumen standar yang digunakan dalam KCKT meliputi:

1. Wadah fase gerak.

2. Pompa yang mampu memompa fase gerak > 4000 psi dan menghasilkan laju

alir > 10 ml/menit.

3. Loop injector (standar yang sering digunakan adalah 20 µL).

Gambar 4. Instrumen standar dalam KCKT (Watson, 1999)

4. Kolom yang biasanya dikemas dalam tabung stainless steel dengan berbagai

jenis fase diam yang dapat disesuaikan.


14

5. Detektor yang biasanya merupakan detektor UV/visibel.

6. Sistem perekam data, dapat berupa integrator atau PC software yang sesuai

untuk memproses data kromatogram.

7. Tabung penghubung di antara injektor dan detektor dengan narrow diameter

internal < 0,2 mm.

8. Instrumen yang lebih canggih mungkin memiliki sistem injeksi sampel

otomatis, memiliki oven untuk kolom, dan mampu mencampur dua atau lebih

fase gerak dengan berbagai proporsi

(Watson, 1999).

E. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah proses yang dibutuhkan memastikan

kualitas dan kepercayaan suatu hasil analisis (Ermer dan Miller, 2005). Suatu

metode analisis harus divalidasi untuk memastikan bahwa parameter-parameter

kinerjanya mampu untuk mengatasi masalah analisis. Suatu metode harus

divalidasi ketika:

1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis tertentu

2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau

ada masalah yang mengharuskan metode tersebut direvisi

3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

4. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, oleh analis yang

berbeda, atau oleh instrument yang berbeda

5. Mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode baku

dan metode baru (Gandjar dan Rohman, 2007).


15

Parameter-parameter validasi metode analisis dalam penelitian ini

meliputi:

1. Spesifisitas. Spesifisitas adalah kemampuan membedakan analit yang dituju

dengan senyawa lain yang ada dalam sampel (ICH Harmonised Tripartite,

2005).

2. Linearitas. Linearitas adalah kemampuan suatu prosedur analisis untuk

mengasilkan respon yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi

analit dalam sampel (Ermer dan Miller, 2005).

3. Sensitifitas. Sensitifitas dapat dilihat dari nilai detection limit (DL) dan

quantitation limit (QL). DL adalah jumlah analit terendah dalam sampel yang

dapat dideteksi namun tidak harus dikuantitasi. QL adalah jumlah analit

terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi

yang dapat diterima dengan metode analisis yang (ICH Harmonised

Tripartite, 2005).

4. Akurasi. Akurasi suatu prosedur analisis merupakan kedekatan antara nilai

yang sebenarnya dengan nilai yang ditemukan dalam pengujian (Ermer dan

Miller, 2005).

5. Presisi. Presisi suatu prosedur analisis adalah kedekatan nilai yang diperoleh

antar seri pengukuran yang diperoleh dari sampel homogen yang sama pada

kondisi yang ditentukan. Presisi dapat dibagi menjadi tiga yaitu keterulangan,

presisi intermediet, dan reprodusibilitas. Keterulangan adalah presisi pada

kondisi operasional yang sama dalam jangka pendek. Presisi intermediet

adalah presisi pada saat laboratorium sama namun berbeda hari, berbeda


16

peneliti, berbeda instrument, dan lain-lain. Reprodusibilitas adalah presisi

antar laboratorium (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

F. Landasan Teori

Para-phenylenediamine (PPD) merupakan salah satu komponen utama

yang digunakan dalam pewarna rambut oksidatif. Dalam penggunaan jangka

pendek atau jangka panjang PPD dapat menimbulkan efek yang tidak diinginkan.

Penggunaannya dalam jangka pendek dapat menimbulkan sensitisasi, dermatitis,

mata iritasi dan berair, asma, gastritis, gagal ginjal, vertigo, tremor, kejang, dan

koma pada manusia. Sedangkan penggunaan jangka panjang dapat menimbulkan

dermatitis kontak eczematous dan kanker pada manusia. Menurut Dirjen POM RI

(2008), kadar PPD yang diperbolehkan dalam suatu sediaan pewarna rambut

sebesar 6%. Namun, dalam kenyataannya banyak sediaan pewarna rambut yang

tidak mencantumkan kadar PPD yang ditambahkan dalam produknya.

Pada penelitian ini akan dilakukan validasi metode analisis PPD dalam

pewarna rambut oksidatif. Metode yang valid selanjutnya dapat digunakan untuk

penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif sebagai salah satu sarana

penunjang penjaminan keamanan bagi pengguna. Komponen pewarna rambut

oksidatif yang diteliti terdiri atas PPD dan sodium perborat tetrahidrat serta

memiliki matriks yang kompleks yang terdiri dari ekstrak henna, ekstrak acacia

concina ,ekstrak emblica officinalis, dan asam sitrat sehingga diperlukan metode

pemisahan yang sesuai. Pemisahan PPD dari matriks sampelnya dilakukan

dengan ekstraksi solven air (kelarutan PPD dalam air pada 25oC sebesar 4% b/v)

yang mengandung antioksidan, kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi. Setelah


17

itu, dilakukan clean-up menggunakan SPE C18 untuk memisahkan PPD dari ko-

ekstraktan yang mengganggu. PPD yang dielusi dengan air akan langsung terelusi

sementara matriks sampel akan tertahan dalam fase diam. Proses clean-up

diperlukan untuk memisahkan analit dari matriks sampel pengganggu sehingga

determinasi PPD tidak terganggu.

Hasil clean-up diinjeksikan ke KCKT fase terbalik yang sudah

dioptimasi (Emelia, 2015). Proses clean-up dikatakan berhasil apabila puncak

PPD terpisah dari puncak lainnya. Metoda analisis yang dikembangkan

merupakan metode analisis kuantitatif non-kompendial, maka parameter validasi

meliputi spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, dan ketahanan.

G. Hipotesis

1. Matriks formulasi pewarna rambut terdiri dari campuran yang kompleks

sehingga perlu dilakukan clean-up dengan metode pemisahan yang sesuai.

2. Ko-ekstraktan tertahan pada sistem SPE C18-air sehingga kurva adisi pada

hasil clean-up tidak berbeda signifikan dari kurva baku eksternal.

3. Metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif dengan ekstraksi

larutan sodium metabisulfit pH 8 dan clean-up C18-air dapat memenuhi

kriteria validitas yang diperlukan.


18

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat perlakuan

terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah volume loading ekstrak

sampel ke kolom SPE dan massa adisi PPD yang diadisikan ke sampel dan ke

esktrak sampel.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah waktu retensi, resolusi, %

perolehan kembali metode SPE C18, koefisien korelasi (r) antara massa total PPD

dan AUC, slope kurva baku adisi, koefisien variansi (CV) dan % perolehan

kembali metode standar adisi.

3. Variabel pengacau terkendali

Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan menggunakan

pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.

C. Definisi Operasional

1. Para-phenylendiamine yang dianalisis adalah senyawa aktif yang berada

dalam sampel pewarna rambut oksidatif.


19

2. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang dipergunakan adalah

seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan jenis fase diam C18, suhu

kolom, komposisi fase gerak, serta flowrate yang optimum.

3. Solid phase extraction (SPE) adalah teknik pemisahan analit dari matriks

sampelnya menggunakan fase diam berbentuk padat. SPE yang digunakan

adalah SPE C18.

4. Parameter validasi metode clean-up PPD dengan SPE adalah linearitas yang

dilihat dari koefisien korelasi (r) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan

kembali.

5. Parameter validasi metode penetapan kadar PPD dengan KCKT adalah

linearitas yang dilihat dari koefisien korelasi (r), sensitivitas yang dilihat dari

slope, presisi yang dilihat dari koefisien variansi (CV) dan akurasi yang

dilihat dari % perolehan kembali.

6. Pelarut adalah cairan yang digunakan untuk melarutkan PPD atau sampel

yaitu larutan sodium metabisulfit 0,1 M dan sodium metabisulfit 0,1 M pH 8.

7. Volume loading ekstrak sampel adalah volume ekstrak sampel yang

ditambahkan pada SPE pada saat retensi sampel.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku p-

phenylenediamine (Sigma Aldrich), pewarna rambut oksidatif, metanol,

asetonitril, larutan amonia 25% dengan kualitas pro analysis (E. Merck), sodium

metabisulfit (E. Merck), aquadest.


20

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (OHAUS

Pioneer™ PA214), instrumen KCKT yang meliputi injektor (Rheodyne 7125;

Loop 20µL), pompa (Waters Model 510) dengan sistem elusi isokratik, detektor

(Waters Associates Model 441), kolom C-18 (Shinwa Chemical Industries, LTD

STR ODS – II; dimensi 150 x 4,0 mm; 5µm), seperangkat komputer dengan CBM

(Shimadzu 102) dan perangkat lunak (Shimadzu Labsolutions: GC solution versi

2.30.00SU4, alat ultrasonifikasi (Branson 3510), alat sentifugasi (MSE 0682A),

desilator aquabidest (Thermo Scientific), organic and anorganic solvent

membrane filter (Whatman) dengan ukuran pori 0,45 μm, syringe, mikropipet

(Socorex), milipore filter, pH meter (Hanna), indikator pH universal (E.Merck),

tabung mikrosentrifus 1,5 mL (Eppendorf) dan seperangkat alat-alat gelas (Pyrex).

F. Tata Cara Penelitian

1. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif

Dua puluh bungkus pewarna rambut oksidatif disiapkan. Serbuk pewarna

rambut ditimbang satu per satu untuk pengujian keseragaman bobot. Setelah

dilakukan uji keseragaman bobot kemudian serbuk pewarna rambut

dihomogenkan dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk yang sudah

dihomogenkan disimpan dalam wadah yang kering, tertutup rapat, dan

dimasukkan ke lemari pendingin.

2. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M

sodium metabisulfit sebanyak 1,9 g ditimbang dan dilarutkan dalam

aquadest yang telah disaring dengan kertas Whatman hingga 1 L.


21

3. Pembuatan larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8

Larutan sodium metabisulfit 0,01 M ditambah dengan larutan ammonia

10 % sedikit demi sedikit sampai larutan mencapai pH 8.

4. Pembuatan fase gerak untuk KCKT

Aquadest sebanyak 90 mL yang telah ditambah amonia 10% sebanyak

100 µL dicampurkan dengan asetonitril sebanyak 10 mL. Fase gerak disaring

menggunakan kertas saring Whatman dengan dibantu pompa vakum kemudian

gas dihilangkan dengan ultrasonifikasi selama 20 menit.

5. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

a. Pembuatan larutan stok baku PPD 2 mg/mL. Larutan stok baku PPD dibuat

dengan konsentrasi 2 mg/mL dengan menggunakan pelarut larutan natrium

metabisulfit 0,01 M.

b. Pembuatan larutan intermediet PPD 40 µg/mL. Larutan intermediet PPD

dengan konsentrasi 40 g/mL dibuat dengan pengenceran stok baku PPD

dengan konsentrasi 2 mg/mL. Pengenceran menggunakan pelarut natrium

metabisulfit 0,01 M.

c. Pembuatan larutan seri baku PPD. Seri konsentrasi larutan PPD 1, 2, 3, 4, 6,

8, dan 10 ng/µL dibuat dengan mengencerkan larutan intermediet PPD

dengan fase gerak KCKT. Larutan seri konsentrasi PPD diinjeksikan ke

dalam KCKT fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak ACN :

aquades/ ammonium hidroksida 10% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/ menit,

detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm sesuai dengan hasil

optimasi Emelia (2015).


22

6. Identifikasi para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut dan

perbandingan ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan sesudah

clean-up dengan SPE C18 dengan KCKT

Pada penelitian ini dilakukan identifikasi dalam sampel pewarna rambut

dengan menggunakan KCKT. Cara yang dilakukan yaitu dengan membandingkan

waktu retensi dan bentuk puncak antara baku PPD dan sampel pewarna rambut

untuk mengetahui apakah dalam sampel pewarna rambut terdapat PPD.

a. Ekstraksi PPD dari pewarna rambut. Sampel pewarna rambut oksidatif yang

telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan

dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M

pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama 10 menit dengan kecepatan

3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50

mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8,

sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan

diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Langkah ini diulang

sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL diencerkan dengan

larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda. Sejumlah 1 mL

larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL

kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga

batas tanda.

b. Clean-up sampel dengan SPE C18. Sebelum digunakan SPE dialiri dengan

6 mL aquadest. Seratus mikroliter ekstrak sampel yang telah diencerkan

dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam tabung mikrosentrifus. Elusi


23

dilakukan dengan menggunakan 900 µL aquadest ditampung dalam tabung

mikrosentrifus yang sama.

c. Identifikasi PPD dalam eluat hasil clean-up dengan SPE. Eluat disaring

dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam sistem KCKT.

Kromatogram dibandingkan dengan kromatogram baku PPD konsentrasi 8

g/mL.

d. Perbandingan antara sampel pewarna rambut oksidatif sebelum dan sesudah

clean-up dengan SPE C18. Sejumlah eluat SPE dan larutan dalam labu takar

10 mL diambil dan diinjeksikan dalam KCKT. Kromatogram keduanya

dibandingkan.

7. Optimasi clean-up dengan SPE C18

Sebelum digunakan SPE dialiri dengan 6 mL aquadest. Sejumlah ekstrak

sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam SPE, ditampung dalam

tabung mikrosentrifus. Elusi dilakukan dengan menggunakan aquadest ditampung

dalam tabung mikrosentrifus yang sama. Optimasi clean-up dilakukan dengan

memvariasi volume loading sampel untuk mengetahui kapasitas SPE mengikat

pengotor dalam sampel. Volume loading sampel yang digunakan 100 µL dan 1

mL. Hasil clean-up dianalisis dengan menggunakan KCKT. Kromatogram

volume loading sampel dibandingkan jumlah dan besarnya puncak selain puncak

PPD.

8. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18

a. Ekstraksi PPD dari sampel pewarna rambut oksidatif. Sampel pewarna

rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang


24

300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan

sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentifus selama

10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil,

dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan

sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan

kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu

takar 50 mL. Langkah ini diulang sebanyak dua kali. Supernatan dalam labu

takar 50 mL diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga

batas tanda. Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke

dalam labu takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium

metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

b. Validasi metode clean-up PPD dengan SPE C18. Sebelum dilakukan clean-

up, ke dalam masing-masing 300 µL ekstrak sampel yang telah diencerkan

ditambah 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 µL baku PPD di dalam tabung

mikrosentrifus. Clean-up dilakukan dengan memasukkan 100, 103, 107,

110, 113 dan 117 µL dari masing-masing tabung mikrosentrifus . Elusi

dilakukan dengan 900, 897, 893, 890, 887 dan 883 µL aquadest. Eluat

disaring dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT.

9. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

a. Pembuatan kurva baku adisi dalam matriks sampel pewarna rambut. Kurva

baku adisi dibuat dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan 20 mg baku PPD

ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.


25

b. Ekstraksi PPD dalam sampel pewarna rambut. Masing-masing sampel

dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10 mL larutan sodium

metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus selama 10 menit

dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke

dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan sodium

metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000

rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL.

Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL

diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu

takar 10 mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01

M hingga batas tanda.

c. Clean-up sampel dengan SPE C18. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil

optimasi langkah 7.

d. Determinasi PPD dengan KCKT. Eluat disaring dengan menggunakan

milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT.

10. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut

dengan metode standar adisi

Sampel pewarna rambut oksidatif yang telah dihomogenkan ditimbang

seksama lebih kurang 300 mg, dimasukkan dalam tabung sentrifus, ditambah 10

mL larutan sodium metabisulfit 0,01 M pH 8. Suspensi dikocok dan disentrifus

selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Cairan supernatan diambil,

dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL. Endapan ditambah 10 mL larutan

sodium metabisulfit 0,01 M pH 8, sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan


26

3000 rpm. Cairan supernatan diambil, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL.

Langkah ini diulang sebanyak 2 kali. Supernatan dalam labu takar 50 mL

diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas tanda.

Sejumlah 1 mL larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10

mL kemudian diencerkan dengan larutan sodium metabisulfit 0,01 M hingga batas

tanda. Clean-up dilakukan sesuai dengan hasil optimasi langkah 7. Eluat disaring

dengan menggunakan milipore dan diinjeksikan ke dalam KCKT. Penetapan kadar

dilakukan dengan metode standar adisi dengan menambahkan 2, 4, 7, 10, 15 dan

20 mg baku PPD ke dalam masing-masing 300 mg sampel pewarna rambut.

G. Analisis Hasil

1. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas dan sensitivitas

dengan melihat dari kurva baku PPD.

a. Linearitas. Linearitas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Luas area

diplotkan terhadap massa PPD (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh

persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a (ICH Harmonised

Tripartite, 2005).

b. Sensitivitas. Sensitivitas dapat ditentukan dengan nilai slope, DL, dan QL.

1) Slope didapatkan dari persamaan regresi linear y= bx+a (b = slope; a =

intersep).

2) DL dapat dihitung dengan rumus:

DL = 3,3 ×𝜎

𝑆 (1)


27

Keterangan:

σ = standar deviasi dari respon

S = slope kurva baku eksternal

3) LOQ dapat dihitung dengan rumus:

QL= 10 ×𝜎

𝑆 (2)

Keterangan:

σ = standar deviasi dari respon

S = slope kurva baku eksternal

(ICH Harmonised Tripartite, 2005).

2. Analisis hasil identifikasi PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif

Data kromatogram antara sampel dan baku PPD dibandingkan (ICH

Harmonised Tripartite, 2005).

3. Analisis hasil perbandingan sampel sebelum dan sesudah clean-up

dengan SPE C18

Data kromatogram antara sampel sebelum SPE dan sesudah SPE

dibandingkan dan nilai resolusi antara puncak analit dan puncak terdekat dihitung

(ICH Harmonised Tripartite, 2005).

Dalam KCKT, resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu

retensi dua puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.

Resolusi (Rs) dapat dihitung dengan rumus:

Rs = 2∆𝑡𝑅

𝑊1+𝑊2 (3)

(Ahuja and Dong, 2005).


28

4. Analisis hasil optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Data kromatogram antara volume loading sampel 100 µL dan volume

loading sampel 1000 µL dibandingkan (ICH Harmonised Tripartite, 2005).

5. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas, akurasi, dan presisi

(keterulangan).


diplotkan terhadap massa total PPD yang ada dalam ekstrak pewarna

rambut yang telah diadisi (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh

persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a (ICH Harmonised

Tripartite, 2005).

b. Akurasi. Akurasi dinyatakan dengan % perolehan kembali.

% perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

% perolehan kembali = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 − (𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 )

(𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑚𝑏𝑎 ℎ𝑘𝑎𝑛 ) x 100% (4)

c. Presisi (keterulangan). Presisi (keterulangan) dinyatakan dengan nilai

coefficient of variation (CV). CV dihitung pada setiap replikasi.

Rumus CV yaitu:

CV = 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖

𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 x 100% (5)

5. Validasi penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

Parameter validasi yang ditetapkan yaitu linearitas, sensitivitas, akurasi

dan presisi intermediet.


diplotkan terhadap massa total PPD yang ada dalam sampel pewarna


29

rambut yang telah diadisi (minimum 5 konsentrasi) untuk memperoleh

persamaan regresi linear dengan persamaan y = bx + a.

b. Sensitivitas. Sensitivitas ditentukan dengan nilai slope. Slope didapatkan

dari persamaan regresi linear y= bx+a (b = slope; a = intersep).

c. Akurasi. Akurasi dinyatakan dengan % perolehan kembali.

% perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus (4).

d. Presisi intermediet. Presisi intermediet kurva baku adisi ditentukan dengan

uji signifikansi nilai slope 3 replikasi antarhari seri kurva baku adisi

menggunakan ANOVA satu arah.

6. Pengaruh matriks pewarna rambut dalam penetapan kadar para-

phenylenediamine (PPD)

Slope kurva baku dibandingkan dengan slope kurva baku adisi untuk

mengetahui pengaruh matriks pada metode analisis PPD dalam pewarna rambut.

Perbedaan slope dihitung melalui uji signifikansi (uji t).

7. Penetapan kadar para-phenylenediamine (PPD) dalam pewarna rambut

dengan metode standar adisi

Penetapan kadar dihitung dengan persamaan kurva baku adisi. Besarnya

kesalahan ditentukan dengan faktor ketidakpastian (µ).


30

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Para-phenylenediamine (PPD) adalah salah satu senyawa yang

digunakan dalam pewarna rambut tipe oksidasi. Penggunaan PPD dalam pewarna

rambut dapat menimbulkan alergi dan bahkan kanker. Menurut Dirjen POM RI

(2008), batas konsentrasi kandungan PPD dalam sediaan pewarna rambut sebesar

6%, namun konsentrasi kandungan PPD dalam pewarna rambut tidak

dicantumkan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini peneliti ingin menetapkan

validasi metode analisis PPD dalam pewarna rambut oksidatif. Penetapan kadar

PPD dalam pewarna rambut oksidatif diawali dengan ekstraksi dengan solven air

kemudian dilakukan clean-up dengan SPE C18 dan diinjeksikan dalam KCKT.

Menurut Emelia (2015), metode KCKT memiliki validitas yang baik dengan

persamaan regresi linear y= 2267,62792 x – 46155,41523; koefisien korelasi (r) =

0,9922, %CV= 2-11% ; LOD= 489 ng/mL.

A. Penyiapan sampel pewarna rambut oksidatif

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari enam toko

yang ada di Yogyakarta. Sampel yang diambil berasal dari batch yang sama

dengan tujuan sampel mengalami proses produksi yang sama sehingga lebih

homogen. Sebelum sampel dianalisis, dilakukan uji keseragaman bobot untuk

memastikan bahwa kadar senyawa PPD yang terkandung dalam setiap sediaan

pewarna rambut seragam.

Uji keseragaman bobot dilakukan dengan cara menimbang satu per satu

isi dari 20 bungkus, mencampurkan isi 20 bungkus tersebut dan ditimbang,


31

kemudian dihitung bobot rata-ratanya. Syarat penyimpangan terhadap

penimbangan satu per satu terhadap bobot rata-rata tidak lebih dari 15% untuk 2

bungkus dan dan tidak lebih dari 10% untuk 18 bungkus (Syamsuni, 2005).

Bobot rata-rata hasil penimbangan 20 bungkus yaitu 9,0 g. Data hasil

penimbangan (Lampiran 2) menunjukkan ada 7 kemasan yang bobotnya

menyimpang lebih dari 10% dari bobot rata-rata dan 3 kemasan yang bobotnya

lebih dari 15% dari bobot rata-rata. Oleh karena itu, pewarna rambut oksidatif

yang digunakan dalam penelitian ini tidak memenuhi syarat keseragaman bobot.

PPD merupakan senyawa yang mudah teroksidasi (tidak stabil) saat

terpapar dengan udara. Sehingga perlu dilakukan penjaminan agar metode tetap

robust dengan cara sampel disimpan dengan mengalirkan gas nitrogen ke dalam

wadah kemudian ditutup dengan rapat dan disimpan dalam lemari pendingin. PPD

akan teroksidasi saat terpapar udara, sehingga diperlukan nitrogen untuk

menggantikan posisi udara dalam wadah dan ditutup rapat untuk mencegah

masuknya udara. Wadah disimpan dalam lemari pendingin untuk menjaga

kestabilan sampel.

B. Validasi metode pengukuran PPD dengan KCKT

Validasi metode pengukuran adalah suatu prosedur penjaminan bahwa

metode pengukuran yang digunakan dapat dipercaya dan diterima sehingga dapat

digunakan untuk pengukuran tertentu. Validasi metode pengukuran dilakukan

dengan pembuatan kurva baku PPD. Parameter validasi yang digunakan yaitu

linearitas dan sensitivitas.


32

Pembuatan kurva baku PPD bertujuan untuk mengetahui apakah

hubungan antara massa analit dan respon instrumen linear. Larutan seri

konsentrasi PPD yang digunakan yaitu 1, 2, 3, 4, 6, 8, dan 10 ng/µL. Pelarut yang

digunakan dalam pembuatan kurva baku adalah air yang diberi antioksidan

sodium metabisulfit untuk mencegah oksidasi PPD. Persamaan regresi linear yang

didapat merupakan hubungan antara massa PPD dan respon instrumen.

Hubungan antara seri massa baku dan respon instrumen ditunjukkan oleh

Gambar 1 dengan nilai slope = 2699,1; intercept = - 101178 dan r = 0,9855. Hasil

tersebut menunjukkan hubungan antara massa baku PPD dan respon instrumen

linear dan dapat digunakan dalam penelitian ini.

Gambar 6. Kurva hubungan seri massa baku PPD dan respon instrumen (AUC)

Linearitas merupakan kemampuan metode analisis dalam memberikan

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Batasan koefisien korelasi yang

digunakan dalam penelitian ini menggunakan batasan dari Pearson’s correlation

coefficient test yang dapat dilihat pada Lampiran. Linearitas dinyatakan dalam

nilai koefisien korelasi (r), dimana koefisien korelasi memiliki hubungan dengan

-100000

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0 100 200 300 400

AU

C

Massa adisi PPD (ng/20 µL)


33

banyaknya determinasi yang dilakukan (n). Bila r yang didapat dari regresi linear

nilainya lebih besar daripada yang ada pada tabel, maka secara statistik hubungan

linearitas pada kurva baku sudah terpenuhi.

Pada penelitian ini juga dilakukan uji linearitas pada hari yang berbeda

untuk memastikan bahwa instrumen yang digunakan tetap valid meskipun

dilakukan pada hari yang berbeda. Hal ini dilakukan karena berdasarkan

pengalaman selama penelitian PPD mudah teroksidasi. Hasil uji linearitas

ditunjukkan pada Tabel I.

Tabel I. Nilai r dan n kurva baku eksternal PPD

Replikasi r penelitian n r tabel

1 0,9941 7 0,754

2 0,9974 6 0,811

3 0,9925 6

4 0,9956 5 0,878

r kumulatif 0,9855 24 0,404

Tabel I menunjukkan bahwa r kurva baku PPD sudah memenuhi parameter

linearitas dalam tabel Pearson’s correlation coefficient test, sehingga hubungan

antara massa PPD dan respon instrumen dinyatakan linear secara statistik.

Sensitivitas dapat dinyatakan dengan nilai slope, paramater detection limit

(DL) dan quantification limit (QL). Semakin besar nilai slope maka semakin baik

sensitivitas, semakin kecil nilai DL dan QL semakin baik sensitivitas. Nilai slope

kumulatif yang diperoleh yaitu 2699,1. Nilai DL dan QL yang didapat secara

berturut-turut yaitu 686 - 942 ng/mL dan 2288 – 3138 ng/mL.


34

C. Identifikasi para-phenylenediamine dalam pewarna rambut oksidatif

Identifikasi PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif perlu dilakukan

dilakukan untuk mengetahui apakah di dalam pewarna rambut oksidatif yang

digunakan terdapat PPD atau tidak. Identifikasi dilakukan dengan

membandingkan kromatogram antara baku PPD dan sampel pewarna rambut

oksidatif. Pada metode KCKT, diperlukan sampel yang analitnya sudah terpisah

dari ko-ekstraktan dalam sampel agar tidak mengganggu determinasi analit, oleh

karena itu dilakukan clean-up dengan Solid Phase Extraction (SPE). Berikut

perbandingan puncak antara pelarut, baku PPD dan sampel:


35

Gambar 7. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air (10:90), laju

alir = 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) Larutan sodium metabisulfit, tR = 2,147

menit (B) Baku PPD 8 g/mL, tR = 4,834 menit (C) Sampel pewarna rambut oksidatif

setelah clean-up, tR PPD = 4,872 menit

Gambar 7 menunjukkan bahwa dalam sampel pewarna rambut oksidatif

terdapat PPD yang ditunjukkan oleh adanya waktu retensi (tR) yang sama pada

kromatogram baku PPD dan sampel yaitu pada tR 4,8 menit (Gambar 7B dan 7C).

A

B

C


36

Puncak yang muncul di sekitar tR1,9 – 2,1 menit adalah puncak dari pelarut yang

digunakan yaitu sodium metabisulfit yang dibuktikan oleh Gambar 7A.

D. Perbandingan antara ekstrak sampel pewarna rambut sebelum dan

sesudah clean-up dengan SPE C18

Formulasi pewarna rambut oksidatif dalam penelitian ini mempunyai

komposisi yang kompleks yaitu PPD, sodium perborat tetrahidrat, ekstrak henna,

ekstrak Acacia concina, ekstrak Emblica officinalis, dan asam sitrat. Oleh karena

itu, dibutuhkan proses clean-up dengan SPE yang bertujuan untuk memisahkan

PPD dari matriks sampel (ko-ekstraktan) yang mengganggu dalam deteksi analit.

Pada penelitian ini dibandingkan antara ekstrak sampel sebelum dan sesudah

dilakukan clean-up dengan SPE C18 untuk melihat apakah metode clean-up

dengan SPE C18 ini dapat memisahkan PPD dari matriks sampelnya.


37

Gambar 8. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air (10:90), laju alir

= 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) ekstrak sampel sebelum dilakukan clean-up dengan

SPE C18, (B) Ekstrak sampel sesudah dilakukan clean-up dengan SPE C18

Gambar 8 menunjukkan bahwa clean-up dengan SPE C18 dapat

memisahkan PPD dari matriks sampel yang mengganggu dalam determinasinya.

Pada Gambar 8B dapat dilihat puncak PPD muncul pada tR 4,8 menit dan

terpisah dari puncak lainnya dengan resolusi ≥ 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa

metode yang digunakan sudah memenuhi parameter spesifisitas.

E. Optimasi clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Ekstraksi merupakan proses untuk mengambil analit yang dituju dari

matriks sampelnya. Ekstraksi yang dilakukan menggunakan pelarut air yang

diberi antioksidan sodium metabisulfit pada pH 8. Sodium metabisulfit dipilih

A

B


38

sebagai antioksidan karena merupakan antioksidan yang kuat dan stabil sehingga

dapat mencegah oksidasi PPD. PPD merupakan senyawa yang bersifat basa lemah

dengan pKa 6,42 dan 3,04. Menurut Corbett (1972), laju auto-oksidasi PPD

minimal terjadi saat pH 8, oleh karena itu digunakan pelarut dengan pH 8 untuk

meminimalkan auto-oksidasi pada PPD dan sekaligus untuk membuat PPD dalam

bentuk molekulnya. Endapan dan cairan solven dipisahkan dengan teknik

sentrifugasi.

Metode sentrifugasi dapat memisahkan PPD yang terekstrak dengan

matriks sampel dengan proses yang memanfaatkan gaya sentrifugal untuk

sedimentasi campuran. Komponen yang mempunyai massa jenis lebih besar akan

mengendap, menyisakan cairan supernatan yang mudah diambil. PPD akan berada

dalam larutan supernatan karena PPD larut dalam air.

Clean-up merupakan praperlakukan sampel yang bertujuan untuk

memisahkan analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin menganggu

pada saat pengukuran atau deteksi analit. Pada penelitian ini clean-up dilakukan

dengan metode solid phase extraction (SPE) karena praktis dan hemat pelarut

(Watson, 1999). Strategi yang digunakan dalam clean-up dengan SPE ada 2

macam yaitu dengan memilih pelarut yang mampu mengelusi analit sehingga

analit tertahan pada penjerap dan komponen pengganggu terelusi atau dengan

memilih pelarut yang langsung dapat mengelusi analit sementara komponen

pengganggu tertahan dalam penjerap.

Pemilihan jenis SPE yang digunakan berdasarkan skema yang terdapat

dalam Gambar 9. Pada penelitian ini, matriks sampel bersifat aqueous karena


39

digunakan air sebagai pelarut sampel. PPD bersifat polar dengan log Kow -0,25

sehingga PPD mudah larut dalam air. PPD bersifat basa lemah sehingga pH perlu

dijaga dengan cara membuat pH pelarut menjadi pH 8 untuk menjaga PPD tetap

dalam bentuk molekulnya (netral). Oleh karena itu, PPD akan sulit tertahan dalam

penjerap sehingga diperlukan penjerap yang mampu menahan komponen

pengotornya.

Gambar 9. Skema untuk pemilihan jenis SPE (Sigma-Aldrich, 1998).

Komponen-komponen yang kemungkinan terjerap adalah senyawa-

senyawa dalam ekstrak henna, ekstrak Acacia concina dan ekstrak Emblica


40

officinalis. Sodium perborat tetrahidrat dan asam sitrat akan langsung terelusi.

Berdasarkan skema tersebut, maka SPE yang digunakan dalam penelitian ini yaitu

SPE C18. Strategi dalam SPE yang digunakan yaitu dengan menahan komponen

pengotor pada penjerap sementara PPD langsung terelusi. SPE yang digunakan

bersifat sangat nonpolar karena sudah di-endcapped dengan C18. Oleh karena itu,

PPD akan langsung terelusi sementara komponen pengotor akan tertahan dalam

penjerap.

Menurut Watson (1999), pengkondisian SPE perlu dilakukan dengan

menggunakan pelarut sampel dengan volume 5-10 kali volume fase diam.

Pengkondisian bertujuan untuk membasahi permukaan fase diam dan untuk

menciptakan nilai pH yang sesuai sehingga perubahan kimia yang tidak

diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Setelah dilakukan

pengkondisian, ekstrak sampel dimasukkan dalam SPE (loading). Untuk

memperoleh hasil yang optimal maka dilakukan optimasi volume loading ekstrak

sampel.

Pada penelitian ini, optimasi volume loading ekstrak sampel dilakukan

untuk melihat kapasitas SPE dalam mengikat pengotor pada sampel. Kemampuan

penjerap dalam menahan pengotor yang ada di dalam sampel dapat diketahui

dengan memvariasi banyaknya pengotor dengan cara merubah volume larutan

sampel yang dimasukkan dalam SPE. Variasi volume loading ekstrak sampel yang

digunakan dalam penelitian ini yaitu 100 µL dan 1 mL. Eluat hasil SPE kemudian

ditampung dalam tabung mikrosentrifus dan disaring dengan milipore dan


41

diinjeksikan dalam KCKT. Hasil optimasi volume loading ekstrak sampel

ditunjukkan oleh Gambar 10.

Gambar 10. Kromatogram dengan fase diam C18, fase gerak asetonitril:air

(10:90), laju alir = 0,5 mL/menit, volume inject 20 µL (A) Volume loading sampel 100 µL, (B)

Volume loading sampel 1 mL, (C) Baku PPD 8 g/mL

Gambar 10 menunjukkan bahwa puncak PPD muncul pada tR sekitar 4,8

menit dan puncak sodium metabisulfit muncul pada tR sekitar 1,9 menit. Jika

A

B

C


42

dilihat dari kromatogram di atas dapat disimpulkan bahwa volume loading sampel

100 µL lebih baik dibandingkan volume loading sampel 1 mL karena pada

volume loading sampel 100 µL puncak yang dihasilkan lebih sedikit daripada

volume loading sampel 1 mL. Jumlah puncak lebih sedikit berarti jumlah

pengotor lebih sedikit yang disebabkan karena pengotor dapat tertahan pada

penjerap (kapasitas SPE belum terlampaui). Kromatogram volume loading sampel

1 mL menghasilkan puncak yang banyak. Jumlah puncak banyak berarti banyak

pengotor yang ikut terelusi karena kapasitas SPE sudah terlampaui.

F. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE C18

Validasi metode adalah suatu prosedur penjaminan bahwa metode yang

digunakan dapat dipercaya dan diterima sehingga dapat digunakan untuk

pengukuran tertentu. Validasi metode clean-up PPD dalam sampel dengan SPE

bertujuan untuk memastikan bahwa metode SPE yang digunakan dalam penelitian

memenuhi parameter validitas yaitu akurasi dan linearitas.

Uji linearitas metode clean-up dilakukan dengan meningkatkan jumlah

PPD yang diadisikan ke dalam ekstrak sampel sehingga dapat diketahui apakah

peningkatan adisi PPD diikuti dengan peningkatan respon instrumen secara linear.

Hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon instrument dapat

dilihat dari Gambar 6 dengan nilai slope = 3286,7175; intercept = 153442,7028

dan r = 0,9783. Hasil tersebut menunjukkan bahwa peningkatan adisi PPD diikuti

dengan peningkatan respon instrumen secara linear.


43

Gambar 11. Kurva hubungan antara seri massa adisi PPD dan respon instrumen metode

clean-up dengan SPE

Linearitas merupakan kemampuan metode analisis dalam memberikan

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan. Batasan koefisien korelasi yang digunakan dalam penelitian ini

menggunakan batasan dari Pearson’s correlation coefficient test yang dapat

dilihat pada Lampiran 3.

Tabel II. Nilai r dan n kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE c18


1 0,9914

6 0,811 2 0,9813

3 0,9829

kumulatif 0,9783 18 0,468

Tabel II menunjukkan bahwa secara statistik hubungan antara massa adisi

PPD dan respon instrumen metode clean-up dengan SPE linear.

Akurasi merupakan ketelitian metode atau kedekatan nilai terukur

dengan nilai sebenarnya (Gandjar dan Rohman, 2007). Tujuan penghitungan

%perolehan kembali yaitu untuk mengetahui seberapa besar PPD yang dapat ter-

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 50 100 150

AU

C

Massa adisi dalam 20 µL (ng)


44

cover selama proses clean – up dengan SPE C18. Hasil % perolehan kembali

masing-masing adisi ditunjukkan oleh Tabel III.

Tabel III. Rata-rata % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali metode SPE C18

Adisi PPD (µg/300µL ekstrak sampel) Rata-rata perolehan kembali

(%)

CV

(%)

4,004 81,77 16,23

8,008 76,41 39,50

12,012 93,83 22,75

16,016 94,89 6,59

20,02 103,61 20,37

Menurut AOAC (2012), kisaran % perolehan kembali yang

diperbolehkan yaitu 80 – 110% dan nilai CV yang diperbolehkan yaitu 11%. Pada

Tabel III, % perolehan kembali menunjukkan bahwa metode clean-up dengan

SPE C18 akurat, sedangkan nilai CV menunjukkan bahwa nilai %perolehan

kembali yang diperoleh tidak presisi.

G. Validasi metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

Parameter validasi metode penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut

dengan KCKT yaitu linearitas, sensitivitas, akurasi, dan presisi. Metode standar

adisi digunakan dengan alasan karena matriks sampel pewarna rambut sangat

kompleks sehingga kemungkinan mempengaruhi analit dan tidak memungkinkan

membuat blanko yang sama persis dengan sampel. Apabila ternyata matriks

sampel memberikan pengaruh yang signifikan, maka penetapan kadar harus

menggunakan kurva baku adisi. Metode standar adisi dilakukan dengan cara

menambahkan sejumlah massa baku PPD secara bertingkat ke dalam sampel

diawal sebelum preparasi sampel. Hasil preparasi diinjeksikan dalam KCKT.


45

Hubungan antara seri konsentrasi baku dan respon instrumen dapat

dilihat dari Gambar 7 dengan nilai slope replikasi 1,2 dan 3 secara berturut-turut

sebesar 2927,0, 2789,9 dan 2405,1; intercept replikasi 1,2 dan 3 secara berturut-

turut sebesar 159718, 145902, dan 85574, dan nilai koefisien korelasi (r) replikasi

1, 2 dan 3 secara berturut-turut yaitu 0,9915, 0,9942 dan 0,9932. Hasil tersebut

menunjukkan hubungan antara massa baku PPD dan respon instrumen linear.

Gambar 12. Kurva hubungan antara massa baku adisi PPD dan respon instrumen replikasi

1,2 dan 3

Uji linearitas metode penetapan kadar dengan metode standar adisi

dilakukan sebanyak 3 kali replikasi (berbeda hari) untuk memastikan metode tetap

valid setiap kali penetapan kadar dilakukan. Hasil uji linearitas dapat dilihat dalam

Tabel IV.

Tabel IV. Nilai r dan n kurva baku adisi metode standar adisi


1 0,9915

6 0,811 2 0,9942

3 0,9932

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0 20 40 60 80 100

AU

C


Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3


46

Tabel IV menunjukkan bahwa nilai r kurva baku adisi 3 replikasi sudah

memenuhi parameter linearitas dalam tabel Pearson’s correlation coefficient test

(Lampiran 3), sehingga kurva baku adisi yang digunakan sudah dinyatakan linear

secara statistik.

Sensitivitas metode penetapan kadar PPD dengan metode standar adisi

dapat ditentukan dari nilai slope. Nilai slope semakin besar berarti sensitivitas

semakin baik. Pada penelitian ini didapatkan nilai slope 3 replikasi berturut-turut

sebesar 2927,0; 2789,9; dan 2405,1.

Pada penelitian ini akurasi metode analisis PPD dihitung dari %perolehan

kembali sampel yang ditambahkan dengan baku PPD dari awal proses preparasi.

Persen perolehan kembali dapat dilihat dalam Tabel V.

Tabel V. Nilai % perolehan kembali dan nilai CV perolehan kembali metode penetapan

kadar dengan metode standar adisi

Adisi PPD dalam 300 mg sampel

(mg)

Rata-rata perolehan kembali

(%)

CV

(%)

2 180,0 85,6

4 132,0 37,6

7 126,6 21,8

10 121,9 35,0

15 104,4 14,5

20 122,7 22,7

Menurut AOAC (2012), kisaran % perolehan kembali yang

diperbolehkan yaitu 80 - 110% dan nilai CV yang diperbolehkan yaitu 11%. Pada

Tabel V, % perolehan kembali menunjukkan bahwa metode penetapan kadar

dengan metode standar adisi tidak akurat dan nilai CV menunjukkan bahwa nilai

%perolehan kembali yang diperoleh tidak presisi.


47

Presisi intermediet metode standar adisi dihitung dengan uji signifikansi

nilai slope 3 replikasi antarhari seri kurva baku adisi menggunakan ANOVA satu

arah. Hasil dari uji signifikansi dengan ANOVA satu arah didapatkan nilai f

hitung sebesar 5,54 dan f tabel sebesar 3,68 (f hitung > f tabel). Dari data tersebut

dapat diketahui bahwa kurva baku adisi yang didapatkan pada hari yang berbeda-

beda berbeda signifikan, sehingga metode penetapan kadar PPD dengan metode

standar adisi tidak presisi. Hal ini menyebabkan kurva baku adisi harus dibuat

setiap hari.

H. Pengaruh matriks pewarna rambut dalam penetapan kadar para-

phenylenediamine (PPD)

Gambar 13. Perbandingan antara kurva baku eksternal dan kurva adisi

Pengujian pengaruh matriks sampel dalam penetapan kadar PPD

bertujuan untuk melihat signifikan atau tidaknya pengaruh matriks dalam sampel

pewarna rambut yang dapat ditentukan melalui uji signifikansi (uji t). Hasil uji

signifikansi perbedaan slope antara kurva baku eksternal dan kurva baku adisi (P=

0,05) yaitu t hitung = 2,14 dan t tabel = 2,03. Kesimpulan yang didapat yaitu t

y = 2283,5x - 57881

r = 0,9896

y = 2484,6x + 136569

r = 0,8539

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

0 50 100 150 200 250

AU

C


kurva eksternal kurva adisi


48

hitung > t tabel yang berarti slope antara kurva baku eksternal dan kurva baku

adisi berbeda signifikan, artinya matriks sampel berpengaruh signifikan terhadap

sensitifitas dan penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif.

I. Penetapan kadar PPD dalam pewarna rambut dengan KCKT

Pada penelitian ini dilakukan penetapan kadar sebanyak tiga kali

replikasi dengan metode standar adisi. Kadar PPD pada tiap replikasi dapat dilihat

dalam Tabel VI.

Tabel VI. Kadar PPD dalam sampel pewarna rambut oksidatif

Menurut Dirjen POM RI (2008), kadar PPD yang diperbolehkan dalam

suatu sediaan pewarna rambut adalah 6%. Hasil validasi metode analisis PPD

dalam pewarna rambut oksidatif dinyatakan tidak valid sehingga penetapan kadar

dihitung dengan faktor ketidakpastian. Faktor ketidakpastian (uncertainty factor)

adalah nilai yang digunakan untuk mengkompensasi metode analisis yang tidak

valid (Lalanne, 1999). Tabel VI menunjukkan range kadar PPD yang diperoleh

dalam penelitian yaitu sebesar 2,92 – 4,57%. Oleh karena itu dapat disimpulkan

bahwa kadar PPD dalam pewarna rambut oksidatif masih sesuai dengan ketentuan

Dirjen POM RI (2008).

Replikasi Kadar PPD ± faktor ketidakpastian

(% b/b)

Range Kadar

(% b/b)

1 4,54 ± 0,03 4,51 – 4,57

2 4,36 ± 0,03 4,32 – 4,39

3 2,96 ± 0,04 2,92 – 3,00


49

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

1. Matriks formulasi pewarna rambut oksidatif terdiri dari campuran yang

kompleks sehingga perlu dilakukan clean-up.

2. Ko-ekstraktan tertahan pada sistem SPE C18-air namun kurva baku adisi hasil

clean-up berbeda signifikan dengan kurva baku eksternal.

3. Hasil validasi metode penetapan kadar PPD dalam formulasi pewarna rambut

oksidatif pada penelitian yaitu metode dinyatakan spesifik dengan Rs ≥ 1,5;

linear dengan koefisien korelasi (r) replikasi 1,2 dan 3 berturut turut adalah

0,9915, 0,9942 dan 0,9932; metode dinyatakan tidak akurat dengan perolehan

kembali sebesar 104,3 – 180,0% (CV= 14,5 – 85,6%); metode dinyatakan tidak

presisi dengan f hitung 5,54 dan f tabel sebesar 3,68 (f hitung > f tabel), nilai

DL yang diperoleh sebesar 686 – 942 ng/mL; nilai QL yang diperoleh sebesar

2288 – 3138 ng/mL.

B. SARAN

1. Perlu dilakukan validasi metode saat sampel diinjeksikan dalam KCKT untuk

melihat seberapa besar pengaruh sistem KCKT terhadap determinasi PPD.

2. Penanganan sampel perlu lebih diperhatikan lagi karena PPD sangat mudah

teroksidasi.

3. Perlu dibuat blanko untuk mendapat hasil yang valid.


50

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S., and Dong, M.W., 2005, Pharmaceutical Analysis by HPLC, United

Kingdom, p. 28.

Al-Suwaidi, A., and Ahmed, H., 2010, Determination of para-Phenylenediamine

(PPD) in Henna in the United Arab Emirates, Int J Environ Res Public

Health, 7(4), 1681–1693.

AOAC International, 2012, Appendix F: Guidelines for Standard Method

Performance Requirements, AOAC International, p. 9.

Azis, S., and Muktiningsih, S. R., 1999, Studi Kegunaan Sediaan Rambut, Media

Litbangkes, 9 (1), 6 – 11.

Chemical Books, 2010, Sodium Perborat Tetrahydrate MSDS,

http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB721457

8.html, diakses tanggal 18 April 2014.

ChemAxon, 2014, p-Phenylenediamine base,

http://www.chemicalize.org/structure/#!mol=p-

phenylenediamine&source=fp, diakses tanggal 2 Agustus 2014.

Corbett, J. F., 1972, The Auto Oxidation of p-Phenylenediamine, J. Soc. Cosmet.

Chem., 23, 683 – 693.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1985, Formularium

Kosmetika Indonesia, Jakarta, hal. 208, 213.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2008, Persyaratan Teknis

Bahan Kosmetika, Jakarta, hal. 40.

Emelia, V., 2015, Optimasi Penetapan Kadar p-Phenylenediamine (PPD) dan Uji

Kesesuaian Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Tesis,

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Ermer, J., and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical

Analysis, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,Weinheim, pp. 3, 21,

63, 80.

FMC, 2006, Sodium Perborate Tetrahydrate MSDS,

http://msds.formulacorp.com/pdf/msds_eng/sodium_perborate.pdf, diakses

tanggal 18 April 2014.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, hal. 46, 53-55, 323-324, 378-379, 460, 463-464, 468.

Helmenstine, A. M., 2003, Hair Color Chemistry Bleaching & Dyeing, Science

World, 60 (6), 12.

ICH Harmonised Tripartite, 2005, Validation of Analytical Procedures: Text And

Methodology Q2(R1), ICH Harmonised Tripartite, pp. 4-13.

Kumar, K.P. S., Bhowmik, D., Dutta, A.,Yadav, A., Paswan, S., Srivastava, S.,

Deb, L., 2012, Recent Trends in Potential Traditional Indian Herbs

Emblica officinalis and Its Medicinal Importance, Journal of

Pharmacognosy and Phytochemistry, 1 (1), 24 – 32.

Lalanne, C., 1999, Specification Development, Hermes Science Publication, Paris,

p. 198.


http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB7214578.html

http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB7214578.html

http://www.chemicalize.org/structure/#!mol=p-phenylenediamine&source=fp

http://www.chemicalize.org/structure/#!mol=p-phenylenediamine&source=fp

http://msds.formulacorp.com/pdf/msds_eng/sodium_perborate.pdf

51

Miller, J. C., and Miller, J. N., 1984, Statistic for Analytical Chemistry, Ellis

Horwood Limited, West Sussex, pp. 96 – 97.

National Center for Biotechnology Information, 2015, PubChem Compound

Database: Citric Acid, CID=311,

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/311, diakses tanggal 6 Jui

2015.

National Center for Biotechnology Information, 2015, PubChem Compound

Database: p-Phenylenediamine, CID=7814,

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/7814, diakses tanggal 6 Juni

2015.

Pardede, S. Y. M. H., Nababan, K. A., dan Mahadi, I. D. R., 2008, Dermatitis

Kontak Alergi Karena Cat Rambut, Majalah Kedokteran Nusantara, 41

(3), 179-184.

Scientific Committee on Consumer Safety, 2012, Opinion on p-

Phenylenediamine, European Commission, Europe, pp. 7-8.

Sigma-Aldrich, 1998, Guide to Solid Phase Extraction, Supelco Bulletin 910, 12.

Snyder, L. R., Kirkland, J. J., and Dolan, J. W., 2010, Introduction to Modern

Liquid Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. xxxi,

3.

Sutrapu, S., Jagadeeshwar, K., Nagulu, M., Vidyasagar, J., 2010, Oxidative Stress

and Anti-oxidant Status in Hair Dye Poisoning, International Journal of

Pharmacognosy and Phytochemical Research, 3(1):1-5.

Syamsuni, H., 2005, Farmasetika Dasar Dan Hitungan Farmasi, Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 59.

Todkar, S. S., Chavan, V. V., and Kulkarni, A. S., 2010, Screening of Secondary

Metabolites and Antibacterial Activity of Acacia concinna, Research

Journal of Microbiology, 5 (10), 974-979.

United States Department of Labor, 1991, m-, o-, p-Phenylenediamine,

https://www.osha.gov/dts/sltc/methods/organic/org087/org087.html,

diakses tanggal 18 April 2014.

Vincent, U., Bordin, G., and Rodriguez, A. R., 2002, Validation of an Analytical

Procedure For The Determination of Oxidative Hair Dyes in Cosmetic

Formulation, J. Cosmet. Sci., 53, 43-58.

Watson, D. G., 1999, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy

Students and Pharmaceutical Chemist, Churcill Livingstone, London, p.

238 – 239, 320.

Wheater, C.P., and Cook, P.A., 2000, Using Statistics to Understand the

Environment (Routledge Introductions to the Environment), in Focus

10a:Pearson’s Product Moment Correlation Coefficient (PPMCC),

http://media3.bmth.ac.uk/spss/focus_pages/focus_10a.htm, diakses tanggal

4 Juni 2015.


http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/311

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/7814

https://www.osha.gov/dts/sltc/methods/organic/org087/org087.html

http://media3.bmth.ac.uk/spss/focus_pages/focus_10a.htm

52

LAMPIRAN


53

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku para-phenylenediamine


54

Lampiran 2. Data penimbangan untuk perhitungan keseragaman bobot

sampel pewarna rambut oksidatif

No. Bobot sampel (g)

1 9,4393

2 7,9745

3 9,6008

4 10,2809

5 8,3091

6 7,8923

7 7,5346

8 9,4223

9 7,7272

10 9,3066

11 8,5396

12 6,2886

13 8,0016

14 9,7765

15 8,5964

16 9,2041

17 13,4856

18 9,8259

19 9,0344

20 9,8716

Rata-rata 9,0056

9,0056 ± 10% 7,6548 – 10,3564

9,0056 ± 15% 8,1050 – 9,9062


55

Lampiran 3. Tabel Hubungan n dan r (Pearson’s correlation coefficient test)

(Wheater and Cook, 2000).

Lampiran 4. Perhitungan Resolusi (Rs)

Rs = 2∆𝑡𝑅

𝑊1+𝑊2

Rs antara puncak pengotor 1 dan puncak PPD = 2 ×1,8 𝑐𝑚

0,4 𝑐𝑚 +0,3 𝑐𝑚 = 5,1

Rs antara puncak pengotor 2 dan puncak PPD = 2 ×1,75 𝑐𝑚

0,3 𝑐𝑚 +1,2 𝑐𝑚 = 2,3

Pengotor 1

Pengotor 2 PPD


56

Lampiran 5. Persamaan regresi linear kurva baku eksternal replikasi 1, 2, 3,

dan kumulatif

Lampiran 6. Kurva baku adisi metode clean-up dengan SPE C18

Massa adisi pada 20

µL ekstrak sampel

(ng)

AUC

Replikasi 1

AUC

Replikasi 2

AUC

Replikasi 3

Persamaan

regresi linear

kumulatif

0 141946,5 209605 166976,9

y = 3286,7175x

+ 153442,7028

r = 0,9783

27 217810,4 264595,1 240037,4

54 331509,3 302803,3 277932,7

80 429028,8 389585,3 416545,6

106 485722,2 523210,9 469780,1

134 662083,1 553598,9 628661,7

Replikasi Massa

(ng) AUC Persamaan Persamaan kumulatif

1

80,08 83185,6

y = 3179,1x -

196450

r = 0,9941

y = 2699,1x -

1011778

r = 0,9855

120,12 191579,7

160,16 304253

200,2 388906,2

240,24 549489,8

280,28 736209,8

320,32 826399,7

2

41,48 36219,9

y = 2349x - 64966

r = 0,9974

62,22 78005,6

82,96 125667,1

124,44 221902,8

165,92 344534,2

207,4 411584,2

3

20,04 16254,3

y = 1989,6x - 27127

r = 0,9925

40,08 62902,1

60,12 77957,1

80,16 12005,1

120,24 229876,9

160,32 287096,1

4

59,94 61061,8

y = 2633,6x - 110354

r = 0,9956

79,92 97611,1

119,88 192252,7

159,84 296902,4

199,8 431600,2


57

Lampiran 7. Perolehan kembali metode clean-up dengan SPE C18

Rumus % perolehan kembali = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 − (𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 )

(𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑃𝑃𝐷 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑚𝑏𝑎 ℎ𝑘𝑎𝑛 )× 100%

Adisi PPD

(µg)/300uL

ekstrak

sampel

Perolehan

kembali R1

Perolehan

kembali R2

Perolehan

kembali R3

Rata-

rata

(%)

SD CV

(%)

(µg) % (µg) % (µg) %

4,0 3,6 91,0 2,7 66,6 3,5 87,8 81,8 13,3 16,2

8,0 8,9 110,7 4,3 54,0 5,2 64,5 76,4 30,2 39,5

12,0 13,5 112,8 8,5 70,7 11,8 98,0 93,8 21,3 22,8

16,0 16,3 101,9 14,9 93,0 14,4 89,8 94,9 6,3 6,6

20,0 24,4 122,0 16,1 80,6 21,7 108,3 103,6 21,1 20,4

Lampiran 8. Kurva baku metode standar adisi

Replikasi Massa PPD (ng/20µL ) AUC Persamaan regresi linear

1

Tanpa adisi 146175,8

y = 2927,0x + 159718

r = 0,9915

8 194774,4

16 207803

28 234421,7

40 291708,2

80 388873,8

2

Tanpa adisi 139188,9

y = 2789,9x + 145902

r = 0,9942

8 183474

16 188748,4

28 222425,7

40 248539,8

80 373095,5

3

Tanpa adisi 90096,3

y = 2405,1x + 85574

r = 0,9932

16 121602

28 160899,9

40 167691,4

60 227813,4

80 284725,1


58

Lampiran 9. Perhitungan uji signifikansi slope kurva baku adisi 3 replikasi

dengan ANOVA satu arah

F hitung = MS between/ MS within

Slope s s

2 df

Replikasi 1 2926.96 191.82 36796.06 5

Replikasi 2 2789.95 150.76 22728.28 5

Replikasi 3 2405.09 140.44 19723.67 5

MS

within 26416.00 15

s 270.57

s2 73206.85

df 2

F hitung 5.54

MS

between 146413.70

Ftable 3.68

Lampiran 10. Perolehan kembali dengan metode standar adisi

Adisi PPD

(mg)/300

mg

sampel

Perolehan

kembali R1

Perolehan

kembali R2

Perolehan

kembali R3

Rata-

rata

(%)

SD CV

(%)

(µg) % (µg) % (µg) %

2 5,2 259,1 5,6 278,5 0,04 2,5 180,0 154,0 85,6

4 6,6 164,1 6,3 157,0 3,0 74,8 132,0 49,6 37,6

7 9,4 134,3 10,5 149,7 6,7 96,0 126,6 27,6 21,8

10 15,5 154,6 13,7 137,4 7,4 73,6 121,9 42,6 35,0

15 17,3 114,7 16,7 111,5 13,1 87,0 104,4 15,1 14,5

20 25,9 128,9 29,4 146,9 18,5 92,3 122,7 27,8 22,7


59

Lampiran 11. Penetapan kadar PPD dalam sampel pewarna rambut

oksidatif dengan metode standar adisi

Persamaan regresi linear yaitu y = bx + a (b = slope; a = intersep)

Replikasi Persamaan regresi

linear

Massa

PPD

(ng/20uL)

Massa PPD

(mg/50 mL)

Massa

PPD

(mg/mg)

Kadar

PPD

(%)

1 y = 2927,0x + 15971 55 13,6418 0,0454 4,54

2 y = 2789,9x +

145902 52 13,0741 0,0436 4,36

3 y = 2450,1x + 85574 36 8,8951 0,0296 2,96

Lampiran 13. Uji signifikansi (uji t) antara slope kurva baku eksternal dan

kurva baku adisi

Rumus:

s = 𝑛1−1 𝑠1²+ 𝑛2−1 𝑠2²

(𝑛1+𝑛2−2)

t = 𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 1−𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 2

𝑆 1

𝑛1+

1

𝑛2

df = n1 + n2 - 2

Jumlah titik 1 17

Jumlah titik 2 18

SD1 85,2154

SD2 378,5580

SD1² 7261,6644

SD2² 143306,1594

S² 77345,1921

S 278,1100

slope1 2283,4829

slope2 2484,6339

√1/n1 +1/n2 0,3382

df 33

t hitung -2,14

t table 2,03


60

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul Validasi Metode Analisis para-

phenylenediamine (PPD) Dalam Formulasi Pewarna Rambut

Oksidatif memiliki nama lengkap Cynthia Feliana. Penulis

dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 16 Februari 1993

sebagai anak kedua dari dua bersaudara, dari pasangan Ali

Subagyo dan Lucia Sri Christiani. Pendidikan formal yang

pernah ditempuh penulis yaitu di TK Pangudi Luhur

Yogyakarta (1997-1999), SD Pangudi Luhur I Yogyakarta

(1999-2005), SMP Stella Duce I Yogyaka rta (2005-2008),

SMA Stella Duce I Yogyakarta (2008-2011). Penulis

melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada

tahun 2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain

Komunitas Mahasiswa Buddhis dan Kong Hu Cu (KMBK) Dharma Virya sebagai

staf divisi hubungan masyarakat periode 2011-2012 dan sebagai ketua umum pada

periode 2012-2013, Seminar Motivasi Andrie Wongso “Who Are You, Give or Be

Given?” sebagai koordinator divisi dana dan usaha. Di bidang non akademik

penulis pernah mengikuti perlombaan fotografi dalam acara Journalistic

Competition tahun 2011 dan perlombaan bola basket dalam acara Pharmacy

Performance and Event Cup pada tahun 2012. Di bidang akademik, penulis

pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar (2012), Analisis Farmasi (2013),

Validasi Metode Analisis (2013), Farmakognosi Fitokimia (2013), Kimia analisis

(2013) dan Pharmaceutical Analysis (2014).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · d. bahan penelitian ... pewarna rambut adalah sediaan...

Documents