plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk filei optimasi komposisi dan flow rate fase...
TRANSCRIPT
i
OPTIMASI KOMPOSISI DAN FLOW RATE FASE GERAK PADAPENENTUAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM COKELATBUBUK DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Eka Riusinta Wati088114160
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGTAKARTA2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI KOMPOSISI DAN FLOW RATE FASE GERAK PADAPENENTUAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM COKELATBUBUK DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
Skripsi yang diajukan oleh:Eka Riusinta WatiNIM : 088114160
telah disetujui oleh
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Tuhan selalu mendengar lebih dari apa yang kita katakan, mengerti
lebih dari apa yang kita dapat ungkapkan, memberi lebih dari yang
kita minta dan akan menjawab lebih dari apa yang kita tanya. Hanya
jalan dan caranya yang kita tidak pernah tahu. Tuhan selalu ada
disamping kita kapanpun itu.
Harta yang paling berharga adalah keluarga.
Karya Tulis ini saya persembahkan kepada
Kedua Orang Tua
Adik tercinta
Sahabat tersayang
Keluarga terkasih
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah
ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, Februari 2012
Penulis
(Eka Riusinta Wati)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAHUNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Eka Riusinta WatiNomor Mahasiswa : 088114160
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada PerpustakaanUniversitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI KOMPOSISI DAN FLOW RATE FASE GERAK PADAPENENTUAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM COKELATBUBUK DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikankepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalandata, mendistribusikan secara terbatas, mempublikasikannya di internet ataumedia lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari sayamaupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama sayasebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : Februari 2012
Yang menyatakan
(Eka Riusinta Wati)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan anugerah yang telah diberikan sehingga penelitian dan penyusunan
skripsi dengan judul “Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak pada
Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Cokelat Bubuk dengan
Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat
diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu
persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Prograam Studi Ilmu
Farmasi (S. Farm).
Dalam menyelesaikan skripsi ini, penulis mengalami permasalahan dan
kesulitan. Namun dengan adanya dukungan, bantuan dan semangat dari berbagai
pihak, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini dengan
baik. Oleh karena itu, dengan segala hormat, penulis ingin mengucapkan terima
kasih atas bantuan yang telah diberikan, kepada:
1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
membimbing, memberi masukan dan jalan keluar serta saran yang sangat
bermanfaat dalam menyelesaikan penelitian ini hingga penyusunan naskah
skripsi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
3. Jeffry Julianus, M.Si. dan Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku Dosen
Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam
penyusunan skripsi.
4. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah
mendampingi, membagi ilmu dan pengalamannya yang sangat bermanfaat
dalam bidang farmasi.
5. Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto dan Mas Ottok yang telah banyak
membantu dan bersedia untuk direpotkan selama penulis menyelesaikan
penelitian skripsi ini.
6. Kepada adikku tercinta Setyanti Dwi Hartati untuk doa dan dukungannya
selama ini. Keluarga besar ku Pakde, Bude, Om, Bulek, kakak sepupu dan
adik sepupu, terutama Hita yang selalu memberikan semangat dan pengertian
selama penulis menyelesaikan penelitian skripsi ini.
7. Monica Satya Resmi Yunita dan Melisa Darmawan, sahabat dan teman satu
penilitian yang berjuang bersama dalam suka dan duka, saling menyemangati
saat salah satu sedang terpuruk. Terima kasih untuk pengalaman bersama
selama hampir empat tahun kebersamaan kita dan menyelesaikan skripsi
bersama.
8. Mbak Dju, Nyot, Bro Brian, Dhimbek, Kak Cos, Cik Seco, Vica, Abung Aldo,
Cici, Aga, Yuni dan Kimpul untuk persahabatan yang telah terjalin selama
ini, terima kasih untuk doa, saran, suka, duka dan pengalaman bersama.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
9. Teman-teman di grup Anti Stres untuk segala canda tawa, lelucon, semangat,
saran dan kesannya selama berjuang bersama di laboratorium.
10. Teman-teman kost yang selalu mau mendengarkan keluh kesahku dan
pengalaman tinggal bersama selama ini.
11. Semua teman-teman FST B dan Farmasi-C 2008 untuk cerita, pengalaman dan
kebersamaannya selama ini. Semua teman-teman angkatan 2008 yang tidak
akan terlupakan.
12. Teman curhat ku yang selalu mau menyediakan waktu untuk mendengarkan
cerita, keluh kesahku, tawa dan tangisku selama ini. Terima kasih untuk mau
menjadi telinga dan mataku juga, terima kasih.
13. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, namun sudah sangat
membantu selama menyelesaikan penelitian dan penyusunan naskah. Terima
kasih untuk seluruh dukungannya.
Penulis menyadari bahwa didalam skripsi ini masih banyak kekurangan.
Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan
penulis. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan
dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL …………………………………………….……… i
HALAMAN PERSETUJUAN ……………………………………........ ii
HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………… iii
HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………………. v
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………. vi
PRAKATA…………………………………………………………….... vii
DAFTAR ISI……………………………………………………………. x
DAFTAR TABEL………………………………………………………. xiii
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………. xv
DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………….. xvii
INTISARI……………………………………………………………….. xix
ABSTRACT……………………………………………………………… xx
BAB I PENDAHULUAN……………………………………………... 1
A. Latar Belakang…………………………………………………. 1
1. Permasalahan ………………………………………………. 3
2. Keaslian Penelitian ………………………………………….. 3
3. Manfaat penelitian ………………………………………… 5
B. Tujuan Penelitian ………………………………………………. 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………... 6
A. Cokelat …………………………………………………………. 6
B. Kafein ………………………………………………………….. 6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
C. Teobromin …………………………….………………………… 8
D. Metode Analisis Teobromin dan Kafein Terdahulu ……….……. 9
E. Spektrofotometer UV………………...………………………….. 10
F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...…………………………….. 12
1. Definisi dan instrument .…………………………………….. 12
2. Pemisahan yang optimal dalam kromatografi ………………. 19
G. Landasan teori ………………………………………………..….. 27
H. Hipotesis ………………………………………………………… 28
BAB III METODE PENELITIAN……………………….……….…. 29
A. Jenis dan rancangan penelitian ………………………………….. 29
B. Variabel Penelitian ……………………………………………… 29
C. Definisi Operasional …………………………………………….. 30
D. Bahan-bahan Penelitian ……………………………...………….. 30
E. Alat-alat Penelitian …………………………………….……….. 30
F. Tatacara Penelitian ………………………………..……………..
1. Penyiapan fase gerak metanol : akuabides/TEA3%…….……
2. Pembuatan seri larutan baku kafein dan teobromin …………
3. Optimasi metode KCKT fase terbalik …………...…………..
31
31
32
32
G. Analisis Hasil Optimasi ……………………………….…………
1. Analisis kualitatif ………………………………….…………
2. Analisis pemisahan peak kafein dan teobromin ……………..
a. Bentuk peak ………………………………………..…….
b. Waktu retensi ………………………………….…………
34
34
34
34
34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
c. Nilai Resolusi…………………………………………….
d. Nilai HETP ………………………………………………
35
35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…..……………………..…….
A. Pemilihan Pelarut ………………………………………..……….
B. Pembuatan Fase Gerak …………………………………..………
C. Pembuatan Larutan Baku ……………………………….………..
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein
dengan Spektrofotometri UV-Vis ………………..………
E. Kalibrasi Flow rate ………………………………………..…….
F. Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak pada pemisahan
Teobromin dan Kafein dengan KCKT Fase Terbalik …………...
1. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow
rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit …………...…………….
2. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow
rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit …………...…………….
3. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow
rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit ………...……………….
36
36
36
39
41
46
47
59
63
66
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN..…………….………………...
A. Kesimpulan ……………………………..………………………..
B. Saran ……………………………………..………………………
75
75
75
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………… 76
LAMPIRAN …………………………………………………………….. 79
BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………..……. 101
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I Deret eluotrofik pelarut-pelarut untuk KCKT………………. 15
Tabel II Komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%.............. 31
Tabel III Indeks polaritas campuran fase gerak metanol :
akuabides/TEA3%.................................................................... 39
Tabel IV Kalibrasi Flow rate pada KCKT……………………………. 47
Tabel V Waktu retensi Baku campuran teobromin dan kafein masing-
masing 100 ppm……………………………………………. 52
Tabel VI Tailing factor pada campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm pada fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow
rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ……………………………....... 56
Tabel VII Nilai HETP pada campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm pada fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow
rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ………………………………... 57
Tabel VIII Nilai Resolusi pada campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm pada fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow
rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ………………………………... 58
Tabel IX Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk pemisahan teobromin
pada campuran larutan baku teobromin dan kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit ………. 71
Tabel X Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk pemisahan kafein pada
campuran larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40,
80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA
3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit ………………………... 72
Tabel XI Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk resolusi pada campuran
larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan
160 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%
40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit …………………………….. 73
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Theobroma cacao………………………………………… 6
Gambar 2. Struktur kafein……………………………………………. 7
Gambar 3. Struktur teobromin………………………………...……... 8
Gambar 4. Diagram KCKT…………………………………….…….. 14
Gambar 5. Skema penyuntikkan keluk………………………….…… 17
Gambar 6. Pengukuran efisiensi Kromatografi puncak Gaussian…… 20
Gambar 7 Difusi Eddy………………………………………………. 23
Gambar 8. Transfer massa pada fase diam …………………………... 23
Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak ………………………….. 24
Gambar 10. Ilustrasi waktu dan volume retensi pada kromatografi…... 25
Gambar 11. Pemisahan dua senyawa………………………………….. 25
Gambar 12. Menghitung besarnya tailing factor pada kromatogram…. 26
Gambar 13. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam……….... 27
Gambar 14. Struktur TEA……………………………………………... 37
Gambar 15. Interaksi TEA dengan residu silanol …………………….. 38
Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin dan
kafein………………………………………………………. 42
Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nm……………. 42
Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nm ……… 44
Gambar 19. Bagian nonpolar teobromin dan kafein………………….… 47
Gambar 20. Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
van Der Waals ………………………………………….. 48
Gambar 21. Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui
interaksi van Der Waals …………………………………. 48
Gambar 22. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% melalui ikatan hidrogen…………...… 49
Gambar 23. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% melalui ikatan hidrogen…………...… 49
Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein
(A.2), dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 40
: 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit ………………… 51
Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 0,5 mL/menit
……………………………………………….. 60
Gambar 26. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 0,8 mL/menit
………………………………………………… 60
Gambar 27. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 1,0 mL/menit
……………………………………………….. 61
Gambar 28. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 0,5 mL/menit
………………………………………………. 63
Gambar 29. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 0,8 mL/menit
………………………………………………… 64
Gambar 30. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 1,0 mL/menit
……………………………………………….. 64
Gambar 31. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,5 mL/menit
……………………………………………….. 67
Gambar 32. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8
mL/menit…………………………………………………. 67
Gambar 33. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein
masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 1,0
mL/menit………………………………………………… 68
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Certificate of Analysis Teobromin ……………………. 80
Lampiran 2. Certificate of Analysis Kafein………………………….. 81
Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol : akuabides/TEA 3% (30 : 70) ……………… 82
Lampiran 4. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol : akuabides/TEA 3% (35 : 65) ………………. 84
Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) ………………. 86
Lampiran 6. Nilai Tailing Factor (TF) peak teobromin dan kafein pada
fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan contoh
perhitungan ………………………………………………. 88
Lampiran 7. Nilai HETP dari peak teobromin dan kafein pada fase
gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate
serta contoh perhitungan ………………………………. 89
Lampiran 8. Nilai Resolusi (Rs) peak teobromin dan kafein pada fase
gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate
serta contoh perhitungan ………………………………… 91
Lampiran 9. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin
dan kafein konsentrasi 40 ppm ….……………………….. 92
Lampiran 10. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin
dan kafein konsentrasi 80 ppm ………………………… 95
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
Lampiran 11. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin
dan kafein konsentrasi 160 ppm ………………………… 98
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xx
INTISARI
Kafein dan teobromin merupakan kandungan utama dalam cokelat bubuk.Keduanya memiliki efek farmakologi yang dapat memberikan stimulan padatubuh. Dalam produk cokelat bubuk perlu dipastikan bahwa terdapat kafein danteobromin sebagai kandungan utamanya dan seberapa besar kadarnya.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi umum dariKromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode yangdigunakan dalam penetapan kadar kafein dan teobromin dalam cokelat bubuk.Sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom Oktadesilsilan Kromasil 100-5C18 dimensi 250 x 4,6 mm ukuran partikel 5µm dengan fase gerak metanol :akuabides/TEA 3%. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak(30 : 70); (35 : 65) dan (40 : 60) serta flow rate yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menitdengan detektor ultraviolet 275 nm.
Kondisi optimum sistem KCKT adalah fase gerak metanol :akuabides/TEA3% (40 : 60) pada flow rate 0,8 mL/menit. Kondisi optimum initelah memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu nilai tailing factor 1,67,waktu retensi kurang dari 10 menit, nilai resolusi >1,5 yaitu 2,945 dan nilai HETPyang paling kecil yaitu 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk kafein.
Kata Kunci: Kafein, teobromin, cokelat, optimasi metode, KCKT fase terbalik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xxi
ABSTRACT
Caffeine and theobromine are the main compounds in cocoa powder. Bothof them have pharmacological effect as a stimulant. It is necessary to determinethat caffeine and theobromine are found as the main compound and how much itconsist.
This study aims to determine the optimum conditions for reversed phaseHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) to determine caffeine andtheobromine in cocoa powder. Reversed phase HPLC uses Kromasil 100-5C18,250 x 4,6 mm, particle size 5µm with methanol : aquabidest/TEA 3% as mobilephase. Optimation could be done by changing the composition of the mobilephase (30 : 70); (35 : 65) and (40 : 60) and the flow rate as 0,5; 0,8 and 1 mL/minwith ultraviolet 275 nm.
The optimum condition of HPLC that could be achieved is methanol :aquabidest/TEA 3% (40 : 60) in the flow rate 0,8 mL/min. This optimumcondition has fulfill the good separation parameter which are tailing factor value1,67, retention time < 10 minutes, resolution value is 2,945 and the smallest valueof HETP which is 0,0362 for theobromine and 0,0143 for caffeine.
Keywords: Caffeine, theobromine, cocoa, optimation method, reversed phaseHPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xxii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PEDAHULUAN
A. Latar Belakang
Cokelat merupakan salah satu makanan yang sering dikonsumsi oleh
masyarakat umum, mulai dari anak kecil sampai orang dewasa. Berbagai bentuk
dan sediaan cokelat yang dikonsumsi mulai dari cokelat batangan, cokelat cair dan
cokelat bubuk. Beberapa kandungan yang ada dalam cokelat adalah teobromin
dan kafein. Kedua senyawa ini yang menyebabkan adanya rasa pahit dalam
cokelat (Ramli et al., 2000).
Teobromin dan kafein merupakan golongan metilksantin yang memiliki
efek farmakologis berupa peningkatan kesadaran pada sistem saraf pusat atau
sebagai stimultan (Czech et al., 2011). Mengingat fungsinya sebagai stimulan,
maka seorang yang mengkonsumsi cokelat dapat meningkat aktivitas kerjanya
karena kesadarannya juga meningkat, sedangkan teobromin juga memiliki fungsi
sebagai diuretik (Ramli et al., 2000). Efek stimulant ini lah yang sering menjadi
alasan bagi konsumen untuk mengkonsumsi cokelat.
Dewasa ini, banyak produsen yang melakukan kecurangan dengan
menggunakan pewarna ataupun perasa sintesis untuk menurunkan biaya produksi
sehingga bisa mendapatkan keuntungan yang lebih besar. Dengan demikian perlu
dilakukan penjaminan mutu dari cokelat untuk mengetahui apakah benar
mengandung cokelat. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan apakah
benar dalam produk cokelat yang akan dianalisis mengandung teobromin dan
kafein sebagai unsur utama yang ada dalam cokelat. Struktur teobromin dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
kafein memiliki kemiripan sehingga diperlukan metode yang tepat untuk
memisahkan kedua senyawa tersebut dan melakukan penetapan kadar.
Sebelum dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dari sampel,
maka perlu dilakukan optimasi pada sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) untuk mendapatkan kondisi yang optimal. Tujuan dari optimasi ini adalah
agar sistem KCKT dapat memberikan hasil yang optimal yaitu dapat memberikan
pemisahan yang baik pada senyawa teobromin dan kafein yang akan ditetapkan
kadarnya.
Pada penelitian ini, akan dilakukan optimasi sistem KCKT dengan
melakukan perubahan komposisi dan flow rate fase gerak. Optimasi perbandingan
fase gerak yang dimaksudkan adalah optimasi perbandingan komposisi fase gerak
yang paling baik memberikan pemisahan dengan melihat nilai resolusinya (Rs).
Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT ini adalah campuran metanol dan
akuabides yang mengandung trietilamin (TEA) 3%. Optimasi flow rate yang
dimaksudkan adalah flow rate fase gerak yang digunakan hingga dapat
memisahkan analit dengan baik dilihat dari bentuk kromatogramnya.
Kondisi yang optimal ditentukan berdasarkan nilai resolusi pemisahan
antara teobromin dan kafein serta nilai waktu retensi (tR) yang dihasilkan pada
saat pemisahan dengan KCKT. Nilai resolusi (Rs) yang optimal adalah > 1,5
(Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk waktu retensi yang optimal ditunjukkan
dengan nilai (tR) yang tidak terlalu lama. Dengan demikian sistem KCKT yang
optimal didapatkan saat kromatogram tiap analit terpisah dengan baik dan nilai
(tR) tidak terlalu lama sehingga metode yang digunakan lebih efisien.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Sistem KCKT fase terbalik yang telah optimal dapat digunakan pada
rangkaian penelitian berikutnya yaitu pada validasi metode KCKT fase terbalik
dan aplikasinya pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel cokelat
bubuk merk “x”.
1. Permasalahan
Bagaimanakah kondisi optimal sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk melakukan penetapan kadar teobromin dan kafein terkait perbandingan
komposisi dan flow rate fase gerak?
2. Keaslian Penelitian
Sepengetahuan peneliti, metode analisis untuk menetapkan kadar
teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan menggunakan fase gerak
metanol : akuabides/TEA 3% dengan metode KCKT fase terbalik belum pernah
dilakukan.
Pada penelitian oleh Ramli et al. (2000), penetapan kadar teobromin dan
kafein dilakukan pada buah cokelat dengan menggunakan fase gerak metanol :
akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1), dan menggunakan kolom Bondapak. Pada
penelitian ini kolom yang digunakan adalah kolom Kromasil 100-5C18
Oktadesilsilan merek KNAUER, Dimensi 250 mm x 4,6 mm ukuran partikel 5
µm, selain itu fase gerak yang digunakan juga berbeda. Penelitian lainnya adalah
penetapan kadar teobromin dan kafein yang dilakukan oleh Czech et al. (2011),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
menggunakan fase gerak metanol : bufer asetat (20 : 80), dengan menggunakan
kolom XB C-18 dan diaplikasikan pada sampel biji kopi.
Pada penelitian Ptolemy et al. (2010), dilakukan penetapan kadar
teobromin dan kafein dalam cairan biologis yaitu dalam saliva, plasma dan urin.
Metode yang digunakan adalah kromatografi cair tandem dengan spektrofotometri
massa, sehingga detektor yang digunakan berbeda dengan yang digunakan dalam
penelitian ini. Selain itu, matriks dimana sampel terkandung juga berbeda. Pada
penelitian tersebut digunakan cairan biologis sedangkan pada penelitian ini
diaplikasikan pada sampel cokelat bubuk.
Pada penelitian Kasabe and Badhe (2010), pernah dilakukan ekstraksi
teobromin dari teh yang beredar dipasaran, namun metode yang digunakan dalam
penetapan kadarnya berbeda karena pada penelitian Kasabe ini menggunakan
High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) dan deteksi sinar UV.
Metode yang digunakan berbeda dengan metode yang digunakan dalam penelitian
ini. Dengan demikian berdasarkan data penelitian terdahulu seperti yang telah
dikemukakan diatas, belum pernah dilakukan penelitian dengan judul “Optimasi
Fase Gerak pada Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Cokelat Bubuk
dengan Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik”.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
3. Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan manfaat:
1. Manfaat teoritis: diharapkan dengan penelitian ini dapat memberikan informasi
atau sumbangan pada ilmu pengetahuan tentang optimasi metode KCKT fase
terbalik dalam aplikasinya untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein..
2. Manfaat metodologis: diharapkan penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar
untuk melakukan optimasi metode KCKT fase terbalik dalam aplikasinya
untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein.
3. Manfaat praktis: diharapkan penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar
penelitian menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam suatu bentuk sediaan
farmasi, ataupun makanan dan minuman.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukannya penelitian ini:
Untuk mengetahui kondisi sistem KCKT yang optimal terkait komposisi dan
flow rate fase gerak untuk dapat menetapkan kadar teobromin dan kafein.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. COKELAT
Cokelat atau yang disebut cacao (Theobroma cacao) merupakan tanaman
asli dari Amerika. Theobroma cacao termasuk dalam famili Sterculiaceae. Biji
tanaman ini digunakan untuk membuat cocoa dan produk cokelat (Anonim,
2011).
Gambar 1. Theobroma cacao.
Tumbuhan cokelat (gambar 1) mengandung beberapa senyawa kimia yang
termasuk dalam golongan toksik dan kurang bergizi. Contohnya adalah
teobromin, kafein, teofilin, oksalat, furfural, tannin dan inhibitor tripsin
(Alexander et al., 2008).
B. KAFEIN
Kafein merupakan golongan alkaloid metilksantin yang ditemukan secara
alami dalam daun, biji ataupun buah di lebih dari 63 jenis tanaman di seluruh
dunia, namun paling banyak ditemukan dalam kopi, biji cokelat, kacang kola dan
dalam daun teh. Dalam bentuk murninya, kafein merupakan serbuk putih dan
berasa pahit. Rumus kimianya adalah C8H10N4O2 dengan nama 1,3,5-tri
metilksantin (Wanyika et al., 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
N
N N
NH3C
O
CH3
OCH3
Gambar 2. Struktur kafein.
Kafein dapat meningkatkan kesadaran pada sistem saraf pusat manusia,
sehingga kafein berfungsi sebagai stimulan. Efek kafein sebagai stimulan ini
mampu memasok energi dalam tubuh, menurunkan rasa letih dan meningkatkan
kerja dari sistem motorik. Efek negatif yang dapat ditimbulkan oleh kafein adalah
efek kecanduan yang dapat ditandai dengan beberapa gejala seperti sakit kepala,
mudah lelah dan menurunnya konsentrasi serta meningkatkan emosi. Menurut
Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat, batas maksimum
konsumsi kafein adalah 400 mg per hari (Czech et al., 2011).
Sifat fisika kimia kafein (gambar 2) mencakup: pemeriannya berupa
serbuk putih; tidak berbau dan rasanya pahit; pH (1%larutan) 6,9; titik lelehnya
235-237,5oC; pKa sebesar 13,9; kelarutan kafein adalah sebagai berikut: 1 gram
kafein dapat larut dalam 50 mL air. Satu gram kafein dapat larut dalam 6 mL air
panas dengan suhu 80oC. Satu gram kafein dapat larut dalam 75 mL alkohol dan
+25 mL alkohol dengan suhu 60oC. Satu gram kafein dapat larut dalam 6 mL
kloroform dan 1 gram kafein dapat larut dalam 600 mL eter (Gennaro, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
C. TEOBROMIN
Teobromin dikenal dengan nama 3,7-dihydro-3,7-dimethyl-1H-purine-2,6-
dione merupakan golongan alkaloid metilksantin yang ditemukan secara alami
dalam berbagai jenis tanaman termasuk pula kafein dan teofilin. Teobromin
merupakan kandungan utama yang ditemukan dalam tanaman cokelat
(Theobroma cacao) (Kasabe and Badhe, 2010).
HN
N N
N
O
CH3
OCH3
Gambar 3. Struktur teobromin
Teobromin memiliki efek farmakologis yang hampir sama dengan kafein
namun efek yang timbul lebih kecil (Kasabe and Badhe, 2010). Teobromin
memiliki efek stimulan dalam tingkat yang lebih rendah dibandingkan kafein
sehingga tidak mempengaruhi sistem saraf pusat (Cezch et al., 2011).
Sifat fisika kimia teobromin (gambar 3) mencakup: merupakan serbuk
putih kristalin; titik sublimasi pada 290-295oC; titik leleh pada 357oC. Kelarutan
teobromin adalah sebagai berikut: 1 gram teobromin dapat larut dalam 2 liter air.
Satu gram teobromin dapat larut dalam 150 mL air mendidih. Satu gram
teobromin dapat larut dalam 250 mL etanol 95 % . Satu gram teobromin larut
dalam 6000 mL kloroform. Teobromin tidak dapat larut dalam eter (Clarke,
1969).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
D. Metode Analisis Teobromin dan Kafein Terdahulu
Pada penelitian Ramli et al. (2000), dilakukan penetapan kadar teobromin
dan kafein pada buah cokelat dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi
menggunakan fase gerak metanol : akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1) flow rate
1 mL/menit dan menggunakan kolom Bondapak dengan ukuran 30 cm x 4,0 mm
dan ukuran partikel 10 µm. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang 280
nm. Pada penelitian ini, didapatkan nilai % recovery 92,58% untuk teobromin dan
91,09 % untuk kafein. Nilai % recovery ini sudah memenuhi persyaratan menurut
Horwitz yaitu 90-110% (Gonzales and Herrador, 2007). Kekurangan dari
penelitian ini adalah belum terpenuhinya nilai linearitas, yang dapat dilihat dari
koefisien korelasi pada persamaan kurva baku yang didapat yaitu 0,98 untuk
teobromin dan 0,9951 untuk kafein. Nilai koefisien korelasi yang didapat pada
penelitian ini tidak memenuhi persyaratan linearitas yaitu > 0,999 (Snyder et al.,
1979).
Penelitian lainnya terkait teobromin dan kafein adalah penelitian yang
dilakukan Czech et al. (2011) yang melakukan determinasi teobromin dan kafein
dalam biji kopi. Metode yang digunakan adalah kromatografi cair kinerja tinggi
dengan menggunakan fase gerak metanol : bufer asetat (20 : 80) flow rate 1
mL/menit, kolom XB C-18 dengan ukuran partikel 2,6 µm. Pengamatan dilakukan
pada panjang gelombang 272 nm. Waktu retensi yang dihasilkan untuk kedua
senyawa ini adalah kurang dari 5 menit. Nilai koefisien korelasi yang didapatkan
juga memenuhi persyaratan yaitu 0,999 untuk teobromin, sedangkan untuk kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
nilai r = 0,9988 sehingga belum memenuhi persyaratan nilai r > 0,999 (Snyder et
al., 1979).
Penelitian Kasabe and Badhe (2010), melakukan penetapan kadar
teobromin dengan menggunakan metode High Performance Thin Layer
Chromatography (HPTLC) fase terbalik. Plat yang digunakan pada penelitian ini
adalah Silika gel 60 F254 sebagai fase diam. Fase gerak yang digunakan adalah etil
asetat : metanol (27 : 3). Determinasi dilakukan dengan densitometer pada
panjang gelombang pengamatan 274 nm. Metode HPTLC ini memberikan presisi,
akurasi, sensitivitas dan ketahanan sistem yang baik.
Penelitian yang dilakukan Ptomely et al. (2010) menetapkan kadar
teobromin dan kafein dalam cairan biologis manusia yaitu pada saliva, plasma dan
urin. Metode yang digunakan adalah kromatografi cair tandem dengan
spektrofometri massa. Fase diam yang digunakan adalah kolom C-18 BEH 50 mm
x 2,1 mm dan ukuran partikel 1,7 µm. Fase gerak yang digunakan adalah asam
format 0,1% (v/v) dalam akuabidestilata sebagai fase gerak A dan asetonitril
sebagai fase gerak B. Dengan demikian, sistem yang digunakan adalah sistem
gradien. Pengamatan ini dilakukan pada panjang gelombang 280 nm. Kelebihan
metode pada penelitian ini adalah dapat diaplikasikan pada sampel dengan
konsentrasi yang sangat kecil, yaitu sampai pada 10-300 µmol/Liter.
E. Spektrofotometer UV
Spektroskopi adalah salah satu teknik analisis fsiko-kimia yang mengamati
tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (REM).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Spektrofotometri ultraviolet adalah salah satu teknik analisis spektroskopi yang
menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm)
dengan instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995).
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi yang terjadi
antara radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul. Adanya interaksi tadi
menyebabkan terjadinya perpindahan energi dari sinar radiasi ke molekul yang
disebut absorpsi. Akibat absorpsi radiasi elektromagnetik oleh molekul tersebut
maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai
orbital elektron antibonding. Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin
terjadi yaitu *, n*, nπ* dan ππ* (Mulja dan Suharman, 1995). Pada
transisi * elektron pada suatu orbital tereksitasi ke orbital *, dengan
mengabsorpsi radiasi. Pada transisi n* terjadi pada senyawa-senyawa jenuh
dengan elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi yang
lebih besar dan terjadi pada daerah 150-250 nm dengan ϵ = 100-3000 M-1cm-1.
Transisi nπ* dan ππ* mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi
yang diperlukan untuk transisi menghasilkan absorbsi maksimum pada daerah
200-700 nm. Dengan adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi yang tidak
jenuh. Transisi nπ* memiliki ϵ = 10-100 M-1cm-1 sedangkan transisi ππ*
memiliki ϵ = 1000-10.000 M-1cm-1 (Khopkar, 1990).
Transisi elektronik yang berguna dalam penelitian adalah transisi nπ*
dan ππ* karena memberikan spektra pada 200-700 nm. Kedua transisi ini
membutuhkan adanya kromofor dalam struktur molekul suatu senyawa, yaitu
suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital π yang dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog, 1985). Selain gugus kromofor, dikenal
juga gugus auksokrom yaitu gugus jenuh yang apabila terikat pada kromofor
secara langsung dapat menggeser panjang gelombang dan mengubah intensitas
serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada
kromofor (Sastrohamidjojo, 2001). Gugus auksokrom paling sedikit memiliki
sepasang elektron bebas yang dapat berinteraksi dengan elektron π, misalnya -OH,
-NH2 (Skoog, 1985).
Spektrofotometer menghasilkan spektrum pada panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan
atau diabsorbsi. Dengan demikian, spektrofotometer digunakan untuk mengukur
energi yang ditansmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang (Khopkar, 1990).
F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Definisi dan instrument
Kromatografi merupakan teknik dimana solut atau zat-zat terlarut terpisah
oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi (Ganjar dan Rohman, 2007). Definisi tersebut menggambarkan
bahwa dalam sistem kromatografi terjadi pemisahan zat-zat terlarut atau analit
akibat adanya interaksi dengan fase diam yang ada dalam kolom kromatografi.
Pemisahan ini terjadi karena adanya interaksi antara zat analit dengan fase gerak
dan fase diam yang digunakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan metode yang paling
banyak dipilih untuk melakukan analisis. KCKT sudah banyak dikembangkan
untuk penelitian bahan-bahan obat, bahan kimia, makanan dan obat. Hal ini sesuai
dengan pendapat Chan et al. (2004), dimana KCKT banyak dipilih sebagai
metode analisis karena memiliki kemampuan pemisahan zat analit serta
kuantifikasinya atau penentuan jumlah zat analit tersebut berdasarkan respon Area
Under Curve (AUC). KCKT sering digunakan untuk menganalisis ketidak
murnian senyawa karena KCKT dapat juga digunakan untuk kuantifikasi senyawa
(Rohman, 2009). Kelebihan lain yang didapatkan dengan menggunakan KCKT
adalah dapat digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang memiliki
struktur yang hampir sama, analisis molekul non-volatil (sulit menguap) yang
tidak dapat dideteksi dengan kromatografi gas, analisis senyawa dengan jumlah
yang sangat kecil (Rohman, 2009).
Sistem KCKT merupakan gabungan dari berbagai macam alat yang
dirangkaikan untuk dapat menghasilkan suatu pemisahan, pendeteksian dan
kuantifikasi zat analit. Rangkaian alat ini dikenal dengan instrument kromatografi.
Menurut Rohman (2009), Instrumen KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fase
gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau
perekam. Rangkaian sistem KCKT dapat dilihat pada gambar 4.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Gambar 4. Diagram KCKT ( Rohman, 2009)
a. Fase gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam elusi dan resolusi. Kedua hal
ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Terdapat dua fase yang biasanya digunakan dalam
sistem KCKT yaitu fase normal dan fase diam. Penentuan kedua fase ini
tergantung pada tingkat kepolaran dari masing-masing fase gerak dan fase diam
yang digunakan. Apabila fase diam yang digunakan lebih polar dibandingkan fase
geraknya maka fase tersebut adalah fase normal, sedangkan untuk fase terbalik
fase diam yang digunakan lebih nonpolar dibandingkan fase geraknya. Hal ini
sesuai dengan pendapat Rohman (2009) dimana untuk fase normal (fase diam
lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi senyawa non polar meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam
kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi senyawa non polar menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara gradien (komposisi fase gerak berubah-ubah
selama elusi). Elusi gradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran
yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Fase gerak berperan untuk melewatkan sampel pada fase diam, namun
juga harus dilihat pemilihannya berdasarkan interaksinya dengan fase diam. Fase
gerak yang dipilih mungkin juga mengalami interaksi dengan fase diam. Kekuatan
dan tipe interaksi yang terjadi akan mempengaruhi resolusi dan efisiensi
pemisahan tersebut (Kuwana, 1980).
Deret eluotropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan
panduan yang berguna dalam pemilihan fase gerak yang akan digunakan dalam
KCKT. Deret eluotropik dapat dilihat pada tabel I.
Tabel I. Deret eluotropik pelarut-pelarut untuk KCKT
Pelarut Parameter kekuatanpelarut , έ (adsorpsi)
Parameter kekuatanpelarut, έ (partisi)
UV cut off (nm)
n- heksansikloheksantetraklorometanmetilbenzentriklorometandiklorometantetrahidrofuranpropanonasetonitrilisopropanoletanolmetanolair
0,010,040,180,290,400,420,560,560,650,820,880,95>1
0,1-0,21,62,44,13,14,03,95,83,94,35,1
10,2
195200265285245230212330190205205205170
(Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
b. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas , baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit (Rohman, 2009).
Pompa yang digunakan harus dapat menjamin akurasi dan konsistensi
kecepatan alir dari fase gerak, hal ini diperlukan untuk menjaga stabilitas dan
ripitabilitas interaksi antara zat analit dengan fase diam. Flow rate yang buruk
dapat mempengaruhi waktu retensi dan resolusi pemisahan analit (Chan et al.,
2004)
c. Tempat penyuntikaan sampel
Larutan yang mengandung analit dimasukkan ke dalam lubang kolom
dimana sudah ada fase gerak yang mengalir. Dengan demikian, sampel yang
disuntikan dapat terbawa oleh fase gerak menuju fase diam (kolom). Tempat
penyuntikan sampel ini biasanya terbuat dari tembaga agar tahan terhadap karat
sedangkan katupnya terbuat dari teflon.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Gambar 5. Skema penyuntikkan keluk (a) posisi saat memuat sampel;(b) posisi pada saat menyuntikkan sampel (Gandjar dan Rohman, 2007)
Pada saat pengisian sampel, sampel melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan. Pada saat penyuntikkan, katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan mengalirkan sampel ke
kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).
d. Kolom
Kolom merupakan bagian terpenting dalam rangkaian KCKT karena fase
diam dalam KCKT terdapat dalam kolom. Dengan demikian, pemisahan analit
dari komponen lainnya terjadi pada kolom. Keberhasilan pemisahan analit
tergantung pada keadaan kolom, sehingga pemilihan kolom sangatlah penting
(Mulja dan Suharman, 1995).
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus fungsional yang lain (Rohman, 2009). Oktadesilsilan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
(ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
dan tinggi.
e. Detektor
Terdapat dua golongan detektor pada KCKT yaitu detektor umum dan
spesifik. Detektor umum merupakan detektor yang dapat mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik dan selektif. Contoh dari detektor yang umum
adalah detektor indeks dan detektor massa. Detektor spesifik merupakan detektor
yang hanya dapat mendeteksi suatu analit sesuai dengan spesifikasi tertentu,
misalnya digunakan detektor UV-Vis maka analit yang digunakan harus memiliki
persyaratan yang sesuai untuk dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis. Contoh
lainnya adalah detektor fluoresensi dan elekrokimia (Rohman, 2009).
Detektor Spektrofotometri UV-Vis
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan
sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakkan senyawa
obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Sel detektor
umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10
mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh
indeks bias yang dapat megubah absorbansi yang terukur (Gandjar dan Rohman,
2007). Senyawa yang dapat dideteksi dengan menggunakan detektor UV-Vis ini
adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom dan memiliki
serapan pada panjang gelombang UV dan Vis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
2. Pemisahan yang optimal dalam kromatografi
a. Efisiensi kolom.
Tujuan umum pada kromatografi adalah pemisahan suatu campuran yang
akan dianalisis. Kualitas pemisahan dengan kromatografi ini dapat dilihat dari 2
parameter. Parameter pertama adalah resolusi yaitu tingkat pemisahan puncak-
puncak analit yang saling berdekatan. Parameter yang kedua adalah efisiensi yaitu
ukuran banyaknya pelebaran puncak dari masing-masing puncak zat analit.
Efisiensi pemisahan suatu kolom terdiri dari dua teori yaitu teori lempeng, teori
laju.
i. Teori Lempeng
Salah satu yang menjadi ukuran efisiensi dari suatu kolom adalah jumlah
lempeng atau plate number (N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis.
Efisiensi kolom dalam kromatografi secara umum juga berkaitan dengan waktu
retensi, yakni lamanya waktu komponen atau molekul yang akan dianalisis berada
di dalam kolom (Ganjar dan Rohman, 2007).
Dalam teori lempeng dinyatakan bahwa kolom kromatografi digambarkan
sebagai seri lapisan tipis horizontal yang disebut lempeng teoritis. Zat analit akan
mengalami distribusi pada fase diam dan fase gerak. Pemisahan akan semakin
baik jika terjadi distribusi yang merata dan berkali-kali dalam jumlah tinggi, jika
ini terjadi maka jumlah lempeng teoritis juga semakin tinggi (Noegrohati,1994).
Dengan begitu, jumlah lempeng teoritis juga menjadi ukuran efisiensi pemisahan
pada kolom. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis pada suatu pemisahan,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
semakin baik pula efisiensi kolom, dan sebaliknya jika nilai lempeng teoritis yang
didapatkan kecil, maka efisiensi kolom juga menurun.
Dengan menganggap profil puncak kromatogram (gambar 6) adalah
sesuai kurva Gaussian, maka N didefinisikan:= () (1)
Keterangan:
tR : waktu retensi solut
t : standar deviasi lebar puncak
Dalam prakteknya, lebih mudah untuk mengukur baik lebar puncak (Wb)
atau tinggi puncak (W h/2) dan 2 persamaan berikut diturunkan dari persamaan (1):N = 16 () (2)N = 5,54() (3)
Gambar 6. Pengukuran efeisiensi Kromatografi dari puncak Gaussian (Gandjar danRohman, 2007)
Satuan ukuran alternatif (yang tergantung pada panjang kolom
kromatografi) adalah tinggi lempeng (H) atau juga biasa disebut dengan tinggi
pelat teori (HETP= Height Equivalent Theoretical Plate). Tinggi setara pelat teori
atau HETP dalam kolom kromatogafi yang menggunakan kolom (KCKT dan
Kromatografi Gas) merupakan panjang kolom kromatografi (dalam mm) yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan molekul solut dalam fase
gerak dan fase diam. Hubungan antara HETP dan jumlah lempeng (N) serta
panjang kolom (L) dirumuskan dengan:H = (4)
(Ganjar dan Rohman, 2007)
HETP dapat digunakan untuk membandingkan efisiensi kolom dengan
panjang kolom yang berbeda, karena pada pengukuran HETP ini, panjang kolom
yang bervariasi dibandingkan dengan jumlah lempeng teoritis masing-masing
kolom sehingga perbandingannya tidak berdasarkan masing-masing panjang
kolom.
Nilai HETP berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teoritis (N).
Dengan begitu, semakin tinggi nilai N, semakin kecil nilai HETP dan semakin
efisien kolom yang digunakan (Ganjar dan Rohman, 2007).
ii. Teori Laju
Teori lempeng hanya menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif,
tetapi tidak dapat menggambarkan pengaruh variabel-variabel lain yang
menyebabkan terjadinya pelebaran peak, oleh karena itu perlu diketahui teori laju.
Pada waktu migrasi, zat analit mengalami transfer dalam fase diam dan fase gerak
berkali-kali. Zat analit hanya dapat bergerak jika berada dalam fase gerak
sehingga migrasi di dalam kolom juga tidak teratur dan mengakibatkan laju rata-
rata analit relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi, sehingga terjadi
pelebaran peak analit (Noegrohati, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Menurut teori laju ini, efisiensi kolom dinyatakan dengan persamaan Van
Deemter yang dapat dinyatakan sebagai berikut (Rohman, 2009):= +µ+ .µ + .µ atau (5)
= / / + µ+ .µ + .µ / (6)
Dimana : H = ukuran efisiensi kolom
µ = kecepatan alir
A = difusi Eddy
B = difusi longitudinal
Cs = resistensi terhadap perpindahan atau transfer massa molekul dalam fase diam
Cm = resistensi terhadap transfer massa yang disebabkan oleh diameter dan bentuk
partikel fase diam dan kecepatan difusi molekul dalam fase gerak.
Berdasarkan persamaan di atas dapat dilihat terdapat tiga variabel yang
mempengaruhi efisiensi kolom, yaitu:
1) Difusi Eddy, yang dinyatakan sebagai A pada persamaan (5). Difusi Eddy
menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang lintasan di
sekitar partikel yang terpack-ing (Gambar 7). Lintasan alir yang tidak sama
pasti ditemukan dalam kolom dimana kerapatan kolom rendah dengan cepat
mencapai akhir kolom, khususnya pada kolom dengan diameter kecil.
Molekul solut yang melewati bagian tengah kolom akan mencapai akhir
kolom lebih lambat. Hal ini menyebabkan perbedaan laju tiap molekul melalui
kolom berbeda-beda. Unutk meminimalkan difusi Eddy ini, maka diameter
rata-rata partikel dalam kolom harus sekecil mungkin dan seseragam mungkin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
(Willard et al., 1988). Difusi Eddy yang terjadi di dalam kolom dapat
digambarkan sebagai berikut:
Gambar 7. Difusi Eddy (Noegrohati,1994)
2) Difusi longitudinal, Nilai B pada persamaan (5), menyatakan efek difusi
longitudinal, pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh difusi
longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan hanya pada
kecepatan fase gerak yang rendah/lambat. Kecepatan difusi solut yang tinggi
pada fase gerak dapat menyebabkan molekul solut terdispersi secara aksial
sementara dengan lambat bermigrasi melalui kolom.
3) Transfer massa, Transfer massa dinyatakan dengan Cstasionary dan Cmobile.
Cstasionary merupakan hasil ditahannya analit karena adanya fase diam. Suatu
molekul bergerak lambat dalam fase diam, sementara molekul lainnya melaju
melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal ini
diperlukan fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental). Peristiwa ini
dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 8):
Gambar 8. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Cmobile menggambarkan adanya peristiwa dimana zat analit dalam fase diam
bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Hal ini dapat digambarkan
sebagai berikut (Gambar 9):
Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)
b. Waktu retensi
Pada pemisahan campuran-campuran dalam kolom, solut-solut dicirikan
dengan waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k`) yang berbanding lurus dengan
nilai perbandingan distribusi (D). Waktu retensi merupakan lamanya waktu yang
dibutuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k`)
dihubungkan dengan persamaan:
tR = tm (1 + k`) (7)
tm merupakan waktu yang dibutuhkan solut yang tidak tertahan untuk
melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi dengan kecepatan
yang sama dengan fase gerak karena perbandingan distribusi (D) dan faktor
retensinya adalah 0; jadi tR – tm = 0 (Gandjar dan Rohman, 2007). Ilutrasi waktu
retensi analit pada kromatografi dapat dilihat pada gambar 10.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Gambar 10. Ilustrasi waktu dan volume retensi pada kromatografi (Kuwana, 1980)
c. Resolusi
Faktor resolusi (Rs) adalah ukuran pemisahan dua puncak yang berdekatan
(Johnson and Setevenson, 1978). Resolusi menjadi indikator pemisahan pada
kromatogram yang dihasilkan dari analit (Kuwana, 1980). Nilai Rs harus
mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang
baik (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs >
1,5 (Pescok et al., 1976). Ilustrasi pemisahan puncak yang baik dapat dilihat pada
gambar 11. Hubungan waktu retensi (tR) dengan lebar puncak (W) dinyatakan
dalam persamaan sebagai berikut:= ( )/ = ∆ (8)
Gambar 11. Pemisahan dua semyawa (Johnson dan Stevenson, 1978)
d. Tailing factor
Analisis KCKT mencari kondisi yang menghasilkan puncak yang simetris
karena puncak yang asimetris dapat menghasilkan bilangan lempeng teoritik dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat
resolusi dan puncak-puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta
waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai
bentuk puncak adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10 % tinggi
puncak (Snyder et al., 1997).
Faktor asimetri juga disebut dengan tailing factor (Tf) yang dinyatakan
dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak kromatogram yang
menghasilkan nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat
setangkup atau simetris. Nilai Tf > 1 menunjukkan bahwa kromatogram
mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga Tf maka kolom yang
digunakan semakin kurang efisien, dengan begitu nilai Tf dapat digunakan untuk
melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Jika nilai Tf dan As sama dengan 1, artinya sudah terjadi pemisahan yang
baik pada kromatogram. Semakin meningkatnya nilai Tf dan As maka makin
buruk pemisahan yang terjadi pada kolom. Nilai Tf yang lebih dari 2 dapat
mengganggu analisis analit, sehingga untuk analisis di persyaratkan nilai tailing
factor adalah kurang dari 2 (Snyder et al., 2010). Nilai As dan Tf dapat diperoleh
menggunakan persamaan seperti pada gambar 12.
Gambar 12. Menghitung besarnya TF pada kromatogram (Snyder et al., 2010).
26
faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat
resolusi dan puncak-puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta
waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai
bentuk puncak adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10 % tinggi
puncak (Snyder et al., 1997).
Faktor asimetri juga disebut dengan tailing factor (Tf) yang dinyatakan
dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak kromatogram yang
menghasilkan nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat
setangkup atau simetris. Nilai Tf > 1 menunjukkan bahwa kromatogram
mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga Tf maka kolom yang
digunakan semakin kurang efisien, dengan begitu nilai Tf dapat digunakan untuk
melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Jika nilai Tf dan As sama dengan 1, artinya sudah terjadi pemisahan yang
baik pada kromatogram. Semakin meningkatnya nilai Tf dan As maka makin
buruk pemisahan yang terjadi pada kolom. Nilai Tf yang lebih dari 2 dapat
mengganggu analisis analit, sehingga untuk analisis di persyaratkan nilai tailing
factor adalah kurang dari 2 (Snyder et al., 2010). Nilai As dan Tf dapat diperoleh
menggunakan persamaan seperti pada gambar 12.
Gambar 12. Menghitung besarnya TF pada kromatogram (Snyder et al., 2010).
26
faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat
resolusi dan puncak-puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta
waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai
bentuk puncak adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10 % tinggi
puncak (Snyder et al., 1997).
Faktor asimetri juga disebut dengan tailing factor (Tf) yang dinyatakan
dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak kromatogram yang
menghasilkan nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat
setangkup atau simetris. Nilai Tf > 1 menunjukkan bahwa kromatogram
mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga Tf maka kolom yang
digunakan semakin kurang efisien, dengan begitu nilai Tf dapat digunakan untuk
melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Jika nilai Tf dan As sama dengan 1, artinya sudah terjadi pemisahan yang
baik pada kromatogram. Semakin meningkatnya nilai Tf dan As maka makin
buruk pemisahan yang terjadi pada kolom. Nilai Tf yang lebih dari 2 dapat
mengganggu analisis analit, sehingga untuk analisis di persyaratkan nilai tailing
factor adalah kurang dari 2 (Snyder et al., 2010). Nilai As dan Tf dapat diperoleh
menggunakan persamaan seperti pada gambar 12.
Gambar 12. Menghitung besarnya TF pada kromatogram (Snyder et al., 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat terjadi tailing
dapat dilihat pada gambar 13.
Gambar 13. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam ( Kuwana, 1980)
G. Landasan Teori
Kafein dan teobromin merupakan dua senyawa yang terkandung dalam
cokelat. Kedua senyawa ini memiliki struktur yang mirip sehingga memerlukan
metode yang tepat untuk dapat memisahkan keduanya dan dapat mengukur
kadarnya secara maksimal. Dalam kasus ini kafein dan teobromin yang akan
diteliti berada dalam sampel cokelat bubuk. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendapatkan kondisi yang optimal dalam memisahkan dan menentukan kadar
kafein dan teobromin. Metode yang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan
ini adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ) fase terbalik.
KCKT dapat digunakan untuk melakukan pemisahan kafein dan teobromin
dari sampel cokelat bubuk. Pemisahan yang dilakukan dengan KCKT merupakan
pemisahan yang berdasarkan tingkat kepolaran dan interaksi analit dengan fase
gerak dan fase diam pada metode KCKT ini. Analit yang sudah dipisahkan
dengan KCKT akan dideteksi oleh detektor UV karena kedua senyawa ini
memiliki serapan pada panjang gelombang UV. Teobromin dan kafein memiliki
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
kromofor dan auksokrom sebagai syarat senyawa yang dapat dideteksi dengan
detektor UV. Nilai ϵ untuk teobromin adalah 10.144,14 M-1cm-1 dan kafein adalah
9.786,41 M-1cm-1. Selanjutnya menghasilkan suatu kromatogram yang harus
memiliki pemisahan yang baik antara analit dengan zat lain maupun dengan
pelarut.
Metode yang akan digunakan harus dioptimasi terlebih dahulu agar
mendapatkan kondisi optimum. Dengan kondisi optimum, diharapkan pemisahan
yang dihasilkan juga akan baik. Parameter yang akan dioptimasi adalah laju alir
dan perbandingan fase geraknya. Perubahan perbandingan fase gerak dilakukan
untuk melihat perbandingan berapa yang akan menghasilkan pemisahan yang
paling baik. Kondisi optimum akan dicapai jika hasil yang didapat sudah
memenuhi parameter yang harus dipenuhi yaitu efisiensi kolom yang akan
memberi gambaran tingkat efisiensi kolom untuk dapat memisahkan sampel
dengan baik; waktu retensi yang akan menggambarkan pemisahan tiap zat karena
analit akan terelusi pada waktu yang berbeda, resolusi, faktor asimetris dan nilai
HETP. Jika metode yang digunakan sudah dapat memenuhi kondisi optimal dan
dapat diterapkan selanjutnya untuk validasi metode analisis dan penetapan kadar.
H. HIPOTESIS
Metode KCKT fase terbalik dengan komposisi dan flow rate yang optimum
dapat menghasilkan kromatogram dengan bentuk peak yang memenuhi
persyaratan tailing factor kurang dari 2, tR < 10 menit, resolusi pemisahan > 1,5,
dan nilai HETP yang semakin kecil sehingga dapat digunakan untuk melakukan
penetapan kadar kafein dan teobromin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian deskriptif
eksperimental karena diberikan perlakuan pada subjek uji.
B. Varibel Penelitian
1. Variabel utama
a. Variabel bebas
1) Perbandingan komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%.
2) Flow rate yang digunakan.
b. Variabel tergantung
1) Pemisahan peak masing-masing komponen yaitu kafein dan teobromin
yang dapat dilihat dari waktu retensi masing-masing senyawa.
2) Bentuk peak masing-masing komponen teobromin dan kafein serta tailing
factor untuk melihat seberapa besar pengekoran yang terjadi pada
kromatogram.
3) Nilai resolusi dan nilai HETP.
2. Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali pada percobaan adalah kemurniaan pelarut
yang digunakan. Untuk mengatasinya maka digunakan pelarut yang memiliki
tingkat pro analysis sehingga memiliki kemurnian yang tinggi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
C. Definisi Operasional
1. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penelitian adalah fase gerak
berupa campuran metanol dan akuabides dan fase diam berupa kolom
oktadesilsilan (C18).
2. Kadar kafein dan teobromin dinyatakan dengan satuan part per million (ppm).
3. Parameter pemisahan komponen dengan metode KCKT adalah bentuk peak,
waktu retensi, nilai resolusi dan HETP.
D. Bahan-bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku teobromin dengan
kemurnian > 99% (Sigma Aldrich) dengan Certificate of Analysis (CoA) yang
terlampir, kafein kualitas farmasetis dengan Certificate of Analysis (CoA) yang
terlampir, metanol (p.a., E. Merck), trietilamin (p.a., E. Merck) dan akuabides
hasil penyulingan di laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
E. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: Spektrofotometer
UV/Vis SP-3000plus merk OPTIMA, kuvet, seperangkat alat KCKT fase terbalik
dengan sistem gradien dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18
merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm, 5
µm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850
A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), alat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
degassing ultrasonic merek Retsch tipe T640, penyaring Whatmann anorganik
dan organik, neraca analitik merek Ohaus Carat Series PAJ 1003 (max 60/120g,
min 0,0001 g, d = 0,01/0,1 mg), Millipore ukuran pori 0,45 µm, mikropipet 100 -
1000µL dan 1000 - 10000µL merek Socorex . Gelas Beaker , pipet tetes, flakon,
labu takar, pengaduk, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium
analisis.
F. Tatacara Penelitian
1. Penyiapan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%
Memipet trietilamin (TEA) 15 mL selanjutnya diencerkan dengan
akuabides dalam labu takar 500 mL hingga tanda batas dan didapatkan akuabides
yang mengandung TEA sebesar 3%.
Metanol dan akuabides/TEA 3% yang akan digunakan sebagai fase gerak
disaring menggunakan kertas Whatmann dengan menggunakan kertas yang
berbeda untuk pelarut organik dan anorganik.
Campuran yang digunakan untuk optimasi dalam penelitian ini dapat
dilihat pada tabel II:
Tabel II. Komposisi fase gerak metanol:akuabides/TEA 3%
No Komposisi fase gerakMetanol Akuabides/TEA 3%
1 30 602 35 653 40 70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
2. Pembuatan seri larutan baku kafein dan teobromin.
a. Pembuatan larutan stok 1000 ppm. Kafein dan teobromin baku ditimbang
lebih kurang 25 mg secara seksama dan dilarutkan dalam akuabides panas dalam
labu takar 25 mL hingga tanda.
b. Pembuatan larutan baku intermediet 500 ppm. Memipet 5 mL larutan 1000
ppm kafein dan teobromin kemudian masing-masing diencerkan dengan
akuabides dalam labu takar 10 mL hingga tanda.
c. Pembuatan larutan kerja. Dilakukan pemipetan masing-masing larutan
baku intermediet (500 ppm) kafein dan teobromin sebanyak 0,8; 1,6; 2 dan 3,2
mL dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang sama. Selanjutnya diencerkan
dengan akuabides hingga tanda, sehingga didapatkan seri larutan kerja 40, 80 ,
100 dan 160 ppm selanjutnya larutan disaring dengan milipore dan di-degassing
menggunakan ultrasonicator selama 15 menit.
d. Pembuatan larutan kerja 5, 10 dan 15 ppm. Dilakukan pemipetan masing-
masing larutan baku intermediet (500 ppm) kafein dan teobromin sebanyak 0,1;
0,2 dan 0,3 mL lalu masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang
berbeda. Selanjutnya diencerkan dengan akuabides hingga tanda, sehingga
didapatkan larutan baku tunggal kafein dan teobromin 5, 10 dan 15 ppm.
3. Optimasi metode KCKT fase terbalik
a. Penentuan panjang gelombang maksimum kafein dan teobromin.
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan cara merekam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
spektra larutan baku kafein dan teobromin masing-masing dengan konsentrasi 5;
10 dan 15 ppm dengan pelarut akuabides pada rentang 200-300 nm terhadap
blanko akuabides. Berdasarkan spektra dapat diketahui panjang gelombang yang
menghasilkan serapan yang maksimum pada masing-masing konsentrasi,
kemudian ditentukan panjang gelombang yang akan digunakan dalam optimasi.
b. Optimasi pemisahan. Detektor pada alat KCKT diatur pada panjang
gelombang maksimum. Sejumlah 20 µL larutan baku campuran kafein dan
teobromin 100 ppm yang sudah disaring dengan millipore dan di-degassing
selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase
gerak yang telah dibuat seperti pada langkah F.1 di atas. Sistem operasi KCKT
fase terbalik dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak metanol dan
akuabides/TEA 3% dengan perbandingan (40 : 60), (35 : 65) dan (30 : 70) serta
mengubah-ubah flow rate 0,5; 0,8; dan 1 mL/menit untuk masing-masing fase
gerak.
c. Verifikasi akurasi Pompa. Alirkan fase gerak 1mL/menit ke labu 5 mL
dengan merk yang sama, replikasi sebanyak 5 kali. Mencatat waktu yang
dibutuhkan untuk mencapai tanda batas pada labu takar dan hitung % perbedaan
flow rate hasil pengukuran dengan flow rate yang diatur dari alat.
d. Reprodusibilitas metode KCKT yang optimal. Seri larutan kerja campuran
baku kafein dan teobromin dengan konsentrasi masing-masing 40, 80 dan 160
ppm, kemudian di injeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT
menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Penginjekan
larutan ini dilakukan sampai 5 kali. Setelah mendapatkan kromatogram
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
dilanjutkan dengan menghitung %CV untuk parameter tailing factor (Tf), waktu
retensi, HETP, resolusi dan Area Under Curve (AUC) dari pemisahan campuran
kafein dan teobromin.
G. Analisis Hasil Optimasi
Data kromatogram yang diperoleh pada baku diamati sehingga dapat
diketahui sistem KCKT fase terbalik yang memberikan pemisahan teobromin dan
kafein yang paling baik yaitu dengan mengamati bentuk peak yang dihasilkan,
waktu yang dibutuhkan untuk elusi, tailing factor, menghitung nilai resolusi dan
HETP.
1. Analisis kualitatif
Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi
antara baku kafein dengan baku teobromin.
2. Analisis pemisahan peak kafein dan teobromin
a. Bentuk peak pemisahan kafein dan teobromin
Bentuk peak yang diharapkan adalah simetris. Sebagai parameter yaitu
tailing factor (Tf). Pada penelitian ini, digunakan parameter tailing factor yang
diukur 5 % dari tinggi peak. Perhitungan Tf melalui persamaan: Tf = (a+b)/2a.
Persyaratan umum untuk parameter tailing factor adalah nilai Tf kurang dari 2
(Synder et al., 2010).
b. Waktu retensi (tR)
Amati waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan senyawa. Apabila kurang
dari 10 menit, maka pemisahan dikatakan efisien.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
c. Nilai resolusi
Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan
rumus: = ( )/Keterangan : tR1 dan tR2 = waktu retensi komponen
W1 dan W2 = lebar alas puncak
Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs > 1,5 (Pescok et al., 1976).
d. Nilai HETP
Nilai HETP dihitung dengan rumus HETP: = . Makin besar nilai N/L atau
makin kecil HETP maka kolom yang dipakai untuk pemisahan semakin efisien
(Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
BAB VI
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Pelarut
Pemilihan pelarut sangatlah penting, dengan menggunakan pelarut yang
sesuai maka dapat melarutkan analit yang akan dianalisis. Pelarut yang digunakan
untuk melarutkan teobromin dan kafein adalah akuabides hangat dengan suhu
+80oC karena dengan suhu tinggi dapat membantu kelarutan baku teobromin dan
kafein. Pemilihan pelarut ini juga berdasarkan teori kelarutan teobromin dan kafein
yaitu berdasarkan Gennaro (2000) dimana 1 gram kafein larut dalam 6 mL air
panas 80oC. Kelarutan teobromin yang paling baik adalah dalam air mendidih
dengan kelarutan 1 gram dalam 150 mL (Clarke, 1969). Air yang digunakan
sebagai pelarut adalah akuabides yang telah mengalami proses pemurnian. Syarat
pelarut yang baik untuk digunakan dalam metode KCKT adalah murni, inert, dapat
melarutkan analit dan dapat bercampur dengan fase gerak.
B. Pembuatan Fase Gerak
Metode KCKT yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode KCKT
dengan fase terbalik, sehingga fase diam yang digunakan lebih nonpolar
dibandingkan dengan fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah
oktadesilsilan (C18) yang bersifat nonpolar dan fase geraknya adalah campuran
metanol dan akuabides yang mengandung 3% trietilamin (TEA) bersifat lebih
polar dibandingkan fase diamnya. Sistem yang digunakan adalah sistem isokratik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
dimana tidak ada perubahan komposisi fase gerak selama proses elusi.
Pencampuran kedua kompisisi fase gerak dilakukan di dalam alat KCKT. Untuk
mendapatkan kepolaran fase gerak yang sesuai, dilakukan dengan mengubah-ubah
komposisi fase gerak. Metanol digunakan sebagai fase gerak dengan pertimbangan
bahwa metanol merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada
sistem KCKT fase terbalik. Penggunaan TEA ini berfungsi untuk menutup residu
silanol yang ada dalam kolom C18. Penutupan menggunakan TEA ini diperlukan
karena teobromin dan kafein merupakan senyawa yang bersifat basa, jika tidak
dilakukan penutupan dengan TEA zat analit akan berikatan dengan residu silanol
pada kolom sehingga kromatogram yang dihasilkan akan mengalami tailing.
Trietilamin (TEA) digunakan sebagai campuran dalam fase gerak untuk
dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh senyawa-senyawa yang bersifat
basa (Choo et al., 1996). Penambahan TEA pada fase gerak berperan sebagai
kompetitor senyawa basa, sehingga dapat menurunkan kemampuan interaksi
antara residu silanol dengan senyawa analit yang bersifat basa. Dengan begitu,
dapat menurunkan tailing yang terjadi. Efisiensi kolom juga akan meningkat
dengan semakin kecilnya tailing yang terjadi (Long et al., 2007).
N
CH 2
H 3C
H 2C CH 3
H 2C
H 3C
Gambar 14. Struktur Trietilamin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
N
H2C
CH3
CH2H3C
CH2
CH3
Si
O
O
OH
Si O
Si O
(CH2)17 CH3
(CH2)17 CH3
Gambar 15. Interaksi Trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C18
Pada gambar 15, terlihat interaksi antara residu silanol pada kolom dengan
TEA. Interaksi yang terjadi ini merupakan mekanisme penutupan dari TEA,
dengan begitu TEA yang digunakan bertindak sebagai kompetitor senyawa basa.
Analit yang bersifat basa akan berkurang interaksinya dengan residu silanol pada
kolom dan akan mengurangi tailing yang terjadi.
Perbandingan komposisi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini
untuk mendapatkan hasil yang optimal dari metanol : akuabides/TEA 3% adalah
40 : 60 ; 35 : 65 dan 30 : 70. Pada penelitian ini dilakukan peningkatan jumlah
metanol secara bertahap. Menurut Snyder et al. (1997), dengan meningkatnya
jumlah metanol dalam sistem KCKT fase terbalik maka analit akan terelusi lebih
mudah.
Pada proses pembuatan fase gerak ini, disiapkan metanol dan
akubides/TEA 3% secara terpisah. Fase gerak yang sudah dibuat terlebih dahulu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
disaring menggunakan penyaring Whatmann untuk menyaring partikel yang dapat
menyumbat kolom. Kemudian dihilangkan gelembung-gelembung udara yang
mungkin terjebak dalam fase gerak dengan menggunakan ultrasonicator, karena
udara dapat mengganggu pengukuran teobromin dan kafein dalam sistem KCKT.
Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol : akuabides/TEA3%
No
Komposisi Fase GerakIndeks
PolaritasMetanol Akuabides/TEA3%
1 30 70 8,67
2 35 65 8,415
3 40 60 8,16
Menurut Mulja dan Suharman (1995), dalam sistem KCKT fase terbalik,
kemampuan elusi akan semakin meningkat dengan menurunkan indeks polaritas
fase gerak. Semakin kecil nilai indeks polaritas fase gerak, maka semakin nonpolar
fase gerak tersebut. Pada tabel III, dapat diketahui urutan kepolaran dari polar ke
nonpolar adalah 30 : 70 , 35 : 65 dan 40 : 60. Untuk mendapatkan parameter yang
diinginkan dari pemisahan teobromin dan kafein, dilakukan dengan mengubah-
ubah komposisi fase gerak tersebut sampai didapatkan peak yang runcing,
memenuhi persyaratan tailing factor, resolusi dan HETP yang kecil.
C. Pembuatan Larutan Baku
Baku kafein yang digunakan dengan kualitas farmasetis dengan kemurnian
99,58% dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) untuk menjamin
kemurniannya. Baku teobromin yang digunakan dari Sigma-Aldrich dengan
kemurnian > 99,0% dan memiliki CoA juga untuk menjamin kemurnian
teobromin. Pelarut yang digunakan adalah akuabides. Tujuan pembuatan larutan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
baku ini adalah untuk memastikan bahwa di dalam sampel benar-benar terdapat
analit yang dimaksud, sehingga pembuatan larutan baku ini sebagai pembanding
atau reference standard.
Sebelum dilakukan optimasi komposisi fase gerak dan flow ratenya,
dibutuhkan penentuan panjang gelombang maksimum masing-masing analit.
Untuk melakukan penentuan panjang gelombang ini, dibuat larutan baku dengan
tiga konsentrasi rendah, tengah dan tinggi yaitu 5, 10 dan 15 ppm untuk masing-
masing larutan baku teobromin dan kafein. Konsentrasi ini dipilih untuk
memenuhi nilai absorbansi yang baik yaitu antara 0,2-0,8.
Dalam optimasi ini digunakan tiga larutan baku yaitu larutan baku
teobromin 500 ppm, larutan baku kafein 500 ppm serta larutan campuran
teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm. Larutan baku teobromin dan kafein
500 ppm dibuat terpisah untuk mengetahui tR masing masing zat analit. Untuk
mengetahui pemisahan antara kedua analit digunakan larutan baku campuran
teobromin dan kafein. Larutan baku 100 ppm akan digunakan dalam optimasi
komposisi fase gerak 30 : 70, 35 : 65 dan 40 : 60 serta flow rate 0,5; 0,8 dan 1
mL/menit.
Selanjutnya dibuat tiga konsentrasi larutan baku campuran teobromin dan
kafein masing-masing adalah 40, 80 dan 160 ppm. Larutan baku ini digunakan
untuk Uji Kesesuaian Sistem (UKS), dengan tujuan untuk melihat reprodusibilitas
metode yang digunakan pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Uji
Kesesuaian Sistem ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak serta
flow rate yang sudah optimal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan kafein
menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan mengukur
panjang gelombang kedua analit terlebih dahulu secara terpisah. Pengukuran
panjang gelombang maksimum ini dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-
Vis karena secara teoritis, kedua senyawa ini memiliki panjang gelombang
maksimum antara 200-300 nm. Setelah mendapatkan spektra panjang gelombang
masing-masing zat analit, selanjutnya dilakukan overlapping untuk mengetahui
panjang gelombang dimana teobromin dan kafein memberikan serapan secara
bersamaan dan maksimal pada detektor KCKT yaitu detektor ultraviolet.
Pada penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan
mengamati panjang gelombang pada rentang tersebut menggunakan tiga tingkat
konsentrasi untuk masing-masing analit. Konsentrasi yang digunakan adalah 5, 10
dan 15 ppm. Penggunaan tiga tingkat konsentrasi ini adalah untuk meyakinkan
bahwa panjang gelombang yang digunakan dalam pengamatan benar-benar berasal
dari panjang gelombang maksimum teobromin dan kafein. Selain itu, juga
bertujuan untuk melihat bahwa bentuk spektra dan panjang gelombang maksimum
yang didapatkan adalah sama. Panjang gelombang maksimum yang didapatkan
akan digunakan sebagai panjang gelombang pengamatan pada penelitian ini.
Teobromin dan kafein memiliki gugus kromofor, oleh karena itu dapat
memberikan serapan pada panjang gelombang ultraviolet. Gugus kromofor yang
ada pada suatu senyawa akan bertanggung jawab pada penyerapan cahaya
ultraviolet. Gugus kromofor memiliki ikatan rangkap yang mengandung elektron π
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
yang bila terkena radiasi elektromagnetik akan tereksitasi ke tingkat energi yang
lebih tinggi (orbital π*). Teobromin dan kafein memiliki atom N yang terikat pada
kromofor. Atom N ini memiliki pasangan elektron bebas yang dapat
memperpanjang gugus kromofor sehingga bertanggung jawab pada pergeseran
panjang gelombang dan intensitas serapan teobromin dan kafein. Gugus kromofor
dari teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 16.
Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin (A) dan kafein (B)= gugus kromofor
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum di ketiga tingkat
konsentrasi teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar berikut:
A
(nm)
A
B
42
yang bila terkena radiasi elektromagnetik akan tereksitasi ke tingkat energi yang
lebih tinggi (orbital π*). Teobromin dan kafein memiliki atom N yang terikat pada
kromofor. Atom N ini memiliki pasangan elektron bebas yang dapat
memperpanjang gugus kromofor sehingga bertanggung jawab pada pergeseran
panjang gelombang dan intensitas serapan teobromin dan kafein. Gugus kromofor
dari teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 16.
Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin (A) dan kafein (B)= gugus kromofor
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum di ketiga tingkat
konsentrasi teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar berikut:
A
(nm)
A
B
42
yang bila terkena radiasi elektromagnetik akan tereksitasi ke tingkat energi yang
lebih tinggi (orbital π*). Teobromin dan kafein memiliki atom N yang terikat pada
kromofor. Atom N ini memiliki pasangan elektron bebas yang dapat
memperpanjang gugus kromofor sehingga bertanggung jawab pada pergeseran
panjang gelombang dan intensitas serapan teobromin dan kafein. Gugus kromofor
dari teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 16.
Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin (A) dan kafein (B)= gugus kromofor
Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum di ketiga tingkat
konsentrasi teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar berikut:
A
(nm)
A
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
Pada gambar 17, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar kafein dalam pelarut
akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Kafein dalam larutan pH 9,4
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm (Clarke, 1969).
Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada pengamatan panjang
gelombang kafein ini mungkin terjadi karena pelarut yang digunakan berbeda
dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada pengamatan ini digunakan
pelarut akuabides.
(nm)(nm)(nm)
(nm)
(nm)
B
C
43
Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
Pada gambar 17, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar kafein dalam pelarut
akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Kafein dalam larutan pH 9,4
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm (Clarke, 1969).
Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada pengamatan panjang
gelombang kafein ini mungkin terjadi karena pelarut yang digunakan berbeda
dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada pengamatan ini digunakan
pelarut akuabides.
(nm)(nm)(nm)
(nm)
(nm)
B
C
43
Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
Pada gambar 17, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar kafein dalam pelarut
akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Kafein dalam larutan pH 9,4
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm (Clarke, 1969).
Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada pengamatan panjang
gelombang kafein ini mungkin terjadi karena pelarut yang digunakan berbeda
dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada pengamatan ini digunakan
pelarut akuabides.
(nm)(nm)(nm)
(nm)
(nm)
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
A
B
C
(nm)
(nm)
(nm)
44
Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
A
B
C
(nm)
(nm)
(nm)
44
Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm
(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides
A
B
C
(nm)
(nm)
(nm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Pada gambar 18, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar teobromin dalam
pelarut akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Teobromin dalam
pelarut etanol memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm
(Clarke, 1969). Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada
pengamatan panjang gelombang teobromin ini mungkin terjadi karena pelarut
yang digunakan berbeda dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada
pengamatan ini digunakan pelarut akuabides.
Dalam sistem KCKT untuk melakukan pengukuran diperlukan suatu
panjang gelombang dimana senyawa analit memberikan serapan yang optimal
untuk dapat diukur pada detektor dalam sistem KCKT. Panjang gelombang inilah
yang disebut sebagai panjang gelombang pengamatan. Untuk campuran dua
senyawa menggunakan panjang gelombang overlapping. Spektra yang diperoleh
dari teobromin dan kafein memiliki bentuk yang hampir sama dan panjang
gelombang maksimumnya sama yaitu 275 maka digunakan panjang gelombang
pengamatan pada 275 nm.
Pada gambar 17 dan gambar 18 terlihat bahwa teobromin dan kafein
memiliki spektra yang hampir mirip, karena keduanya memiliki gugus kromofor
yang sama namun memiliki intensitas penyerapan yang berbeda. Menurut Moffat
et.al. (2004) kafein memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet (E % ) yaitu
504 pada panjang gelombang 273 nm dalam larutan asam, sedangkan teobromin
memiliki nilai spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet (E % ) sebesar 563 pada
panjang gelombang 273 nm dalam larutan asam. Dengan demikian, panjang
gelombang pengamatan yang digunakan adalah 275 nm. Pada panjang gelombang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
pengamatan ini, baik teobromin dan kafein memiliki serapan yang optimum pada
detektor UV yang digunakan dalam sistem KCKT.
E. Kalibrasi Flow rate
Tahapan ini bertujuan untuk melakukan kalibrasi alat yang digunakan.
Kalibrasi dilakukan pada flow rate alat KCKT yang akan digunakan. Kalibrasi ini
dilakukan dengan menampung fase gerak yang keluar dari konektor KCKT
sebelum masuk ke kolom pada labu takar 5 mL. Dilakukan perhitungan waktu
sejak fase gerak mulai keluar dari konektor sampai pada saat fase gerak yang
ditampung tepat pada garis batas labu takar 5 mL, setelah itu waktu dihentikan dan
dicatat. Tahapan ini dilakukan sebanyak 5 kali untuk dapat menjamin
reprodusibilitas flow rate pada metode KCKT. Flow rate yang digunakan adalah 1
mL/menit, sehingga secara teoritis labu takar akan terisi penuh tepat 5 menit.
Berikut adalah data yang didapatkan dari kalibrasi flow rate:
Tabel IV. Kalibrasi Flow Rate pada KCKT
Flow rate Volume Replikasi Waktu (menit)1mL/menit 5 mL 1 4’ 59”
2 5’ 01”3 4’ 59”4 5’5 5’
Rata-rata 4,9967SD 0,0139%CV 0,2796
Pada tabel IV, diketahui bahwa flow rate pada KCKT ini memiliki
reprodusibilitas yang baik. Hal ini dapat disimpulkan dengan melihat nilai %CV
yang diperoleh yaitu 0,28%, nilai ini sudah memenuhi persyaratan %CV yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
dapat diterima yaitu < 2%. Nilai %CV yang kurang dari 2 % menggambarkan
presisi yang baik atau keterulangan yang baik (Horwitz dalam Gonzales and
Herrador, 2007). Dengan begitu, flow rate yang digunakan reprodusibel.
F. Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak dalam pemisahan
Teobromin dan Kafein dengan Metode KCKT Fase Terbalik
Pemisahan senyawa analit teobromin dan kafein menggunakan KCKT fase
terbalik, dimana fase diam yang digunakan bersifat lebih nonpolar dibandingkan
dengan fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah oktadesilsilan (C18) dan
fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol : akuabides/TEA 3%. Pada
sistem KCKT ini, senyawa yang lebih polar akan terelusi terlebih dahulu
dibandingkan dengan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi karena senyawa
yang lebih polar akan lebih kuat berinteraksi dengan fase gerak dibandingkan
dengan fase diam, sehingga akan lebih mudah terelusi melewati fase diamnya.
Senyawa yang lebih nonpolar akan cenderung berinteraksi lebih kuat pada fase
diamnya maka akan tertinggal di kolom lebih lama. Berikut adalah gambar bagian
nonpolar dari teobromin dan kafein:
Gambar 19. Bagian nonpolar teobromin (A) dan kafein (B)= Bagian Nonpolar
BA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
N
N N
NH3C
O
CH3
O CH3
Si
CH3O
H3C O
H3C
Gambar 20. Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals= interaksi van Der Waals
Si
CH3O
H3C O
H3C
HN
N N
N
O
CH3
O
CH3
Gambar 21. Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals= interaksi van Der Waals
Pada gambar 20 dan 21 menunjukan interaksi yang terjadi antara kafein
dan teobromin dengan fase gerak adalah dengan interaksi van Der Waals. Interaksi
kafein pada fase diam lebih banyak dibandingkan interaksi teobromin dengan fase
diam. Oleh karena itu, kafein akan lebih lama tertinggal pada kolom dibandingkan
dengan teobromin. Hal ini dapat teramati pada waktu retensi kedua senyawa analit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
(gambar 24). Senyawa yang memiliki interaksi lebih banyak pada fase diam akan
memiliki waktu retensi yang lebih lama, sedangkan yang memiliki interaksi lebih
sedikit akan terelusi lebih cepat dan waktu retensi yang cepat.
N
N
H3C
O
CH3
O
HOHH3C O
H
N
N
CH3
H O H
H O H
H
O CH3
H
O CH3
Gambar 22. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% melaluiinteraksi hidrogen.= interaksi hidrogen
N
N
H
O
CH3
O
HOHH3C O
H
N
N
CH3
H O H
H O H
H
O CH3
H O
H
H
O CH3
OH3C
H
Gambar 23. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% melaluiinteraksi hidrogen.= interaksi hidrogen
Pada gambar 22 dan 23 dapat dilihat bahwa teobromin dan kafein
berinteraksi hidrogen dengan fase gerak metanol dan akuabides. Interaksi hidrogen
pada teobromin lebih banyak dibandingkan pada kafein, dengan begitu interaksi
teobromin terhadap fase gerak akan lebih besar dibandingkan interaksi kafein
dengan fase gerak. Semakin banyak interaksi yang terjadi antara analit dengan fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
gerak, maka akan mudah untuk terelusi, sehingga secara teoritis teobromin akan
lebih cepat terelusi dibandingkan kafein.
Optimasi yang dilakukan dengan menggunakan metode KCKT ini adalah
dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk mendapatkan
pemisahan yang baik antara teobromin dan kafein. Komposisi fase gerak yang
akan dilakukan adalah 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 (metanol : akuabisdes/TEA 3%)
dengan flow rate 0,5; 0,6 dan 0,8 mL/menit.
Sebelum dilakukan optimasi komposisi dan flow rate pada fase gerak,
dilakukan terlebih dahulu orientasi untuk mengetahui letak peak tunggal masing-
masing senyawa analit. Hal ini untuk memastikan bahwa peak yang nantinya
muncul pada larutan campuran baku adalah milik teobromin dan kafein. Data yang
diperoleh dilakukan pada salah satu komposisi dan flow rate fase gerak yaitu pada
perbandingan metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit. Pada
pengamatan waktu retensi masing-masing analit ini, dilakukan dengan
menggunakan larutan baku tunggal teobromin dan kafein masing-masing 500 ppm.
Pada gambar 24. dapat diketahui bahwa waktu retensi untuk teobromin
lebih pendek dibandingkan waktu retensi kafein. Hal ini sesuai dengan teori bahwa
kafein lebih nonpolar dibandingkan teobromin sehingga memiliki interaksi dengan
fase diam lebih kuat dibandingkan pada fase diam dengan begitu kafein akan lebih
lama terelusi dibandingkan teobromin. Waktu retensi yang didapatkan untuk
teobromin adalah 2,239 menit, sedangkan untuk kafein adalah 3,600 menit.
Berikut adalah gambar kromatogram untuk masing-masing baku teobromin dan
kafein:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein (A.2), denganparameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
A.1
A.2
51
Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein (A.2), denganparameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
A.1
A.2
51
Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein (A.2), denganparameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
A.1
A.2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Pengamatan waktu retensi merupakan salah satu parameter analisis
kualitatif senyawa pada penelitian ini. Masing-masing senyawa analit memiliki
waktu retensi yang berbeda. Pada saat senyawa analit berada dalam campuran,
dapat dibedakan berdasarkan waktu retensi masing-masing senyawa. Berikut
merupakan pengamatan waktu retensi campuran baku teobromin dan kafein pada
masing-masing komposisi dan flow rate fase gerak yang dioptimasi.
Tabel V. Waktu retensi baku campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm
Komposisi FaseGerak Analit Waktu Retensi (tR) (menit)
Metanol :Akuabides/TEA3%
0,5(mL/menit)
0,8(mL/menit)
1(mL/menit)
30 : 70 Teobromin 3,549 2,23 1,788
Kafein 5,784 3,629 2,908
35 : 65 Teobromin 3,551 2,232 1,79
Kafein 5,705 3,593 2,878
40 : 60 Teobromin 3,567 2,233 2,277
Kafein 5,652 3,557 2,852
Pada data yang diperoleh seperti pada tabel V, dari masing-masing
komposisi fase gerak tersebut, semakin tinggi jumlah metanol yang digunakan
maka waktu retensinya semakin cepat dan sebaliknya semakin kecil jumlah
metanol yang digunakan semakin lama waktu retensi baik untuk teobromin
maupun kafein. Pada perubahan flow rate fase gerak, semakin meningkatnya flow
rate yang digunakan semakin kecil waktu retensi teobromin dan kafein. Dengan
demikian, semakin banyak jumlah metanol yang digunakan dan semakin
meningkatnya flow rate fase gerak maka waktu retensi teobromin dan kafein
semakin kecil atau cepat terelusi.
Pada pengamatan waktu retensi, didapatkan waktu retensi untuk teobromin
lebih kecil dibandingkan waktu retensi kafein. Hal ini sesuai dengan banyaknya
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
interaksi yang terjadi antara senyawa analit dengan fase diam dan fase gerak yang
digunakan. Teobromin memiliki interaksi yang lebih sedikit dengan fase diam dan
punya interaksi lebih banyak dengan fase gerak sehingga lebih cepat terelusi dan
waktu retensinya lebih pendek. Hal sebaliknya terjadi pada kafein sehingga waktu
retensi pada kafein lebih panjang.
Pada tabel V. dapat diamati bahwa pada komposisi fase gerak metanol :
akuabides dengan perbandingan 30 : 70, waktu retensi yang dihasilkan paling lama
dibandingkan dengan komposisi 35 : 65 dan 40 : 60. Hal ini terjadi karena pada
komposisi 30 : 70, jumlah metanol yang digunakan lebih sedikit sehingga
kemampuan fase gerak untuk mengelusi teobromin dan kafein dari kolom lebih
kecil dibandingkan dengan komposisi yang lain. Pada komposisi fase gerak 35 :
65, waktu retensinya lebih cepat karena metanol yang digunakan lebih banyak
sehingga kemampuan elusi dari fase geraknya meningkat. Pada komposisi 40 : 60,
waktu retensinya paling singkat. Terjadi penyimpangan waktu retensi milik
teobromin, waktu retensi yang paling pendek adalah pada komposisi 35 : 65.
Penyimpangan yang terjadi ini menyebabkan belum dapat ditentukannya
komposisi fase gerak yang optimal, tetapi penentuan komposisi fase gerak yang
paling optimal juga dipengaruhi oleh parameter lainnya yaitu tailing factor, HETP
dan resolusi. Pada pengamatan waktu retensi ini, didapatkan hasil bahwa pada
setiap komposisi fase gerak didapatkan waktu retensi yang kurang dari 10 menit,
sehingga dapat disimpulkan bahwa ketiga komposisi fase gerak yang digunakan
menghasilkan waktu retensi kurang dari 10 menit, sudah memenuhi syarat yang
berlaku untuk waktu retensi yang baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Selain melakukan peningkatan jumlah metanol pada komposisi fase gerak,
optimasi juga dilakukan dengan mengubah flow rate dari fase gerak yang
digunakan. Flow rate yang digunakan adalah 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Semakin
meningkatnya flow rate pada tiap komposisi fase gerak waktu retensi yang
dihasilkan untuk teobromin dan kafein semakin pendek. Waktu retensi yang paling
pendek dihasilkan pada flow rate 1,0 mL/menit sedangkan waktu retensi yang
paling panjang ada pada flow rate 0,5 mL/menit. Data waktu retensi dapat dilihat
pada tabel V. Flow rate yang digunakan tidak lebih dari 1,0 mL/menit untuk
menjaga tekanan pada kolom. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin
tinggi pula tekanan pada kolom. Batas tekanan pada sistem KCKT yang digunakan
adalah 0 kgf/cm2 sampai 380 kgf/cm2. Tekanan yang digunakan harus dijaga untuk
agar kolom tidak rusak. Tekanan yang tinggi dapat merusak kolom.
Parameter lain yang harus dipenuhi untuk menentukan komposisi dan flow
rate fase gerak yang optimum selain waktu retensi adalah nilai tailing factor.
Parameter ini dapat menunjukan bentuk peak yang dihasilkan pada kromatogram,
dimana peak berbentuk simetris atau mengalami pengekoran. Tailing factor yang
mendekati nilai 1, semakin memperlihatkan bahwa peak kromatogram yang
dihasilkan berbentuk simetris, namun nilai tailing factor lebih besar dari 1
menunjukan bahwa peak yang dihasilkan mengalami pengekoran. Semakin besar
nilai tailing factor yang dihasilkan maka semakin besar maka semakin kurang
efisien kolom yang digunakan, maka besarnya nilai tailing factor dapat digunakan
untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Tailing factor yang masih dapat diterima adalah kurang dari 2 (Snyder et
al., 2010). Jika tailing factor yang dihasilkan lebih dari 2 dimungkinkan terjadi
permasalahan yang mengakibatkan peak mengalami tailing (pengekoran).
Permasalahan yang mungkin terjadi seperti kolom yang sudah mengalami
overload karena jumlah sampel yang terlalu besar, pelarut sampel yang digunakan
terlalu kuat berinteraksi dengan fase diam pada kolom dan terjadinya interaksi
senyawa dengan residu silanol pada fase diam (Snyder et al., 2010). Hal yang
dapat menyebabkan teobromin dan kafein mengalami tailing adalah adanya
interaksi dengan sisa silanol pada kolom. Teobromin dan kafein bersifat basa
sehingga akan berinteraksi dengan residu silanol yang bersifat asam, namun tailing
ini dikurangi dengan penggunaan trietilamin (TEA) pada fase gerak sehingga TEA
akan berinteraksi dengan residu silanol pada kolom dan mengurangi interaksi
senyawa analit dengan residu silanol, dengan begitu tailing pada senyawa dapat
berkurang.
Nilai tailing factor yang diperoleh pada pengamatan ini digunakan sebagai
pertimbangan untuk memilih komposisi dan flow rate fase gerak yang paling
optimal. Hasil pengamatan tailing factor pada campuran baku teobromin dan
kafein konsentrasi 100 ppm dari pengamatan ini dapat dilihat pada tabel VI
sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Tabel VI. Tailing factor pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm
pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow rate 0,5;
0,8 dan 1 mL/menit
Komposisi Fase Gerak Analit Flow rate(mL/menit) tR (menit) Tailing
factorMetanol : Akuabides/TEA 3%
30 : 70
Teobromin 0,5 3,549 1,750,8 2,230 2,251 1,788 1,75
Kafein 0,5 5,784 1,50,8 3,629 1,671 2,908 1,125
35 : 65
Teobromin 0,5 3,551 1,50,8 2,232 2,251 1,790 1,125
Kafein 0,5 5,705 1,50,8 3,593 1,671 2,878 1,5
40 : 60
Teobromin 0,5 3,567 1,750,8 2,233 1,671 2,277 1,67
Kafein 0,5 5,652 20,8 3,557 1,671 2,852 1,375
Parameter lain yang juga menjadi pertimbangan dalam menentukan
komposisi dan flow rate yang digunakan adalah efisiensi kolom yang dilihat dari
nilai HETP yang didapatkan. HETP merupakan satuan ukuran alternatif yang
digunakan untuk menilai efisiensi kolom. Menurut Gandjar dan Rohman (2007),
makin kecil nilai HETP yang didapatkan maka makin efisien kolom yang
digunakan untuk pemisahan. Berikut adalah data pengamatan nilai HETP pada
setiap komposisi dan flow rate fase gerak yang digunakan:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Tabel VII. Nilai HETP pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing
100 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow
rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit
Komposisi Fase Gerak
AnalitFlow rate
(mL/menit)
N (JumlahLempeng) HETPMetanol :
Akuabides/TEA3%
30 : 70
Teobromin 0,5 109,0289 0,22930,8 110,1995 0,22681 70,8443 0,3528
Kafein 0,5 289,5919 0,08630,8 291,8392 0,08571 130,1356 0,1921
35 : 65
Teobromin 0,5 194,0477 0,12880,8 172,4957 0,14491 71,0029 0,3521
Kafein 0,5 500,8626 0,04990,8 277,5434 0,09011 127,4644 0,1961
40 : 60
Teobromin 0,5 783,2014 0,03190,8 690,6010 0,03621 94,9534 0,2633
Kafein 0,5 1.9663,986 0,01270,8 1.752,3365 0,01431 125,1717 0,1997
Pada hasil pengamatan tersebut, dapat dilihat bahwa pada komposisi fase
gerak yang sama dengan semakin meningkatnya flow rate maka semakin besar
nilai HETP yang dihasilkan. Jika dilihat dari tiap komposisi fase gerak yang
digunakan, semakin banyak jumlah metanol yang digunakan maka nilai HETP
yang dihasilkan lebih kecil. Semakin banyak jumlah metanol yang digunakan,
maka akan semakin efisien pemisahan yang dihasilkan oleh kolom.
Optimasi komposisi dan flow rate fase gerak ini akan digunakan atau
diaplikasikan pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam matriks cokelat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
bubuk sebagai sampelnya, sehingga teobromin dan kafein harus dapat terpisah
secara sempurna dengan begitu peak teobromin tidak akan mengganggu peak
kafein, begitu pula sebaliknya. Pemisahan antara kedua peak ini dapat diamati dari
nilai resolusi (RS). Rs menjadi indikator pemisahan kromatogram yang akan
dihasilkan dari senyawa analit. Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena
akan memberikan pemisahan puncak yang baik (Gandjar dan Rohman, 2007).
Data hasil pengamatan nilai resolusi dari kromatogram yang dihasilkan oleh
campuran baku teobromin dan kafein dapat dilihat pada tabel VII.
Tabel VIII. Nilai Resolusi pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100
ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow rate
0,5; 0,8 dan 1 mL/menit
Komposisi Fase Gerak Flow rate(mL/menit) Resolusi
Metanol Akuabides/TEA3%30 70 0,5 2,79
0,8 3,261 1,723
35 65 0,5 3,590,8 3,0241 1,98
40 60 0,5 30,8 2,9421 1
Nilai resolusi yang didapatkan ini menggambarkan pemisahan yang terjadi
pada kromatogram dua senyawa analit yaitu teobromin dan kafein dalam larutan
baku campuran masing-masing 100 ppm. Tujuan pengamatan nilai resolusi ini
adalah untuk mengetahui komposisi serta flow rate fase gerak yang dapat
menghasilkan pemisahan kromatogram dengan nilai lebih dari 1,5. Pada data yang
diperoleh, dapat diketahui bahwa dengan semakin meningkatnya jumlah metanol,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
nilai resolusinya semakin kecil, artinya kedua kromatogram semakin mendekat.
Selain dengan meningkatnya jumlah metanol yang digunakan, semakin tinggi flow
rate yang digunakan juga menghasilkan nilai resolusi yang semakin kecil. Dengan
demikian, dapat disimpulkan dengan peningkatan jumlah metanol dan flow rate
maka resolusi yang dihasilkan semakin kecil.
1. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 0,5; 0,8
dan 1,0 mL/menit
Penentuan komposisi dan flow rate fase gerak yang optimal dilakukan
dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow ratenya. Komposisi pertama
yang digunakan adalah komposisi metanol : akuabides/TEA3% dengan
perbandingan 30 : 70 menggunakan flow rate yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan
1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan larutan yang mengandung baku
teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.
Pada komposisi 30 : 70 ini, didapatkan peak yang runcing namun masih
mengalami tailing. Peak yang dihasilkan pada flow rate 0,5 mL/menit lebih lebar
dibandingkan 0,8 mL/menit dan 1 mL/menit, dan peak yang paling ramping
dihasilkan pada flow rate 1mL/menit. Semakin tinggi flow rate yang digunakan,
maka peak yang dihasilkan semakin kecil dan runcing. Permasalahan yang
ditemukan pada pemisahan dengan menggunakan komposisi ini adalah tailing
yang masih terjadi pada kromatogram. Berikut adalah hasil kromatogram larutan
baku campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi
fase gerak 30 : 70 dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 26. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
60
Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 26. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
60
Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 26. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Gambar 27. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Tailing yang terjadi pada kromatogram ini karena teobromin dan kafein
yang dianalisis merupakan senyawa basa yang cenderung akan mengalami
pengekoran karena berinteraksi dengan residu silanol pada kolom. Penggunaan
akuabides/TEA 3% pada komposisi ini adalah 70 bagian, dan metanol 30 bagian,
komposisi ini masih belum maksimal untuk mengelusi teobromin dan kafein dari
kolom. Pada tabel VI, dapat diketahui bahwa nilai tailing factor pada 0,5
mL/menit baik untuk teobromin dan kafein sudah kurang dari 2, begitu pula pada
flow rate 1 mL/menit, tetapi pada flow rate 0,8 mL/menit peak teobromin
mengalami tailing yang melebihi syarat karena nilai tailing factor yang dihasilkan
2,25.
Selain nilai tailing factor parameter HETP dan resolusi juga menjadi
pertimbangan, karena dari bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk
yang ramping dan runcing, namun mengalami tailing. Maka pemilihan juga dilihat
dari HETP dan resolusi keduanya. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel VII,
Kafein
Teobromin
61
Gambar 27. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Tailing yang terjadi pada kromatogram ini karena teobromin dan kafein
yang dianalisis merupakan senyawa basa yang cenderung akan mengalami
pengekoran karena berinteraksi dengan residu silanol pada kolom. Penggunaan
akuabides/TEA 3% pada komposisi ini adalah 70 bagian, dan metanol 30 bagian,
komposisi ini masih belum maksimal untuk mengelusi teobromin dan kafein dari
kolom. Pada tabel VI, dapat diketahui bahwa nilai tailing factor pada 0,5
mL/menit baik untuk teobromin dan kafein sudah kurang dari 2, begitu pula pada
flow rate 1 mL/menit, tetapi pada flow rate 0,8 mL/menit peak teobromin
mengalami tailing yang melebihi syarat karena nilai tailing factor yang dihasilkan
2,25.
Selain nilai tailing factor parameter HETP dan resolusi juga menjadi
pertimbangan, karena dari bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk
yang ramping dan runcing, namun mengalami tailing. Maka pemilihan juga dilihat
dari HETP dan resolusi keduanya. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel VII,
Kafein
Teobromin
61
Gambar 27. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Tailing yang terjadi pada kromatogram ini karena teobromin dan kafein
yang dianalisis merupakan senyawa basa yang cenderung akan mengalami
pengekoran karena berinteraksi dengan residu silanol pada kolom. Penggunaan
akuabides/TEA 3% pada komposisi ini adalah 70 bagian, dan metanol 30 bagian,
komposisi ini masih belum maksimal untuk mengelusi teobromin dan kafein dari
kolom. Pada tabel VI, dapat diketahui bahwa nilai tailing factor pada 0,5
mL/menit baik untuk teobromin dan kafein sudah kurang dari 2, begitu pula pada
flow rate 1 mL/menit, tetapi pada flow rate 0,8 mL/menit peak teobromin
mengalami tailing yang melebihi syarat karena nilai tailing factor yang dihasilkan
2,25.
Selain nilai tailing factor parameter HETP dan resolusi juga menjadi
pertimbangan, karena dari bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk
yang ramping dan runcing, namun mengalami tailing. Maka pemilihan juga dilihat
dari HETP dan resolusi keduanya. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel VII,
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
pemisahan paling besar terlihat pada flow rate 0,8 mL/menit dimana Rs yang
dihasilkan adalah 3,26 sedangkan untuk flow rate 0,5 mL/menit adalah 2,79 dan
flow rate 1 mL/menit adalah 1,723. Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini
sudah memenuhi persyaratan resolusi yang baik, karena resolusi yang diperoleh
sudah lebih dari 1,5 sehingga dapat dipastikan bahwa peak teobromin dan kafein
sudah terpisah dan tidak saling mengganggu pengukuran satu sama lain. Semakin
meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil resolusi yang diperoleh,
tetapi terjadi penyimpangan karena resolusi terbesar didapatkan pada flow rate 0,8
mL/menit. Secara keseluruhan, semakin meningkatnya flow rate, semakin kecil
resolusi yang didapatkan.
Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi fase gerak ini adalah yang
paling besar dibandingkan komposisi fase gerak lain, hal ini dapat dilihat pada
tabel VII. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin besar nilai HETP
yang didapatkan. Namun pada flow rate 0,8 mL/menit tidak sesuai karena nilai
HETP yang didapatkan justru lebih kecil dibandingkan flow rate 0,5 mL/menit.
Pada komposisi fase gerak 30 : 70 ini, flow rate yang menghasilkan
pemisahan yang paling baik adalah pada 1 mL/menit karena tailing factor yang
dihasilkan 1,75 dan 1,5 untuk teobromin dan kafein, resolusi yang dihasilkan
sudah mencapai 2,79 sehingga kedua peak sudah terpisah dengan baik serta nilai
HETP yang paling kecil baik untuk teobromin maupun kafein.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
2. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 0,5; 0,8
dan 1,0 mL/menit
Komposisi kedua yang digunakan adalah komposisi metanol :
akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 35 : 65 dengan menggunakan flow rate
yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan
larutan yang mengandung baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.
Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh dari larutan baku campuran
teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase gerak 35 : 65
dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:
Gambar 28. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Kafein
Teobromin
63
2. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 0,5; 0,8
dan 1,0 mL/menit
Komposisi kedua yang digunakan adalah komposisi metanol :
akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 35 : 65 dengan menggunakan flow rate
yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan
larutan yang mengandung baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.
Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh dari larutan baku campuran
teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase gerak 35 : 65
dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:
Gambar 28. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Kafein
Teobromin
63
2. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65 dengan flow rate 0,5; 0,8
dan 1,0 mL/menit
Komposisi kedua yang digunakan adalah komposisi metanol :
akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 35 : 65 dengan menggunakan flow rate
yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan
larutan yang mengandung baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.
Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh dari larutan baku campuran
teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase gerak 35 : 65
dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:
Gambar 28. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
Gambar 29. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Gambar 30. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Pada komposisi 35 : 65 ini, didapatkan peak yang lebih runcing
dibandingkan pada komposisi 30 : 70 untuk flow rate yang sama, selain itu waktu
retensi yang dihasilkan juga lebih pendek sehingga mempersingkat waktu analisis.
Peak yang dihasilkan lebih runcing, namun masih mengalami tailing. Tetapi nilai
tailing factor yang dihasilkan lebih kecil dibanding pada komposisi sebelumnya.
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
64
Gambar 29. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Gambar 30. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Pada komposisi 35 : 65 ini, didapatkan peak yang lebih runcing
dibandingkan pada komposisi 30 : 70 untuk flow rate yang sama, selain itu waktu
retensi yang dihasilkan juga lebih pendek sehingga mempersingkat waktu analisis.
Peak yang dihasilkan lebih runcing, namun masih mengalami tailing. Tetapi nilai
tailing factor yang dihasilkan lebih kecil dibanding pada komposisi sebelumnya.
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
64
Gambar 29. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Gambar 30. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 28 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Pada komposisi 35 : 65 ini, didapatkan peak yang lebih runcing
dibandingkan pada komposisi 30 : 70 untuk flow rate yang sama, selain itu waktu
retensi yang dihasilkan juga lebih pendek sehingga mempersingkat waktu analisis.
Peak yang dihasilkan lebih runcing, namun masih mengalami tailing. Tetapi nilai
tailing factor yang dihasilkan lebih kecil dibanding pada komposisi sebelumnya.
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak, dengan
begitu kemampuan fase gerak untuk mengelusi senyawa analit dari fase diamnya
lebih besar. Tailing factor yang paling kecil dihasilkan pada flow rate 1 mL/menit
untuk teobromin dan kafein. Pada komposisi ini, peak yang dihasilkan memenuhi
parameter tailing factor, dimana nilainya kurang dari 2, tetapi peak teobromin
pada flow rate 0,8 mL/menit mengalami penyimpangan karena nilainya lebih dari
2 yaitu 2,25.
Parameter lain yaitu nilai resolusi juga menjadi pertimbangan, karena dari
bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk yang ramping dan
runcing, namun mengalami tailing. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel
VIII, pemisahan paling besar terlihat pada flow rate 0,5 mL/menit dimana Rs nya
3,59 sedangkan untuk flow rate 0,8 mL/menit adalah 3,024 dan flow rate 1
mL/menit adalah 1,98. Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini sudah
memenuhi persyaratan resolusi yang baik, karena resolusi yang diperoleh sudah
lebih dari 1,5 sehingga dapat dipastikan bahwa peak teobromin dan kafein sudah
terpisah dan tidak saling mengganggu pengukuran satu sama lain. Semakin
meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil resolusi yang diperoleh.
Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi fase gerak ini lebih kecil
dibandingkan komposisi 30 : 70, dapat dilihat pada tabel VII. Nilai HETP yang
makin kecil dapat menggambarkan bahwa kolom yang digunakan semakin efisien
dalam pemisahan senyawa analit. Semakin tinggi flow rate yang digunakan,
semakin besar nilai HETP yang digunakan. Pada komposisi fase gerak ini, HETP
yang paling kecil didapatkan pada flow rate 0,5 mL/menit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Pada komposisi fase gerak 35 : 65 ini, flow rate yang paling optimal untuk
memisahkan tebromin dan kafein adalah 1 mL/menit. Nilai HETP yang dihasilkan
memang lebih besar dibandingkan pada flow rate lainnya tetapi untuk nilai tailing
factor yang dihasilkan paling kecil yaitu 1,125 dan 1,5 untuk teobromin dan kafein
serta resolusi yang dihasilkan lebih besar dari 2.
3. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,5; 0,8
dan 1,0 mL/menit
Komposisi ketiga yang digunakan adalah komposisi metanol :
akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 40 : 60 dengan menggunakan flow rate
yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan
larutan yang mengandung baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.
Pada komposisi 40 : 60 ini, didapatkan peak yang ramping namun tetap
mengalami tailing. Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya, kromatogram
cenderung untuk mengalami tailing karena analit merupakan senyawa basa dan
akan berinteraksi dengan residu silanol yang ada di dalam kolom C18. Meskipun
mengalami tailing, namun kromatogram yang dihasilkan masih memenuhi
parameter tailing factor yang baik karena nilai Tf masih lebih kecil dari 2, seperti
pada tabel VI. Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh larutan baku
campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase
gerak 40 : 60 dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Gambar 31. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 32. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
67
Gambar 31. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 32. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
67
Gambar 31. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:
Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm
Gambar 32. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 0,8 mL/menit
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Gambar 33. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi fase gerak perbandingan 40
: 60 ini lebih pendek dibandingkan pada komposisi fase gerak 30 : 70 dan 35 : 65.
Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak dan
kemampuan fase gerak dalam mengelusi senyawa analit menjadi lebih besar,
sehingga senyawa analit juga lebih cepat terelusi dari kolom. Dengan waktu
retensi yang lebih pendek, maka akan meningkatkan efisiensi waktu analisis.
Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, waktu retensi dari kedua analit
juga semakin pendek.
Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini juga memenuhi persyaratan
yaitu lebih dari 1,5. Penyimpangan terjadi pada flow rate 1 mL/menit dimana
resolusi yang dihasilkan adalah 1. Hal ini menggambarkan bahwa peak teobromin
dan kafein tidak terpisah secara sempurna atau tidak mengalami baseline, sehingga
pengukuran peak teobromin dan kafein dapat saling mengganggu. Hal ini terjadi
karena senyawa analit mengalami elusi yang lebih cepat akibat fase gerak yang
Kafein
Teobromin
68
Gambar 33. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi fase gerak perbandingan 40
: 60 ini lebih pendek dibandingkan pada komposisi fase gerak 30 : 70 dan 35 : 65.
Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak dan
kemampuan fase gerak dalam mengelusi senyawa analit menjadi lebih besar,
sehingga senyawa analit juga lebih cepat terelusi dari kolom. Dengan waktu
retensi yang lebih pendek, maka akan meningkatkan efisiensi waktu analisis.
Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, waktu retensi dari kedua analit
juga semakin pendek.
Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini juga memenuhi persyaratan
yaitu lebih dari 1,5. Penyimpangan terjadi pada flow rate 1 mL/menit dimana
resolusi yang dihasilkan adalah 1. Hal ini menggambarkan bahwa peak teobromin
dan kafein tidak terpisah secara sempurna atau tidak mengalami baseline, sehingga
pengukuran peak teobromin dan kafein dapat saling mengganggu. Hal ini terjadi
karena senyawa analit mengalami elusi yang lebih cepat akibat fase gerak yang
Kafein
Teobromin
68
Gambar 33. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 31 dengan flow rate 1,0 mL/menit
Waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi fase gerak perbandingan 40
: 60 ini lebih pendek dibandingkan pada komposisi fase gerak 30 : 70 dan 35 : 65.
Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak dan
kemampuan fase gerak dalam mengelusi senyawa analit menjadi lebih besar,
sehingga senyawa analit juga lebih cepat terelusi dari kolom. Dengan waktu
retensi yang lebih pendek, maka akan meningkatkan efisiensi waktu analisis.
Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, waktu retensi dari kedua analit
juga semakin pendek.
Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini juga memenuhi persyaratan
yaitu lebih dari 1,5. Penyimpangan terjadi pada flow rate 1 mL/menit dimana
resolusi yang dihasilkan adalah 1. Hal ini menggambarkan bahwa peak teobromin
dan kafein tidak terpisah secara sempurna atau tidak mengalami baseline, sehingga
pengukuran peak teobromin dan kafein dapat saling mengganggu. Hal ini terjadi
karena senyawa analit mengalami elusi yang lebih cepat akibat fase gerak yang
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
mengalir mengalami peningkatan kecepatan alir, tidak memberikan kesempatan
pada analit untuk berinteraksi lebih lama. Pada flow rate 0,5 dan 0,8 mL/menit
tidak mengalami masalah karena resolusi yang dihasilkan adalah 3 dan 2,942.
Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil nilai resolusi
yang dihasilkan.
Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi 40 : 60 ini adalah yang paling
kecil dibandingkan pada komposisi 30 : 70 dan 35 : 65, dapat dilihat pada tabel
VII. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin besar nilai HETP yang
didapatkan. Nilai HETP diharapkan dapat sekecil-kecilnya, karena semakin kecil
nilai HETP, makin efisien pemisahan pada kolom semakin baik. Pada komposisi
ini efisiensi kolom paling baik dibandingkan 2 komposisi lain dilihat dari nilai
HETP yang dihasilkan paling kecil dibandingkan komposisi lainnya. Nilai HETP
yang paling kecil didapat pada flow rate 0,5 mL/menit yaitu 0,0319 untuk
teobromin dan 0,0127 untuk kafein.
Pada komposisi 40 : 60 ini, didapatkan pemisahan yang paling baik jika
dilihat dari nilai tailing factor, HETP dan resolusi adalah pada flow rate 0,8
mL/menit. Tailing factor yang paling baik adalah pada flow rate 1 mL/menit,
tetapi resolusi yang dihasilkan adalah 1, sehingga pemisahannya belum baik. Pada
flow rate 0,5 mL/menit, resolusi yang dihasilkan bagus karena nilainya mencapai
3 namun tailing factor pada peak kafein tidak memenuhi persyaratan. Dapat
disimpulkan bahwa pada flow rate 0,8 mL/menit didapat pemisahan yang baik
dengan nilai resolusi 2,945, tailing factor 1,67 untuk masing-masing analit dan
HETP 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk kafein.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Dengan demikian, dari seluruh parameter yang digunakan untuk dapat
menentukan komposisi dan flow rate fase gerak yang paling optimal untuk
menghasilkan pemisahan yang baik antara teobromin dan kafein adalah komposisi
metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit. Pada
komposisi dan flow rate ini, Tf yang dihasilkan adalah 1,67 untuk teobromin dan
kafein, HETP yang dihasilkan adalah 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk
kafein serta resolusi 2,945. Selain parameter yang telah disebutkan, pemilihan juga
berdasarkan waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi dan flow rate ini cukup
singkat dimana tR untuk teobromin adalah 2,233 menit, sedangkan kafein adalah
3,557 menit.
Komposisi dan flow rate fase gerak yang dapat memberikan pemisahan
yang optimal sudah didapatkan, selanjutnya adalah melakukan pengujian
reprodusibilitas sistem (UKS/Uji Kesesuaian Sistem). Uji ini bertujuan untuk
mengetahui reprodusibilitas sistem yang dapat diamati dari nilai %CV harus < 2%
(Anonim, 2005). Dengan nilai %CV < 2% maka suatu sistem dikatakan memiliki
presisi yang baik, dengan begitu sistem yang digunakan bisa dikatakan “ajeg”,
karena dengan melakukan penginjekan berkali-kali hasil yang diperoleh tetap baik.
Uji Kesesuaian Sistem ini dilakukan dengan menggunakan larutan baku campuran
teobromin dan kafein pada 3 tingkat konsentrasi yaitu 40, 80 dan 160 ppm. Tiga
konsentrasi yang digunakan untuk memastikan bahwa reprodusibilitas sistem ini
dapat dijamin baik pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Parameter yang
digunakan pada UKS ini adalah waktu retensi, tailing factor, HETP, nilai Area
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Under Curve (AUC) dan resolusi. Berikut adalah hasil pengamatan pada Uji
Kesesuaian Sistem ini:
Tabel IX. Uji Kesesuaian Sistem KCKT pada pemisahan teobromin pada campuran
larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol
: akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit
KonsentrasiBaku
Teobromindan
Kafein
Ripitasi
Teobromin
tR(menit) Tailing factor HETP AUC
40 ppm 1 2,236 1,6500 0,0817 33689602 2,254 1,6875 0,0809 33700083 2,254 1,6250 0,0799 33677324 2,254 1,6250 0,0799 33695195 2,255 1,6250 0,0798 3372030
rata-rata 2,2478 1,6425 0,0805 3369646,8SD 9,0664x10-3 0,0274 8,0558x 10-4 15783,3770CV (%) 0,4033 1,6673 1,001 0,0468
80 ppm 1 2,239 1,5 0,068 60908112 2,245 1,5 0,0677 60864003 2,246 1,5625 0,0676 60929384 2,244 1,5 0,0677 60867025 2,245 1,5 0,0677 6087957
rata-rata 2,2438 1,5125 0,0678 6088961,6SD 2,7748X10-3 0,0279 1,6649X10-4 2824,4336CV (%) 0,1237 1,8477 0,2456 0,0464
160 ppm 1 2,24 1,57 0,0455 121603082 2,233 1,5625 0,0458 121624073 2,24 1,571 0,0455 121531414 2,241 1,571 0,0454 121583545 2,239 1,571 0,0455 12165580
rata-rata 2,2386 1,67 0,0455 12159958SD 3,2093X10-3 0 1,5166X10-4 4657,553CV (%) 0,1434 0 0,333 0,0383
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Tabel X. Uji Kesesuaian Sistem KCKT pada pemisahan kafein pada campuran
larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol
: akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit
KonsentrasiBaku
Teobromindan
Kafein
Ripitasi
Kafein
tR(menit) Tailing factor HETP AUC
40 ppm 1 3,608 1,500 0,0366 30503242 3,607 1,545 0,0366 30638933 3,619 1,500 0,0364 30852684 3,617 1,500 0,0364 30838485 3,617 1,500 0,0364 3059155
rata-rata 3,6136 1,509 0,0365 3068497,6SD 5,639x10-3 0,0201 1,0954 x 10-4 15.456,7726CV (%) 0,0156 1,334 0,3003 0.5037
80 ppm 1 3,598 1,625 0,0264 56219052 3,609 1,625 0,0262 56173393 3,611 1,611 0,0261 56266394 3,611 1,625 0,0261 56098445 3,615 1,625 0,0261 5617836
rata-rata 3,588 1,6222 0,0262 5618712,6SD 1x10-3 6,2609X10-3 9,1104X10-5 6.211,4229CV (%) 0,0278 0,3859 0,3474 1,105
160 ppm 1 3,6 1,69 0,0263 111590112 3,583 1,6875 0,0266 111606933 3,602 1,750 0,0263 111549574 3,604 1,688 0,0263 111595435 3,6 1,688 0,0263 11186139
rata-rata 3,5978 1,7 0,02363 11164068SD 8,4380X10-3 0,02795 1,3416X10-4 12.525,7594CV (%) 0,2345 1,64416 0,5589 0,1122
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Tabel XI. Uji Kesesuaian Sistem KCKT resolusi pada campuran larutan baku
teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit
KonsentrasiBaku
Teobromindan
Kafein
Ripitasi Resolusi
40 ppm 1 1,82932 1,82273 1,88274 1,885 1,8467
rata-rata 1,8523SD 0,0279CV (%) 1,5097
80 ppm 1 2,17442 2,18243 2,14 2,18725 2,1192
rata-rata 2,1672SD 0,0381CV (%) 1,7591
160 ppm 1 2,1762 2,1253 2,1794 2,1815 2,168
rata-rata 2,1658SD 0,0233CV (%) 1,0776
Semua parameter yang harus dipenuhi yaitu tailing factor, waktu retensi,
HETP, AUC serta resolusi pada kromatogram yang dihasilkan, diperoleh nilai
%CV kurang dari 2% baik pada konsentrasi rendah, tengah maupun tinggi, data
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
yang diperoleh dapat dilihat pada tabel IX, X dan XI. Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa sistem yang digunakan pada optimasi metode KCKT ini
memiliki reprodusibilitas yang baik.
Berdasarkan hasil optimasi serta Uji Kesesuaian Sistem yang dilakukan
pada penelitian ini, didapatkan kesimpulan bahwa komposisi fase gerak metanol :
akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit adalah yang paling baik
menghasilkan pemisahan teobromin dan kafein dengan menggunakan metode
KCKT fase terbalik. Metode ini juga memiliki reprodusibilitas yang baik, dengan
demikian dapat digunakan dalam tahapan validasi metode analisis serta penetapan
kadar teobromin serta kafein.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Kondisi optimum yang didapatkan pada pemisahan teobromin dan kafein
untuk aplikasi dalam sampel serbuk cokelat dengan metode KCKT fase
terbalik adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA
3% (40 : 60) pada flow rate 0,8 mL/menit, dengan spesifikasi sebagai berikut:
Kolom : Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi
250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm
Detektor : Ultraviolet pada 275 nm
B. Saran
1. Perlu dilakukan validasi metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar
teobromin dan kafein.
2. Perlu dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel serbuk
cokelat merek ‘x’.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Daftar Pustaka
Alexander, J., Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, J.P., Dogliotti, E., andDomenico, A.D., 2008, Theobromine as undesirable substances inanimal feed, The Eur. Food Safety Authority J., 725, pp. 1-66.
Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia The National Formulary,Volume II, United States Pharmacopeial Convention, INC, Rockville,pp. 2389.
Anonim, 2011, Theobroma cacao, http://en.wikipedia.org/wiki/Theobroma_cacao, diakses tanggal 21 Oktober 2011.
Chan, C. C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X.M., 2004, Analytical MethodValidation and Instrument Performance Verification, John Wiley &Sons, Canada, pp. 173-184.
Choo, Khor Swan and Tee E-Siong, 1996, Development of a HPLC method forthe simultaneous determination of several B-vitamins and ascorbic acid,Malay. J. Nutrition., 2, pp. 49-65.
Czech, K., Johnson, A., and Rodeberg, N., 2011, Simultaneous determination ofcaffeine and theobromine in local area coffee brews, Con. Coll. J. Anal.Chem., 2, pp. 17-22.
Clarke, E.G.C., 1969, Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals,Body Fluids and Post-mortem material, Pharmaceutical Press, London,pp. 234, 567.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp. 323-346.
Gennaro, A.R., 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th
Edition, Lippincott William & Wilkins, Philadephia, pp. 1472.
Gonzales, A.Gustavo., and Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to AnalyticalMethod Validation, including Measurement Uncertainty and AccuracyProfile, Trends in Anal. Chem., 26, pp. 232, 234.
Johnson, E. L. and Stevenson, R., 1978, Dasar Kromatografi Cair, diterjemahkanoleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 17-22.
Kasabe, A. J. and Badhe, G. B., 2010, Extraction and Estimation of Theobrominein Marketed Tea by HPTLC and UV Method, Int. J. App. Biol. andPharm. Tech., 1, pp. 367-373.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh A.Saptohardjo, Pendamping Agus Nurhadi, UI Press, Jakarta, pp. 194, 202.
Kuwana, T., 1980, Physical Methods In Modern Chemical Analysis, Vol II,Academic Press, London, pp. 12, 29.
Long, William J. and Henderson, Jhon W. Jr., 2007 Chromatography of Nitrogen-Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent Technology.
Moffat, A.C., Osselton, M.D. and Widdop B., 2004, Clarke’s: Analysis of drugand poisons, Pharmaceutical Press, USA
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,Surabaya, pp. 6-11, 26, 31, 34.
Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta, pp. 16, 17.
Pescok, R. L., Shields, L. D., and Cains, T., 1976, Modern Methods of ChemicalAnalysis, 2nd ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 51.
Ptolemy, Adam S., Tziousmis, E., Thomke, A., Rifai, S., and Kellogg, M., 2010,Quantification of Theobromine and Caffeine in Saliva, Plasma andUrine via Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry: ASingle Analytical Protocol Applicable to Cocoa Intervention Studies, J.Chrom. B., 878, pp. 409-416.
Ramli, N., Yatim, A. M., Said, M., and Hok, H. C., 2000, HPLC Determination ofMethylxanthines and Polyphenols Levels In Cocoa and ChocolateProducts, Malay. J. Anal. Sci., 7, pp. 377-386.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,pp. 13, 11, 117.
Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Penerbit Liberty, Yogyakarta, pp. 8-12,17-19.
Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd, Saunders CollegePublishing, USA, pp. 185-188.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 208,209,710-723.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 2010, Introduction to ModernLiquid Chromatography, 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.20-57.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Wanyika, H. N., Gatebe, E. G., Gitu, L. M., Ngumba, E.K., and Maritim, C.W.,2010, Determination of Caffein Content of Tea and Instant CoffeeBrands Found in Kenyan Market, Af. J. Sci., 4, pp. 353-358.
Willard, H. H., Merrit, Jr., Dean, J.A., and Settle Jr, F.A., 1988, InstrumentalMethods of Analysis, 7th ed., Wadsworth Publishing Company,California, pp. 525-529.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 1. COA
TEOBROMIN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Lampiran 2. COA KAFEIN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : akuabides/TEA 3% (30 : 70)
a. Flow rate 0,5 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
b. Flow rate 0,8 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Detektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
c. Flow rate 1 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 1 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Teobromin
Kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 4. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : Akuabides/TEA 3% (35 : 65)
a. Flow rate 0,5 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
b. Flow rate 0,8 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Detektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
c. Flow rate 1 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 1mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)a. Flow rate 0,5 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
b. Flow rate 0,8 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
c. Flow rate 1 mL/menit
Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 1 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 6. Nilai Tailing Factor (Tf) peak teobromin dan kafein pada fasegerak metanol : akuabides/TEA 3% dan contoh perhitungan.
Komposisi fase gerakMetanol :
akuabides (TEA 3%)
Flow rate(mL/menit)
Teobromin Kafein
a b T.f a b T.f
40 : 60 0,5 0,2 0,5 1,75 0,2 0,6 20,8 0,2 0,3 1,67 0,15 0,35 1,67
1 0,15 0,35 1,67 0,2 0,35 1,375
35 : 65 0,5 0,25 0,5 1,5 0,2 0,55 1,50,8 0,1 0,35 2,25 0,2 0,35 1,67
1 0,2 0,25 1,125 0,15 0,3 1,5
30 : 70 0,5 0,2 0,5 1,75 0,25 0,5 1,50,8 0,1 0,35 2,25 0,15 0,35 1,67
1 0,1 0,25 1,75 0,2 0,25 1,125
Contoh perhitungan :
Tailing factor (T.f) = = = 1,75
b =
a =
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Lampiran 7. Nilai HETP dari peak teobromin dan kafein pada fase gerakmetanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate serta contoh perhitungan.
Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3% Flow rate
(mL/menit)
TeobromintR
(menit) w1/2 h N HETP
40 : 60 0,5 3,5670 0,3 783,2014 0,03190,8 2,2330 0,2 690,6010 0,0362
1 2,277 0,55 94,9534 0,263335 : 65 0,5 3,551 0,6 194,0477 0,1288
0,8 2,232 0,4 172,4957 0,14491 1,790 0,5 71,0029 0,3521
30 : 70 0,5 3,549 0,8 109,0289 0,22930,8 2,230 0,5 110,1995 0,2268
1 1,788 0,5 70,8443 0,3528
Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3%
Flow rate(mL/menit)
KafeintR
(menit) w1/2 h N HETP
40 : 60 0,5 5,6520 0,3 19663,986 0,01270,8 3,5570 0,2 1752,3365 0,0143
1 2,852 0,6 125,1717 0,199735 : 65 0,5 5,705 0,6 500,8626 0,0499
0,8 3,593 0,5 277,5434 0,09011 2,878 0,6 127,4644 0,1961
30 : 70 0,5 5,784 0,8 289,5919 0,08630,8 3,629 0,5 291,8392 0,0857
1 2,908 0,6 130,1356 0,1921Contoh perhitungan nilai HETP :
h
½ h
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
N = 5,54 x ( )
N = 5,54 x (
N= 783.2014
HETP =
Panjang Kolom = 25 cm
HETP = = 0.0319
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
Lampiran 8. Nilai Resolusi (Rs) peak teobromin dan kafein pada fase gerakmetanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate serta contoh perhitungan.
Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3%
Flow rate(mL/menit)
Waktu Retensi ResolusitR 1
(menit)tR 2
(menit) w1 w2 Rs
40 : 60 0,5 3,5670 5,6520 0,75 0,6 30,8 2,2330 3,5570 0,5 0,4 2,942
1 2,277 2,852 0,2 0,2 1
35 : 65 0,5 3,551 5,705 0,6 0,6 3,590,8 2,232 3,593 0,4 0,5 3,024
1 1,790 2,878 0,5 0,6 1,98
30 : 70 0,5 3,549 5,784 0,8 0,8 2,790,8 2,230 3,629 0,5 0,5 3,26
1 1,788 2,908 0,5 0,8 1,723
Contoh perhitungan :
Rs =
Rs =
Rs = 3
W1
W2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Lampiran 9. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin dan kafeinkonsentrasi 40 ppm
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 1Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 2Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
Detektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 3Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 4Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 5Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
Lampiran 10. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin dan kafeinkonsentrasi 80 ppm
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 1Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 2Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
Detektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 3Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 4Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 5Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
Lampiran 11. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin dan kafeinkonsentrasi 160 ppm
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 1Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 2Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 3Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 4Fase diam Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 5Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gera : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2
Kafein
Teobromin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Optimasi Komposisi danFlow Rate Fase Gerak Pada Penentuan Kadar Teobromindan Kafein dalam Cokelat Bubuk dengan MenggunakanMetode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik”ini memiliki nama lengkap Eka Riusinta Wati. Penulislahir di Medan, pada 27 September 1990. Penulis adalahanak pertama dari dua bersaudara pasangan Budiono danSabariah. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya diTK Karya Maju Medan pada 1995-1996, SD AntoniusMedan pada 1996-1997, SD Strada Cakung Bekasi pada
1996-2002, SMP Strada Kampung Sawah Bekasi pada 2002-2005 dan SMAPangudi Luhur II Servasius Bekasi pada 2005-2008. Kemudian penulismelanjutkan studi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008.Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,pernah menjadi asisten praktikum Farmasi Fisika dan praktikum Formulasi danTeknologi Sediaan Semi-Solid. Selain kegiatan akademik, penulis juga aktifdalam kegiatan organisasi yaitu sebagai sekretaris organisasi DPMF FakultasFarmasi (2011-2012), menjadi anggota sie acara dalam kegiatan Titrasi (2009)dan Donor darah JMKI (2009), anggota kesekretariatan dalam kegiatan SeminarTOI (2010) dan menjadi MC dalam kegiatan Pelepasan Wisuda (2011). Penulisjuga pernah menjadi relawan korban merapi di Hargobinagun dan stadionMaguwoharjo. Penulis pernah mendapatkan beasiswa Peningkatan PrestasiAkademik (PPA) tahun 2010-2011 dan PKA-Rahmat periode 2011-2012.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI