plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · 2016-01-29 · i pengaruh pemberian pakan...

PENGARUH PEMBERIAN PAKAN BERANTIBIOTIK PADA POPULASI

MIKROBA AIR, KADAR PROTEIN SEDIMEN DAN AKUMULASI

TETRASIKLIN DENGAN MENGGUNAKAN PENGEMBANGAN

METODE ANALISIS TETRASIKLIN SERTA PENGARUHNYA PADA

LAJU PERTUMBUHAN LOBSTER AIR TAWAR (Cherax quadricarinatus)

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Aditya Christian Firmanto

NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i






SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 118114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015


ii

Persetujuan Pembimbing






Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 118114161

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

(Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.) Tanggal 3 Desember 2015


http://www.usd.ac.id/profile_detail.php?id=01089

iii

Pengesahan Skripsi Berjudul






Oleh :


NIM : 118114161

Dipertahankan dihadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Mengetahui

Fakultas Farmasi


Dekan

(Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji:

Tanda tangan

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.

2. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt.

3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc.


iv

Halaman Persembahan

“Dunia tak akan selebar ini jika tidak ada ilmu yang

mendampingi. Dunia tak akan semegah ini bila tidak ada orang-

orang dengan usaha di dalamnya. Dunia tak akan seberlimpah

ini bila Tuhan tidak mengijinkan semua ini terjadi.”

Karya kecil ini, penulis persembahkan untuk pelebaran dunia dan

kemuliaan nama Tuhan.


v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Aditya Christian F

Nomor Mahasiswa : 118114161

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air,

Kadar Protein Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan

Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju

Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya

maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Dengan pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal, Januari 2016

Yang menyatakan

(Aditya Christian F)


vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis

dan susun ini tidak memuat karya atau bagian dari pekerjaan orang lain, kecuali

yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya

karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala resiko sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku

Yogyakarta, Desember 2015

Penulis,



vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas limpah karuniaNya

penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul “Pengaruh Pemberian

Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen Dan

Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis

Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar

(Cherax quadricarinatus)” dengan baik. Tugas akhir ini disusun untuk memenuhi

salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Farmasi program studi Farmasi.

Selama penyusunan dan penyelesaian tugas akhir ini, penulis telah

mendapatkan banyak dukungan berupa doa, semangat, bantuan, kritik dan saran

dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini penulis hendak berterima kasih

kepada:

1. Bapak dan ibu serta adik atas doa, kasih saying, kesabaran, materi, motivasi,

nasehat dan pendapat yang diberikan pada penulis selama penyusunan tugas

akhir ini.

2. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi


3. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku dosen pembimbing yang telah

membimbing, memberikan diskusi, kritik dan saran kepada penulis mulai dari

penyusunan proposal, proses penelitian hingga penyusunan naskah tugas

akhir ini.


viii

4. Bapak dan Ibu Karjono selaku seperti pembimbing kedua dalam menyusun

skripsi, menimba ilmu tentang lobster dan belajar mengenai nilai-nilai

kehidupan.

5. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. sebagai dosen penguji dan atas

kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan,

kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.

6. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. sebagai dosen penguji dan atas

kesediannya dan kesabarannya dalam memberikan waktu serta pengarahan,

kritik, dan saran yang membangun untuk penyelesaian skripsi ini.

7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, nasihat

dan bimbingan yang telah diberikan.

8. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium yang

bersedia direpotkan dengan banyak permintaan tanda tangan surat lembur.

9. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi: Mas Bimo, Pak Parlan,

Mas Kunto, Pak Wagiran, Mas Kayat dan Mas Agung atas bantuannya

selaman penelitian berlangsung.

10. Tante Yolanda Novia selaku partner skripsi yang mampu dan mau sabar

menjalani tiap proses sedih dan senang selama penyusunan skripsi.

11. Adik Vincentius Henzu selaku teman dan manager yang mau mengorbankan

banyak waktu, kesibukan, materi dan diri untuk mendukung bahkan

menghibur selama proses penyusunan skripsi ini walau tidak dibayar sepeser

pun.


ix

12. Mbak Gita Mentari selaku teman seperjuangan yang sudah bersedia

menyediakan tempat untuk menyusun naskah mentah selama 2 minggu.

13. Bibi Villianova dan Bibi Ratna sebagai teman yang setia mendukung dan

menunggu sidang pendadaran.

14. Adik Gaiety Suthami sebagai teman sekaligus tempat sampah selama proses

penyusunan skripsi.

15. Mas Wahyu Bramastyo sebagai mentor dan motivator dalam mengambil

setiap langkah selama proses penyusunan skripsi.

16. Teman-teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas

kerja sama dan kebersamaan selama proses perkuliahan.

17. Seluruh pihak yang telah membantu selama proses penelitian ini yang tidak

dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadariada banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini.

Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak. Akhir

kata, penulis meminta maaf apabila ada kesalahan dalam penyusunan skripsi ini.

Semoga skripsi ini dapat berkontribusi baik untuk kemajuan ilmu pengetahuan

farmasi.

Yogyakarta, Desember 2015

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................. i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................. v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... vi

PRAKATA .................................................................................................. vii

DAFTAR ISI ............................................................................................... x

DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvii

INTISARI. ................................................................................................... xix

ABSTRACT .................................................................................................. xx

BAB I. PENDAHULUAN .......................................................................... 1

A. Latar Belakang ....................................................................................... 1

1. Rumusan masalah ............................................................................... 3

2. Keaslian penelitian ............................................................................. 3

3. Manfaat penelitian .............................................................................. 4

B. Tujuan Penelitian .................................................................................... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 5

A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar ..................................................... 5


xi

1. Permodelan semi intensif ........................................................................ 5

2. Derajad keasaman (pH) dan kesadahan .................................................. 6

3. Dissolve of oxygen dan suhu ................................................................... 7

4. Sedimen ................................................................................................... 7

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus) ......................... 8

C. Persiapan Pakan Lobster......................................................................... 9

1. Pakan lobster ........................................................................................... 9

2. Tetrasiklin HCl ........................................................................................ 10

D. Mikroorganisme ..................................................................................... 11

E. Protein ..................................................................................................... 12

F. Coomasie Brilliant Blue (CBB) .............................................................. 14

G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif.............................................. 15

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ............................ 16

I. Validasi metode ....................................................................................... 17

1. Akurasi ............................................................................................... 18

2. Presisi ................................................................................................. 18

3. Linearitas ............................................................................................ 18

4. Selektivitas ......................................................................................... 19

5. Kriteria ................................................................................................ 19

J. Landasan Teori ........................................................................................ 19

K. Hipotesis ................................................................................................. 21

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .................................................. 22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................. 22


xii

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................ 22

C. Bahan Penelitian ..................................................................................... 24

D. Alat Penelitian ........................................................................................ 24

E.Tata Cara Penelitian ................................................................................. 25

F. Analisis Hasil .......................................................................................... 41

G. Rancangan Penelitian ............................................................................. 45

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... 46

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar .......................................... 46

B. Tahap Persiapan Pakan Lobster ............................................................. 47

1. Validasi dan analisis kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam sediaan

kapsul ................................................................................................ 47

2. Optimasi dosis TCH ......................................................................... 48

3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik .................... 49

C. Tahap Ekstraksi Protein .......................................................................... 50

D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif .................. 51

E. Analisis Sampel ...................................................................................... 53

1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster .......................... 53

2. Analisis kadar protein dalam sedimen ................................................ 57

3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster ....... 59

F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster ..................................... 60

1.Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster ............................... 61

2.Orientasi panjang gelombang TC ........................................................ 63

3. Penetapan puncak TC ......................................................................... 63


xiii

4.Optimasi fase gerak HPLC .................................................................. 65

G. Validasi Metode HPLC .......................................................................... 66

H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster .................... 69

I. Keterbatasan Penelitian............................................................................ 70

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 71

A. Kesimpulan ............................................................................................ 71

B. Saran ....................................................................................................... 71

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 72

LAMPIRAN ................................................................................................ 76

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 104


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Taksonomi lobster air tawar .......................................................... 9

Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak .................................. 10

Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan................................................. 12

Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul .................... 48

Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH .................... 49

Tabel VI. %D kurva adisi protein ............................................................... 53

Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ............... 66

Tabel VIII. %D kurva adisi TC ................................................................... 68

Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi TC .................................................... 68

Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster ................................ 70


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl ........................................................... 11

Gambar 2. Struktur CBB R-250 ................................................................ 14

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB ........................................... 15

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi .......................... 51

Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein ....... 52

Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik ............................... 54

Gambar 7. Log populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik ......... 55

Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok

kontrol) .................................................................................... 55

Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok

perlakuan) ................................................................................ 56

Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan ... 59

Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kontrol dan perlakuan .. 60

Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kontrol dan perlakuan ....... 60

Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam .................................... 62

Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak ............. 63

Gambar 15. Kromatogram blangko............................................................. 64

Gambar 16. Kromatogram standar TC basa ................................................ 64

Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak methanol:buffer

McIlvaine ................................................................................ 66

Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer

McIlvaine ............................................................................... 66


xvi

Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC ............. 67

Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam ............................................. 69


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl ...................... 77

Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl ......................................... 78

Lampiran 3. COA reagen coomasie R ............................................................ 79

Lampiran 4. COA albumin (BSA) ................................................................. 80

Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar .............................................. 81

Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ........... 84

Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul ............ 84

Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin ..... 85

Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0 ................................ 86

Lampiran 10. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 3 .............................. 87



Lampiran 13. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 14 ............................ 93

Lampiran 14. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 28 ............................ 95

Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba ......................................... 97

Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein ................... 97

Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein .............................. 97

Lampiran 18. Contoh perhitungan %D .......................................................... 97

Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD ...................................................... 98

Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ ........................................................ 98

Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein ............................................ 98


xviii

Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen ............................................ 99

Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar.......................................... 99

Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar .............................................. 99

Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin ..................... 99

Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin ........................... 100

Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin ..................................... 100

Lampiran 28. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva baku solven ................... 100

Lampiran 29. Contoh kromatogram tetrasiklin kurva adisi tetrasiklin .............. 100

Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging

hari ke 14 .............................................................................. 101

Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging

hari ke 28 .............................................................................. 101

Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan ........................ 101

Lampiran 33. Proses perlakuan ................................................................... 101

Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar ..................................................... 102

Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28 .................... 102

Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05) .......... 102

Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan

berat ..................................................................................... 103


xix

INTISARI

Budidaya lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) merupakan

pemanfaatan sumber daya alam yang cukup diminati masyarakat karena mudah

dilakukan bahkan memiliki prospek yang baik di Indonesia dan manca negara.

Yang menjadi masalah adalah adanya akumulasi antibiotik dalam daging lobster

akibat penggunaan antibiotik untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster

dari penyakit. Tentunya penggunaan antibiotik dalam akuakultur akan

mempengaruhi kualitas air, maka perlu dilakukan analisis pengaruh pakan

berantibiotik pada populasi mikroba dalam air dan kadar protein sedimen sebagai

parameter kualitas air dan kadar akumulasi antibiotik dalam daging serta

pengaruhnya terhadap laju pertumbuhan lobster air tawar.

Dalam penelitian ini dilakukan pemberian pakan berantibiotik

(Tetrasiklin HCl) dan pakan kontrol (tanpa antibiotik) sebagai pembanding, pada

lobster air tawar selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Populasi mikroba dalam air diuji

dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu), kadar protein sedimen

dianalisis dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif, dan

kadar akumulasi tetrasiklin daging menggunakan metode HPLC fase terbalik.

Analisis hasil dilakukan dengan membandingkan hasil populasi mikroba, kadar

protein dan laju pertumbuhan lobster kelompok kontrol dan kelompok perlakuan

antibiotik.

Hasil penelitian menunjukkan fluktuatif populasi mikroba dalam air

tetapi menunjukkan tren polinomial log populasi mikroba yang tidak meningkat

maupun menurun. Kadar protein sedimen, panjang dan berat lobster meningkat

tetapi tidak berbeda antara kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan antibiotik

terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster sebesar 53,0970 µg/g.

Kata kunci : Lobster air tawar, sedimen, tetrasiklin, spektrofotometri sinar

tampak, derivatif, HPLC


xx

xx

ABSTRACT

The freshwater lobster cultivation is one of the natural resources

utilization which has been interested by many people in community because it is

simple to do, even it has good prospect for future business in Indonesia and

foreign countries. The problem is that there is antibiotic accumulation in meat

because antibiotics usage in feeding lobster to maintain their health and

productivity of cultivated lobster. Surely, antibiotics usage in aquaculture will

influence the water quality, therefore the analysis of microbial population in water

and amount of protein in sediment as the parameter of the water quality,

antibiotics accumulation in meat and its effect to growth rate of freshwater lobster

are needed.

In this study, treatment had been given by feeding lobster using food

containing antibiotics (tetracycline HCl) and food without antibiotics as control

for a period of 3, 5, 7, 14 and 28 days. Microbial population in water was analysed

by using colony forming unit method, the amount of protein in sediment by using

CBB R method and spectrophotometry visible derivative, and antibiotics

accumulation in meat by using reverse-phase HPLC. The result was analysed by

comparing the amount of microbial population and protein, also length and weight

of freshwater lobter both control group and treatment group.

The result in this study showed fluctuation of microbial population in

water but there was no increasing or decreasing of log microbial population in

polynomial trend. The amount of protein in sediment, length and waeight of

freshwater lobster had been increasing but it showed no difference both control

group and treatment group. In treatment group, the accumulation of antibiotics in

meat was 53,0970 µg/g.

Keywords : Freshwater lobster, sediment, tetracycline, spectrophotometry visible,

derivative, HPLC


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kebutuhan pangan yang meningkat menyebabkan masyarakat mencari

alternatif pemanfaatan sumber daya alam, mulai dari pertanian hingga perikanan.

Salah satu pemanfaatan sumber daya perikanan yang cukup diminati adalah

budidaya lobster air tawar, karena budidaya lobster air tawar relatif mudah dan

memiliki profit yang cukup tinggi. Kemudahan dalam pengembangbiakan lobster

air tawar ini membuat minat masyarakat semakin meningkat (Lim, 2006).

Masalah yang ada dalam budidaya perikanan saat ini adalah kondisi

cuaca ekstrim dan kelembaban udara yang tinggi. Kondisi ini menyebabkan laju

pertumbuhan mikroba semakin tinggi dan berakibat pada penurunan produktivitas

lobster air tawar karena penyakit oleh mikroba. Mikroba yang banyak dilaporkan

menyebabkan penyakit hingga kematian pada golongan Crustaceae adalah Vibrio

spp (Ansari dan Raissy, 2010). Hal ini membuat peternak menggunakan antibiotik

sebagai alternatif untuk menjaga kesehatan dan produktivitas lobster air tawar

dengan menghambat atau membunuh mikroba merugikan yang ada di habitat

(Kurniawan, 2010).

Penggunaan antibiotik sebagai pencegah penyakit pada ternak memiliki

kerugian, yaitu terjadi akumulasi antibiotik dalam tubuh ternak. Hal ini dibuktikan

dengan adanya penolakan hasil budidaya perikanan maupun peternakan oleh

beberapa negara, disebabkan oleh adanya akumulasi senyawa antibotik

Chloramphenicol dalam daging ternak. Akumulasi senyawa antibiotik dalam


2

daging ini dikhawatirkan memberikan pengaruh yang buruk jika dikonsumsi

manusia dalam jangka panjang, sehingga penggunaan antibiotik dalam beberapa

hal seperti tambahan dalam pakan ternak sudah dibatasi bahkan dilarang (Weifen,

Hong, Changhu, dan Jamil, 2004).

Air dan sedimen merupakan komponen habitat yang mendukung

pertumbuhan dan perkembangan lobster. Tentunya parameter air yang layak untuk

lobster hidup juga diperlukan, seperti ketersediaan oksigen dan komponen organik

dalam air. Sedimen merupakan sisa pakan dan hasil ekskresi dari lobster air tawar

yang sebagian besar adalah protein, mengendap di dasar habitat. Sedimen ini akan

berada dalam habitat lobster dan memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan

lobster. Dalam hal ini, peran mikroba terhadapsiklus kimia air sangat diperlukan

untuk menjaga kualitas air. Dalam penelitian digunakan tetrasiklin HCl sebagai

perlakuan antibiotik, karena tetrasiklin HCl memiliki spektrum yang lebar dalam

menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif (Krasner dan

Shors, 2014). Keberadaan pakan yang mengandung tetrasiklin dalam habitat, akan

berdampak pada kualitas sedimen yang terbentuk di dalam air. Adanya masalah

pada kualitas sedimen maupun kondisi air akan berpengaruh pada tumbuh

kembang lobster, maka perlu dilakukan penelitian terkait pengaruh pakan

mengandung antibiotik terhadap habitat dan laju pertumbuhan lobster dalam

jangka waktu tertentu.

Pengamatan pengaruh pakan mengandung antibiotik terhadap habitat

dilakukan dengan melihat jumlah populasi mikroba pada air, dan kandungan

protein pada sedimen dengan metode coomassie brilliant blue R dan


3

spektrofotometri sinar tampak derivatif (400-800 nm). Pengamatan laju

petumbuhan lobster dilakukan dengan mengukur panjang dan berat lobster dan

pengamatan akumulasi antibiotik dengan metode High Performance Liquid

Chromatograhpy (HPLC) fase terbalik dengan pengembangan. Validasi yang

dilakukan dalam penelitian ini meliputi akurasi (%D), presisi (%RSD),

sensitivitas (LOQ), dan linearitas (r). Analisis hasil dilakukan dengan

membandingkan antara perlakuan dan kontrol dengan hari perlakuan pakan

mengandung antibiotik.

1. Rumusan masalah

a. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi

mikroba dalam habitat lobster air tawar?

b. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam

sedimen lobster air tawar?

c. Bagaimana pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan

lobster air tawar?

d. Apakah terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar?

2. Keaslian penelitian

Penelitian yang dipublikasikan terkait sedimen adalah bioremediasi

sedimen tambak lobster (Kurniawan, 2010), Measurement of Protein in

Nearshore marine Sedimens (Mayer et al, 1986). Determination of Tetracycline

Antibiotic Residues in Edible Swine Tissues by Liquid Chromatography with

Spectrofluorometric Detection and Confirmation by Mass Spectrometry (Pena et

al, 2007). Method Development and Validation of Tetracycline Antibiotics and


4

their Epimers in Marine Products as per the EU Guidelines (Vora, 2013). Sejauh

peneliti mengamati penelitian sebelumnya, belum ada yang mengamati pengaruh

pakan antibiotik tetrasiklin HCl terhadap populasi mikroba dalam akuakultur,

kada protein dalam sedimen dan akumulasi pada lobster air tawar dengan

pengembangan metode analisis tetrasiklin sebagai indikator laju pertumbuhan

lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi dan pengetahuan terkait pengaruh pakan berantibiotik terhadap

budidaya lobster air tawar. Selain itu hasil penelitian juga dapat

sumbangsih untuk penelitian lain terkait penggunaan tetrasiklin dalam

akuakultur agar ilmu dapat berkembang lebih baik.

b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan

kualitas lingkungan hidup lobster air tawar yang berdampak pada kualitas

lobster.

B. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap jumlah populasi mikroba

dalam habitat lobster air tawar.

2. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap kadar protein dalam

sedimen lobster air tawar.

3. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik terhadap laju pertumbuhan lobster

air tawar.

4. Mengetahui kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster air tawar


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Persiapan Habitat Lobster Air Tawar

1. Permodelan semi intensif

Budidaya dengan sistem semi intensif ini merupakan budidaya dengan

padat penebaran cukup tinggi, menggunakan kincir dan pakan buatan atau pelet.

Dalam kondisi demikian, beban bahan organik tambak menjadi tinggi. Bahan

organik berasal dari ekskresi udang, sisa pakan dan bangkai organisme

mengendap di dasar tambak. Untuk menanggulangi hal tersebut, pada tambak

semi intensif dilakukan pengaerasian dan pergantian air yang cukup, baik

kuantitas maupun frekuensinya. Upaya tersebut dilakukan guna mempertahankan

kualitas air bagi kelangsungan hidup dan pertumbuhan optimum organisme

(Effendy, 1998).

Salah satu hal yang berperan penting pada tahap awal budidaya lobster

adalah kualitas air. Secara umum kualitas air berhubungan dengan kandungan

bahan terlarut di dalamnya. Tingkat kandungan dari bahan tersebut akan

menentukan kelayakannya. Beberapa sifat fisika dan kimia air yang dapat

mempengaruhi hidup lobster air tawar adalah suhu, oksigen terlarut, CO2 bebas,

derajat keasaman (pH), alkalinitas, amoniak, nitrat, dan nitrit (Lukito dan

Prayugo, 2007).


6

2. Derajat keasaman (pH) dan kesadahan

Derajat keasaman (pH) air ini penting sebagai parameter kualitas air

karena dapat mengontrol tipe dan laju kecepatan reaksi zat di dalam air. Derajat

keasaman (pH) air yang baik untuk pertumbuhan lobster air tawar berkisar 6-9,5.

Jika angka pH kurang dari 5, akan berpengaruh buruk bagi pertumbuhan lobster

air tawar karena dapat menyebabkan kematian. Sementara pH>9 akan

menurunkan nafsu makan pada lobster air tawar sehingga pertumbuhannya

menjadi lambat (Lukito dan Prayugo, 2007).

pH air dan kehadiran karbon dioksida juga berkaitan erat dengan

alkalinitas. Pada pH kurang dari 5, alkalinitas dapat mencapai angka 0. Semakin

tinggi angka pH air, semakin tinggi pula nilai alkalinitas sedangkan kadar CO2

bebas semakin rendah. Nilai alkalinitas akan menurun jika terjadi pengendapan

padatan suspensi dari bahan organik sehingga mengakibatkan peningkatan

kandungan CO2 bebas (Lukito dan Prayugo, 2007).

Kesadahan merupakan salah satu parameter kualitas air yang diperlukan

bagi lobster air tawar. Kesadahan ini ditunjukkan dengan kandungan ion Ca2+

dan

Mg2+

serta ion logam polivalen lainnya. Kesadahan juga menggambarkan

kandungan garam-garam alkalinitas tanah. Perairan dengan nilai kesadahan

kurang dari 50 mg/l CaCO3 masuk dalam perairan tidak sadah (lunak). Air dengan

kesadahan tinggi (100-200 mg/l) lebih optimum untuk habitat lobster (Lukito dan

Prayugo, 2007).


7

3. Dissolve of oxygen (DO) dan suhu

Keberadaan oksigen di dalam air sangat dibutuhkan oleh organisme air.

Ketersediaan oksigen di dalam air dipengaruhi oleh suhu, tekanan udara dan

adanya tumbuhan air. Semakin tinggi suhu air akan menyebabkan kandungan

oksigen yang terlarut menjadi semakin sedikit. Semakin rendah tekanan udara

suatu lingkungan, kandungan oksigen di dalam air pun semakin rendah. Lobster

air tawar dapat hidup pada selang parameter air yang lebar, diketahui bahwa

lobster toleran terhadap kandungan oksigen terlarut sangat rendah. Lobster air

tawar memerlukan kadar oksigen terlarut lebih dari 4 ppm untuk dapat bertumbuh

dan berkembang (Lukito dan Prayugo, 2007).

Lobster air tawar memiliki sifat toleran terhadap suhu dingin bahkan

mendekati beku hingga suhu di atas 35°C. Pada kisaran suhu 20-30

°C, lobster air

tawar mampu bertahan hidup tetapi laju pertumbuhannya lambat. Sementara pada

suhu 23-25°C, pertumbuhannya menjadi lambat. Meskipun demikian, lobster air

tawar yang hidup di daerah tropis hendaknya dipelihara pada selang suhu

24-30°C(Lukito dan Prayugo, 2007).

4. Sedimen

Pada dasarnya sedimen dibagi menjadi dua bagian yaitu dasar dan

pematang tambak serta akumulasi sedimen (sludge yang terkumpul selama

pemeliharaan). Sedimen terakumulasi merupakan sisa pakan, feses, plankton yang

mati, dan erosi. Komponen dari sedimen ini harus dapat dikelola dengan baik

sehingga tidak menimbulkan residu bahan organik berlebih yang dapat

menimbulkan kerusakan lingkungan budidaya. Keberadaan bahan organik yang


8

berlebih dapat memicu terjadinya kondisi lingkungan yang anaerob (oksigen

rendah) sehingga terjadi penurunan mutu lingkungan yang pada akhirnya

berdampak pada respon pertumbuhan ternak yang rendah. Faktor-faktor yang

mempengaruhi kondisi prima suatu lingkungan budidaya salah satunya adalah

keberadaan pakan buatan dan implikasinya bagi media budidaya selama

pemeliharaan. Pakan merupakan masukan terbesar yang dapat mempengaruhi

akumulasi bahan organik di sedimen dan kualitas air tambak. Akumulasi sisa

pakan yang merupakan bahan organik akan menurunkan kualitas lingkungan

hidup ternak dengan menyumbang kandungan nitrogen dan fosfor sebagai sumber

polutan bagi ternak (Nur, 2011).

B. Lobster Air Tawar Crayfish (Cherax quadricarinatus)

Lobster air tawar crayfish atau sering disebut capit merah merupakan

spesies endemik kelompok udang yang hidup di perairan tawar kawasan

Queensland, Australia. Ciri-ciri morfologi lobster air tawar capit merah ini tubuh

berwarna hijau kemerahan dengan warna dasar bagian atas capit berupa garis

merah tajam, terutama pada induk jantan yang telah berumur lebih dari 7 bulan.

Lobster air tawar capit merah dapat hidup dan tumbuh pada suhu 21-37°C. Suhu

air optimum untuk hidup dan tumbuh lobster ini adalah 23-31°C. Sementara itu,

toleransi terhadap kandungan oksigen di dalam air adalah 1 ppm, pH keasaman

(6-9,5), dan amonia 1 ppm (Sukmajaya dan Suharjo, 2003).

Sistem pencernaan lobster air tawar capit merah terdiri dari mulut,

kerongkongan, lambung, usus, dan anus. Pakan yang masuk lobster akan

dihancurkan secara mekanik oleh gigi halus yang terletak di permukaan mulut.


9

Di dalam lambung, enzim pencernaan diekskresikan untuk memecah pakan

menjadi bentuk yang lebih sederhana. Sisa pencernaan akan diekskresikan melalui

anus (Lukito dan Prayugo, 2007).

Kebanyakan jenis lobster mengkonsumsi pakan dengan bantuan rangsang

kimia (kemoreseptor). Pada saat pakan diberikan, atraktan (asam amino) dari

pakan akan dilepas ke air dan dideteksi oleh kemoreseptor yang menyebar di

seluruh tubuh lobster sehingga lobster dapat mencapai pakan yang dituju (Nur,

2011).

Tabel I. Taksonomi lobster air tawar (Lukito dan Prayugo, 2007)

Kingdom Animalia

Filum Arthropoda

Kelas Malacostraca

Ordo Decapoda

Famili Parastacidae

Genus Cherax

Spesies Cherax quadricarinatus

C. Persiapan Pakan Lobster

1. Pakan lobster

Pakan merupakan salah satu faktor yang penting dalam masa pembesaran

karena pertumbuhan lobster sangat dipengaruhi oleh pakan, dengan pemberian

pakan yang benar diharapkan lobster dapat bertumbuh dan berkembang dengan

kualitas baik (Bachtiar, 2006).

Pakan merupakan nutrien esensial untuk proses pertumbuhan,

pemeliharaan dan penggantian jaringan yang telah rusak, pengaturan beberapa

fungsi tubuh, serta mempertahankan kondisi kesehatan. Salah satu prinsip

penerapan pakan dalam budidaya adalah program pemberian pakan secara efektif.


10

Hal ini memerlukan pengetahuan tentang kebutuhan nutrien dari ternak yang akan

dipelihara, kebiasaan dan tingkah laku makan, serta kemampuan kultivan dalam

mencerna dan menggunakan nutrien esensial. Pakan yang diberikan harus

mengandung nutrien yang dibutuhkan ternak seperti protein dan asam amino

esensial, lemak dan asam lemak, energi, vitamin, serta mineral (Nur, 2011).

Pengaturan jumlah pakan dilakukan sesuai dengan nafsu makan,

pertumbuhan, dan mortalitas ternak. Jika pakan diberikan terlalu sedikit dapat

mengakibatkan pertumbuhan menjadi lambat, bahkan memicu kanibalisme

terutama pada pemeliharaan ternak dengan kepadatan tinggi. Jika pemberian

pakan diberikan secara berlebih maka akan terjadi penumpukan sisa pakan yang

dapat menyebabkan penurunan mutu air. Seberapa besar jumlah pakan yang

dikonsumsi oleh ternak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : jenis pakan,

ukuran ternak, suhu air, cuaca, kualitas air, dan status kesehatan ternak itu sendiri.

Perhitungan jumlah pakan harian yang diberikan pada ternak adalah dengan

mengalikan total biomas ternak dengan prosentase pakan sesuai dengan berat

ternak seperti tercantum pada tabel II (Nur, 2011).

Tabel II. Prosentase pakan berdasarkan berat ternak (Nur, 2011)

Berat udang (g) Pakan tambahan Pakan lengkap

0-3 10%-4% 15%-8%

3-15 4%-2,5% 8%-4%

15-40 2,5%-2% 4%-2%

2. Tetrasiklin HCl

Tetrasiklin HCl (TCH) merupakan antibiotik yang dihasilkan oleh jamur

Streptomyces aureofasiens dan S. rimosus. Tetrasiklin HCl bersifat bakteriostatik

dengan daya jangkauan (spektrum) luas. Tetrasiklin HCl ini menghambat sintesis


11

protein dengancara mengikat sub unit 30 S pada ribosom sel bakteri sehingga

bakteri tidak dapat membentuk protein untuk berkembangbiak menjadi banyak

(Subronto dan Tjahjati, 2001).

Tetrasiklin HCl memiliki rumus molekul C22H24N2O8.HCl dengan berat

molekul 480,6 g/mol. Rumus struktur kimianya sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur tetrasiklin HCl (Anonim, 1995)

Organoleptis tetrasiklin HCl adalah serbuk hablur, kuning, tidak berbau,

agak higroskopis, stabil di udara tetapi pada pemaparan terhadap cahaya matahari

yang kuat dalam udara lembab menjadi berwarna gelap. Kelarutan tetrasiklin HCl

dalam air, alkali hidroksida dan dalam larutan karbonat sangat tinggi, sukar larut

dalam etanol, praktis tidak larut dalam kloroform dan eter. Tetrasiklin HCl

membentuk garam dengan ion Na+ dan Cl

- sehingga kelarutannya dalam air

meningkat (Anonim, 1995).

D. Mikroorganisme

Proses penanganan air limbah secara biologi terdiri dari campuran

mikroorganisme yang mampu memetabolisme limbah organik. Mikroorganisme

yang ditemukan dalam air dan air limbah digolongkan dalam 4 golongan yaitu,

virus, organisme prokarotik, organisme eukariotik, dan invertebrata sederhana

bersel jamak. Mikroorganisme golongan prokariotik ini menjadi perhatian khusus


12

dalam melihat kondisi air maupun penanganan air limbah. Bakteri merupakan

salah satu organisme prokariotik yang cukup penting dalam sistem penanganan air

limbah. Dua hal yang menjadi poin dalam air limbah yaitu bakteri patogen dan

bakteri yang dapat memetabolisme limbah. Pada umumnya bakteri menggunakan

bahan organik seperti protein sebagai sumber energi dan karbon dengan

merombak protein menjadi senyawa yang lebih sederhana. Beberapa spesies

bakteri mengoksidasi senyawa-senyawa anorganik seperti NH3 untuk energi dan

menggunakan CO2 sebagai sumber karbon (Jenie dan Rahayu, 1993).

Keragaman mikroba dalam lingkungan habitat air dan air limbah adalah

sebagai berikut :

Tabel III. Genus bakteri dalam lingkungan (Vaz-Moreira et al.,2014)

Lingkungan Genus

Habitat air dan

Air limbah

Acidovorax

Curvibacter

Sphingomonas

Aeromonas

Acinetobacter

Pseudomonas

Legionella

Rhodococcus

Cyanobacteria

Gordonia

Mycobacterium

Flavobacterium

Bacillus

Clostridium

Epsilonproteobacteria

Acidobacteria

Verrucomicrobia

Planctomycete

Chloroflexi

Gemmatimonadetes

Chlorobi

Nitrospirae

Spirochaetes

Chlamydiae

Aquificae

Thermotogae

Fusobacteria

Synergistetes

Tenericutes

Escherichia

Enterococcus

E. Protein

Protein merupakan makromolekul kompleks yang tersusun atas asam

amino berurutan, saling terikat secara kovalen melalui ikatan peptida. Sebanyak

20 asam amino yang menyusun bentuk protein memiliki sifat yang beragam

seperti hidrofobik, hidrofilik, asam, basa ataupun netral. Komposisi kimia asam

amino bertanggung jawab penting dalam menyumbang karakteristik dari protein


13

Seperti kereaktifan kimia, muatan ion dan hidrofobisitas. Pada pH rendah, protein

yang mengandung lisin maupun arginin akan bermuatan positif sedangkan pada

pH rendah kelompok protein yang mengandung aspartat, asam glutamat akan

bermuatan negatif. Berdasarkan polaritas dan muatannya, ada 8 asam amino

bersifat nonpolar dan hidrofobik, 5 diantaranya memiliki gugus hidrokarbon

alifatik (alanin, leusin, isoleusin, valin dan prolin), 2 asam amino memiliki cincin

aromatis (fenilalanin dan triptofan) dan 1 asam amino mengandung sulfur

(metionin). Asam amino non polar ini memiliki profil kelarutan dalam air yang

rendah, berbeda dengan asam amino bersifat polar seperti serin, treonin, tirosin,

asparagin dan glutamin, sistein serta glisin. Kelarutan asam amino polar di dalam

air sangat tinggi karena terjadinya interaksi asam amino dengan hidrogen dalam

air. Asam amino bermuatan negatif pada pH 6,0-7,0 mengandung kelompok

karboksil yang bersifat asam yaitu asam amino asam, asam aspartat dan asam

glutamat. Pada asam amino basa yang mengandung gugus bermuatan positif pada

pH 7,0 yaitu lisin, arginin, dan histidindengan tingkat kebasaan yang lemah. Pada

pH 6,0 lebih dari 50% histidin terprotonasi sedangkan pada pH 7,0 kurang dari

10% bermuatan positif (Rosenberg, 2005).

Protein memiliki sifat tergantung pada pH, maka untuk melakukan

analisis terhadap protein disarankan untuk memperhatikan pH larutan pada saat

proses analisis. Dalam melakukan kontrol pH, salah satunya dengan menggunakan

buffer atau larutan penyangga, yaitu suatu sistem larutan yang terbuat dari asam

maupun basa lemah dengan bentuk garamnya dalam medium air. Langkah isolasi

protein dapat dilakukan mulai dari pembuatan sifat protein yang larut dalam suatu


14

pelarut sehingga dapat dilakukan homogenisasi dalam suatu buffer dan pada

akhirnya dipisahkan dengan sentrifugasi (Dennison, 2003).

F. Coomasie Brilliant Blue (CBB)

Gambar 2. Struktur CBB R-250 (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011)

Pengukuran protein total merupakan jenis pengukuran dalam supernatan

melalui ekstraksi dan klarifikasi dengan sentrifugasi. Kekurangan dari pengukuran

protein total ini adalah variasi protein yang beragam. Metode pengukuran paling

akurat yaitu analisis protein dengan hidrolisis, mengubah susunan protein menjadi

asam amino yang lebih kecil sehingga dapat dihitung total asam amino. Analisis

terhadap protein harus bersifat cepat dan sensitif dan tergantung pada interaksi

reagen dengan protein (Ahmed, 2004).

CBB merupakan suatu metode pewarnaan senyawa protein berdasarkan

interaksi struktur CBBterhadap protein sehingga protein dapat terwarnai CBB R

merupakan golongan coomassie brilliant dye yang memiliki dasar warna merah

kecoklatan-biru. Pada analisis protein dengan jumlah kecil dapat dilakukan

dengan menggunakan sistem koloidal pada CBB R-250 dengan sensitivitas yang

tinggi (Glencross, Ahmed, dan Wang, 2011).

CBB sebagai metode deteksi protein ditemukan oleh Bradford dan

menjadi metode analisis kuantitatif yang cepat, mudah dan sensitif daripada


15

metode Lowry. Prinsip dari CBB ini mengadakan interaksi dengan struktur

protein. Bentuk muatan positif dari CBB ini akan terjadi lebih banyak dalam

kondisi asam dan dapat dideteksi pada panjang gelombang maksimal 470 nm.

Sebaliknya, dalam kondisi netral, CBB akan dominan dalam bentuk anion

(bermuatan negatif) dan akan mengadakan interaksi dengan struktur protein

sehingga dapat dideteksi (Kruger, 1994).

Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB (Georgiou et al., 2008)

CBB mengandung gugus sulfonat yang akan bereaksi dengan rantai

samping struktur protein yaitu arginine, lysine, dan histidine. Interaksi yang

terjadi mengakibatkan warna dari CBB tereduksi (memudar). Ikatan yang terjadi

antara protein dengan dye adalah ikatan ionik, elektrostatik, dan van der Waals.

Ikatan van der Waals merupakan ikatan yang paling dominan terjadi dalam

pewarnaan (Otlets, 2005).

G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif

Spektrofotometri sinar tampak merupakan metode pengukuran panjang

gelombang dan intensitas sinar tampak (visible) yang diabsorbsi oleh suatu zat.

Sinar tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada

kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi pada rentang panjang gelombang

400-800 nm dan dideteksi dalam bentuk absorbansi (Dachriyanus, 2004).


16

Metode spektrofotometri derivatif atau metode kurva turunan adalah

salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis multikomponen secara

langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan

panjang gelombang yang berdekatan. Keuntungan dari metode spektrofotometri

derivatif adalah spektrum derivatif yang memungkinkan menganalisis

multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih.

Spektrum derivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum

serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif

keempat sehingga dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam

campuran dengan bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan

(Nurhidayati, 2007).

H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu

metode analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari

komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam

dan liquid sebagai fase gerak (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010).

Sistem HPLC dimulai dari sampel dimasukan ke dalam tempat injeksi

yang menuju ke kolom kromatografi. Fase gerak menuju kolom dengan bantuan

pompa, zat-zat terlarut akan terpisah karena adanya interaksi yang bebeda antara

komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam di dalam kolom. Zat-

zat terlarut yang sudah terpisah akan meninggalkan kolom dan terdeteksi oleh

detektor. Hasil yang diperoleh dari proses tersebut adalah kromatogram yang


17

terdiri dari signal detektor dan waktu. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa

campuran pelarut sehingga memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan.

Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel (Snyder et al., 2010).

Fase gerak yang digunakan pada HPLC fase terbalik (HPLC-RP) adalah

fase gerak yang bersifat polar, contohnya campuran larutan buffer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril atau campuran metanol dengan asetonitril

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu

polaritas, kelarutan analit, stabilitas, pH dan kompatibilitas antar pelarut. Selain

itu, fase gerak dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila

terdiri dari campuran beberapa pelarut (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan

komponen-komponen sampel yang terdapat di dalamnya. Oktadesilsilan (C18)

dan oktil silica (C8) merupakan fase diam yag paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi

(Gandjar dan Rohman, 2007).

I. Validasi Metode Analisis

Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu

pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2006). Validasi

metode analisis merupakan prosedur yang digunakan untuk menunjukan bahwa


18

metode analisis yang digunakan untuk kuantifikasi analit dalam matriks bersifat

reliable dan reprodusibel untuk mencapai tujuannya (Chan, Lam, Lee, dan Zhang,

2004).

1. Akurasi

Akurasi adalah suatu prosedur analisis untuk melihat kedekatan antara

nilai terukur atau nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran dengan nilai

sebenarnya (Ermer dan Miller, 2005). Akurasi dinyatakan sebagai persen

perolehan kembali yang ditentukan dengan melakukan spiking ataupun dengan

cara metode penambahan baku (standard addition method) (Gandjar dan Rohman,

2007). Dalam bioanalisis, nilai akurasi dapat dinyatakan dalam % Difference

(%D) yaitu perbandingan antara selisih nilai konsentrasi awal dan terukur dengan

nilai konsentrasi awal. Kriteria terpenuhi jika %D dibawah 20% (Anonim, 2013).

2. Presisi

Presisi adalah prosedur analisis untuk melihat derajat kesesuaian hasil uji

individual dari beberapa penginjeksian suatu seri baku. Presisi diukur sebagai

persen Relative Standard Deviation (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai

RSD yang diperbolehkan adalah kurang dari 20% (Anonim, 2013).

3. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Suatu metode dikatakan memiliki


19

linieritas yang baik jika nilai koefisien korelasri (r) > 0,99 atau r2

>0,997 (Chan et

al., 2004). Pada sumber lain mengatakan bahwa nilai koefisien korelasi (r2) yang

baik adalah lebih tinggi dari 0,995 (Anonim, 2013).

4. Selektivitas

Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur

dan membedakan dengan akurat respon analit dengan seluruh komponen sampel

yag mungkin ada dalam matriks sampel (Chan et a.l, 2004).

5. Kriteria validasi

Kriteria validasi untuk bioanalisis meliputi akurasi, presisi, LOQ, dan

linearitas serta pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi (Anonim, 2013).

J. Landasan Teori

Lobster air tawar merupakan golongan Crustaceae yang hidup di air

tawar dan kemampuannya untuk bertahan hidup lebih besar daripada udang air

payau maupun air laut. Ketersediaan protein dan kondisi habitat lobster sangat

mempengaruhi pertumbuhan lobster. Salah satu masalah dalam budidaya lobster

adalah penurunan produktivitas lobster karena penyakit oleh mikroba patogen

seperti Vibrio spp. Penggunaan antibiotik dalam pakan lobster dilakukan untuk

mencegah perkembangan mikroba patogen yang menyebabkan penyakit sehingga

kelangsungan hidup lobster lebih panjang tetapi terjadi kasus akumulasi antibiotik

dalam tubuh lobster seperti kloramfenikol.


20

Selain mikroba patogen, yang tumbuh dalam media air adalah mikroba

normal air. Keberadaan mikroba normal air berkontribusi baik dalam penanganan

limbah atau penumpukkan bahan organik dalam air sehingga kualitas air terjaga.

Tetrasiklin merupakan senyawa antimikroba dengan spektrum luas, yaitu dapat

menghambat pertumbuhan beragam jenis mikroba yang ada di alam, baik mikroba

patogen maupun mikroba normal air.Jumlah mikroba normal maupun patogen

ditentukan dengan melihat populasi mikroba dalam air.

Mikroba dapat merombak bahan organik seperti protein menjadi senyawa

lebih sederhana. Penambahan populasi mikroba akan menanggulangi bahan

organik yang ada di habitat lobster sehingga kualitas air terjaga. Analisis

kandungan protein dilakukan dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar

tampak derivatif. Metode CBB ini menggunakan reagen coomassie brilliant blue

dengan mekanisme pembentukkan warna terhadap protein primer. Protein akan

berinteraksi dengan reagen sehingga larutan protein menjadi berwarna, hal ini

menunjukkan banyaknya ikatan peptida yang terjadi. Metode spektrofotometri

sinar tampak ini digunakan untuk melihat absorbansi kompleks protein berwarna

dengan interval panjang gelombang cahaya visible (400-800 nm).

Adanya kandungan antibiotik seperti tetrasiklin dalam akuakultur dapat

menyebabkan akumulasi dalam tubuh lobster. Untuk melihat pengaruh tersebut

dilakukan analisis jumlah tetrasiklin dalam daging lobster dengan menggunakan

High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Validasi yang dilakukan

meliputi pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi, linearitas, akurasi dan


21

presisi serta sensitivitas. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik padajumlah

populasi mikroba air,kadar protein sedimen, laju pertumbuhan lobster, dan adanya

kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging dilakukan perbandingan antara

perlakuan dan kontrol yang diplotkan dalam grafik versus hari perlakuan.

K. Hipotesis

1. Pakan berantibiotik menyebabkan penurunan jumlah populasi mikroba dalam

habitat air lobster air tawar.

2. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan kadar protein dalam sedimen

lobster air tawar.

3. Pakan berantibiotik menyebabkan peningkatan laju pertumbuhan lobster air

tawar.

4. Terjadi akumulasi tetrasiklin dalam daging lobster.


22

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada

Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan

Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya

Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)”

merupakan penelitian eksperimental murni dengan membandingkan kurva

hubungan lama perlakuan dengan respon antara kelompok kontrol dan perlakuan

untuk melihat pengaruh yang disebabkan oleh tetrasiklin dalam pakan terhadap

kualitas habitat dan laju pertumbuhan lobster air tawar.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel utama

1) Variabel bebas : lama pemberian pakan berantibiotik

2) Variabel tergantung : jumlah populasi mikroba dalam air, jumlah

protein dalam sedimen, panjang lobster, berat lobster dan jumlah TCH

dalam daging lobster

b. Variabel pengacau

1) Variabel terkendali : volume air, cahaya matahari, kandungan klor,

kesadahan air, pH air dan oksigen terlarut dalam air.

2) Variabel tidak terkendali : lobster mati.


23

2. Definisi Operasional

a. Pakan berantibiotik merupakan pakan lobster yang telah dimodifikasi

dengan menambahkan tetrasiklin HCl ke dalam sediaan pakan.

b. Lobster air tawarcrayfish (Cherax quadricarinatus) merupakan hewan

golongan Crustaceae yang hidup di perairan tawar dan dalam penelitian

digunakan sebagai hewan uji dengan kriteria yang ditentukan.

c. Rumah lobster merupakan pipa yang disusun dan diikat berjajar dan

digunakan sebagai tempat perlindungan untuk lobster, dibuat dari pipa

dengan panjang 6 cm dan diameter 2,5 cm sebanyak 8 pipa..

d. Aerasi merupakan sistem sirkulasi udara dari luar ke dalam air dengan

bantuan alat pompa elektrik dan selang.

e. Budidaya permodelan merupakan metode budidaya lobster dengan

merekayasa pembiakan yaitu memberikan sedimen dan rumah lobster serta

aerasi yang cukup sebagai tempat hidup lobster.

f. Sedimen merupakan suatu masa padat yang berasal dari sisa pakan

maupun hasil ekskresi dari lobster air tawar crayfish yang mengendap di

dasar akuarium.

g. Kelompok kontrol merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan

pakan tanpa antibiotik.

h. Kelompok perlakuan merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan

pakan berantibiotik.


24

i. Panjang dan berat lobster merupakan parameter yang diukur pertumbuhan

lobster, diukur dari kepala hingga ekor (panjang).

j. Populasi mikroba merupakan jumlah koloni mikroba yang ditentukan

dalam satuan cfu/cm2.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sedimen lobster air

tawar, pakan lobster merek Bintang®

, standar tetrasiklinHCl (kualitas p.a, China),

antibiotik tetrasiklin HCl merek Tetrasanbe®

, lobster air tawar jenis crayfish

(Cherax quadricarinatus), air sumur dengan kriteria (kesadahan 53 ppm, oksigen

terlarut 7-8 ppm, suhu 25,5°C, pH 6), reagen coomasie brilliant blue R-250

(kualitas p.a, Germany), phosphate buffer saline (PBS) pH 7 (NaCl, KCl,

Na2HPO4, dan K2HPO4), metanol (grade HPLC), etanol (kualitas p.a), akuabides,

NaOH (kualitas p.a), HCl (kualitas p.a), standar bouvine serum albumine (kualitas

p.a, Germany), daging lobster air tawar jenis crayfish, buffer McIlvainepH 4 (7,71

ml larutan Na2HPO4 0,2 N dalam 12,29 ml asam sitrat0,1 N), asetonitril (grade

HPLC).

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium (panjang 60

cm, lebar 30 cm dan tinggi 50 cm), kincir air atau aerator merek Amara®

, fan, DO

meter (pengukur dissolve oxygen), rumah lobster (pipa bertingkat), spuit, alat-alat

gelas (Pyrex, Germany), mistar merek Ziegel®

, timbangan analitik merek

OHAUS®

(e=1 mg), batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume, micropipette,


25

macropipette, flakon, pompa vacuum, corong Buchner, labu hisap, pH stick

universal, cawan porselen, stamper, mortir, kertas saring, oven, vortex, centrifuge,

milipore, degasser, spectrophotometer Visible SHIMADZU (UV-1800), rotary

evaporator, High Performance Liquid Chromatography merek SHIMADZU

(kolom C18).

E. Tata Cara Penelitian

1. Tahap preparasi lobster dan habitat

a. Persiapan alat dan bahan

Sebanyak 12 buah akuarium (60 x 30 x 50 cm) disiapkan dalam tempat

terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus

didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia

3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari

peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta.

b. Determinasi lobster

Lobster air tawar yang digunakan sebagai hewan uji dideterminasi oleh

Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta dengan menggunakan sumber determinasi berjudul

Cherax quadricarinatus oleh Jones dan Wingfield, The Freshwater and

Land Crayfishes of Australia oleh Clark dan The Australian Freshwater

Crayfish (Crustaceae:Decapoda:Parasticidae) with Descriptions of New

Species oleh Riek.


26

c. Preparasi habitat lobster

Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100

gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10

cm dari dasar akuarium(setara 14 liter). Rumah lobster dan aerator

dimasukkan dalam akuarium (1 rumah dan aerator/akuarium). Lobster air

tawar dimasukkan dalam akuarium (15 ekor/akuarium). Media ini

selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.

2. Tahap preparasi pakan lobster

a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl (TCH) dalam kapsul Tetrasanbe®

1) Pembuatan stok standar TCH 1 mg/ml

Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam

labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda.

2) Validasi metode

Pembuatan seri baku TCH 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; dan

0,5 mg/ml.. Larutan stok standar TCH 1 mg/ml dibuat seri, diambil

1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,0 ml dimasukkan dalam labu

takar 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. Lalu

dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400

nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel dan dibuat persamaan

regresi linear dan nilai r (linearitas). Selain itu dilakukan penetapan

akurasi dengan melihat %D, sensitivitas LOD dan LOQ, serta presisi

didapat dari sampel yang direplikasi 3 kali lalu dicari %RSD.


27

3) Preparasi sampel kapsul

Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan

serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam

mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan

dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas

tanda.

4) Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv

Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit.

Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap

spektrofotometri uv. Sampel dideteksi absorbansi dengan

spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi

3 kali pada sampel.

b. Optimasi dosis TCH

Sebanyak 4 akuarium kosong (A, B, C, D) disiapkan. Sedimen sebagai

habitat awal lobster ditimbang masing-masing sebanyak 100 gram.

Sedimen dimasukkan dalam akuarium dan diberi air yang telah

disesuaikan dengan luas akuarium setinggi 10 cm dari dasar akuarium

(setara dengan 14 liter), kemudian diaduk hingga homogen. Kincir air

(aerator) dimasukkan ke dalam akuarium dan diaktifkan. TCH sebanyak

2,25 gram; 4,5 gram; dan 9 gram dimasukkan ke dalam akuarium B, C,

dan D secara berurutan, ditunggu selama 1 hari. Setelah 1 hari dilakukan

sampling pada pukul 06.00 WIB dan dilakukan pengecekan jumlah


28

populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan

Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu).

c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik

1) Pembuatan pakan berantibiotik

Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15

gram maka diberikan adalah 8-4%. Sesuai dengan berat lobster,

digunakan prosentase sebesar 4% sehingga jumlah pakan lobster

diberikan sebanyak 1,8 gram/hari. Selanjutnya jumlah pakan ini

digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak

0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides

sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster

dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah

penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering

(± 3jam) dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya.

2) Frekuensi pemberian pakan

Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari

yaitu pada pagi hari 0,45 gram (25%), sore hari 0,45 gram (25%) dan

malam hari 0,9 gram (50%).

3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan

a. Pembuatan kelompok kontrol

Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari)

dan 5 akuarium perlakuan pemberian pakan biasa (tanpa tetrasiklin)


29

dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari.

Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan

25% pada pagi dan sore serta 50% pada malam hari.

b. Pembuatan kelompok perlakuan

Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko (0 hari)

dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3

hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik

dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25% pada pagi dan

sore serta 50% pada malam hari.

4. Tahap preparasi analit

a. Ekstraksi protein dalam sedimen

Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Mayer,

Schick, dan Setchell (1986). Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2

gram dan dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan NaOH 0,1 N

sebanyak 6 ml. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu

selama 2 jam (OT) pada suhu 60oC di dalam oven. Setelah OT, campuran

disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak

4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N hingga pH 7-8, lalu

dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas.

Sampel ini selanjutnya dideteksi absorbansinya dengan menggunakan

metode CBB dan spektrofotometer sinar tampak derivatif.


30

b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster

1) Preparasi sampel ekstrak daging

Lobster pada perlakuan hari ke 14 (13,12 gram) dan 28 (9,02 gram)

diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit

lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang.

Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides

dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan

disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari.

2) Ekstraksi tetrasiklin

Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge

3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml

dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml

buffer McIlvaine; 1 ml NaOH (pH 4) kemudian divortex dan

dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya (2 jam). Hasil

evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer

McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi

untuk deteksi dengan metode HPLC.

5. Tahap persiapan metode penetapan kadar

a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen

Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode

CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan

oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini.


31

b. Metode penetapan kadar tetrasiklin

1) Orientasi panjang gelombang tetrasiklin

Standar tetrasiklin HCl (TCH) ditimbang sebanyak 50 mg dan

dilarutkan dalam HCl : akuabides (1:1) ditambahkan hingga tanda

batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml

diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan

dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri

uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm.

2) Penentuan puncak tetrasiklin

a) Pembuatan larutan blangko

Larutan HCl : akuabides (1:1) disiapkan sebanyak 5 ml, diambil

0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan

sampel.

b) Pembuatan larutan standar TCH

Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine

disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC.

c) Pembuatan larutan standarTC

Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan

diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi

dengan menggunakan HPLC.

3) Optimasi fase gerak HPLC

a) Kondisi HPLC


32

(1) Fase diam : kolom C18 (oktadesil silika)

(2) Detektor : uv-sinar tampak

(3) Fase gerak :

(a) Asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4) 50:50%

(b) Metahol : buffer McIlvaine (pH 4; asam sitrat dan

natrium bifosfat) 50:50%

(4) Panjang gelombang : 270 nm (hasil orientasi)

(5) Flow rate : 0,5 ml/menit

b) Pembuatan fase gerak

(1) Pembuatan metanol : buffer McIlvaine (pH 4)

Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi

fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine

dengan perbandingan 50:50% v/v. Metanol dan buffer

McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring

menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut

dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam

chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing

menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.

(2) Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine (pH 4)

Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi

fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine

dengan perbandingan 50:50% v/v. Asetonitril dan buffer


33

McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring

menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut

dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam

chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing

menggunakan ultrasonikator selama 15 menit.

c) Persiapan instrumen HPLC

Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol (HPLC

grade) selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan

fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap

digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam

tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan

waktu elusi 13 menit.

6. Tahap validasi metode penetapan kadar

a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif

1) Linearitas

a) Pembuatan stok albumin (BSA) 40 mg/ml

Sebanyak 2 gram albumin (BSA) dimasukkan dalam labu takar

50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas.

b) Pembuatan seri baku albumin (BSA)

Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl

dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS


34

hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00;

2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mg/ml.

c) Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif

Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam

labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda

batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum

dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400-

800 nm.

d) Pembuatan kurva baku solven

Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan

derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum

derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi

liniernya.

2) Pembuatan kurva adisi

Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam

flakon (A, B, C, D, E, F) ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan

90 mg dalam flakon (B, C, D, E, F) secara berurutan. Kemudian

dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu

dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan

spektrofotometri sinar tampak derivatif.


35

3) Akurasi

Akurasi dinyatakan dalam bentuk %D dari kurva adisi. Nilai %D

yang baik adalah kurang dari 20%

4) Presisi

Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali

dan dihitung %RSD. Nilai %RSD yang baik adalah kurang dari 20%

5) Limit Of Quantification (LOQ)

LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus :

LOQ = 3,3 x SD/slope

b. Validasi metode HPLC

1) Linearitas

a) Pembuatan stok tetrasiklinHCl (TCH) 500 ppm

Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan

ditambahkan HCl : akuabides (1:1) hingga tanda batas.

b) Pembuatan seri TC

Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120

ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200

µl dari stok TCH (500 ppm) dimasukkan dalam labu takar 5 ml

ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku

diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu

takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas.


36

c) Analisis dengan HPLC

Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek

dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi.

d) Pembuatan kurva baku solven

Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku

diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya

y = bx+a.

2) Pembuatan kurva adisi

a) Pembuatan seri TC

Daging lobster bebas tetrasiklin dihaluskan dengan

menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing-

masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E.

Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm

dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides (1:1)

ditambahkan sebanyak 4980 (A), 4900 (B), 4700(C), 4300(D),

4000(E) µl dengan micropipette ke dalam flakon.

b) Analisis tetrasiklindengan HPLC

Masing-masing seri baku (A,B,C,D,E) dalam flakon divortex

selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan

sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel

A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon

lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar


37

5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring

dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke

HPLC.

c) Pembuatan kurva adisi

Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi

diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya

y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven.

3) Akurasi

Akurasi didapatkan dari perhitungan %D kurva adisi.

4) Presisi

Presisi didapat dari perhitungan %RSD 3 replikasi kurva adisi.

5) Selektivitas

Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva

adisi.

6) Limit Of Quantification (LOQ)

LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus :

LOQ = 3,3 x SD/slope

7. Analisis sampel

a. Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air

1) Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan

a) Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam

akuarium diaduk hingga homogen dan ditunggu selama 5 menit


38

hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan

pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan

spuit yang telah dimodifikasi (100 ml), dimasukkan dalam botol

steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai

Kesehatan Yogyakarta.

b) Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian

Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan

menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan

colony counter.

b. Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen

1) Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N

NaOH (kualitas p.a) ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan

akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl (kualitas

p.a) diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar

10 ml hingga batas tanda.

2) Preparasi phosphate buffer saline(PBS)

Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na2HPO4, dan

0,12 gram KH2PO4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar

500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas.

3) Preparasi reagen coomasie brilliant blue

Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS

dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A


39

dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan

3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas.

4) Preparasi protein dalam sedimen

Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya,

dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan

corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering

dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga

homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam

flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan

menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga

homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 600C, ditunggu

selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge

dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan

diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8

kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS

hingga tanda batas.

5) Analisis kuantitatif protein

Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa

ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline

terhadap spektrofotometer sinar tampak. Sampel dalam labu takar

diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen

CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan


40

dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit,

campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan

spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra

yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan

pengukuran tinggi puncak derivat.

c. Pengukuran panjang dan berat lobster

Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang

berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan

timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung

kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai

slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan

berat lobster hari ke 0.

d. Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster

Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge

3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil 0,5 ml dimasukkan

dalam flakon lalu ditambahkan asetonitril sebanyak 1,5 ml kemudian

ditambahkan 1,5 ml buffer McIlvaine (pH 4). pH campuran dinaikkan

dengan menggunakan NaOH 2,5 N sebanyak 1 ml lalu ditambahkan

asetonitril 1,5 ml. Campuran dievaporasi dengan rotary evaporator

dengan suhu 40oC selama 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu

takar 5 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas, lalu disaring dengan


41

milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam

vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.

F. Analisis Hasil

1. Validasi metode spektrofotometri uv

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh

dari absorbansi tetrasiklin HCl dari data penentuan kurva baku dalam

regresi linear.

b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

%D = (C terhitung – C diketahui) / C terhitung x 100%

c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :

%RSD = SD / rata-rata x 100%

d. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD

dicari dengan rumus 3,3 x SD/slope dan LOQ dengan 10 x SD/slope.

2. Validasi metodespektrofotometri sinar tampak derivatif

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh

dari tinggi derivat spektrum protein (BSA) dari data penentuan kurva baku

dalam regresi linear.


% D = [C diketahui – C terhitung] / C diketahui x 100%


%RSD = SD / rata-rata x 100%


42

d. Sensitivitas. Sensitivitas dapat dicari dengan menghitung LOQ

(konsentrasi terkecil kurva adisi yang masih bisa terkuantifikasi baik).

3. Validasi metode HPLC

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang

diperoleh dari data AUC penentuan kurva baku ke dalam regresi linear.


%D = [C diketahui-C terhitung] / C diketahui x 100%.


%RSD = SD / rata-rata x 100%.

d. Sensitivitas. Sensitivitas dicari dengan menghitung LOQ (konsentrasi

terkecil pada kurva adisi yang masih dapat terkuantifikasi baik).

4. Analisis jumlah populasi mikroba air

a. Evaluasi hasil. Hasil uji jumlah populasi mikroba (cfu/cm2) dikelurkan

oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Evaluasi

hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus log jumlah

populasi mikroba kelompok kontrol dan log jumlah populasi mikroba

kelompok perlakuan. Kurva kelompok kontrol dan perlakuan

dibandingkan.


43

5. Analisis protein dengan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampak

derivatif

a. Hitung kadar protein. Kadar protein dihitung dengan memasukkan respon

tinggi derivat dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan

faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi dalam gram sedimen.

b. Evaluasi hasil. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari

perlakuan versus selisih kadar protein kelompok (kontrol dan perlakuan)

dan kadar protein hari ke 0. Slope dari kurva kelompok kontrol dan

perlakuan dicari dan dibandingkan.

6. Penentuan panjang dan berat lobster (pertumbuhan lobster)

a. Panjang lobster. Data panjang lobster diolah dengan membandingkan

slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok

(kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan

perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari

dan dilakukan perbandingan.

No Hari

Jumlah populasi

mikroba Kontrol (K)

Jumlah populasi

mikroba Perlakuan (P)

cfu/cm2 cfu/cm

2

1 0

2 3

3 5

4 7

5 14

6 28


44

b. Berat lobster. Data berat lobster diolah dengan membandingkan slope

kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok

(kontrol dan perlakuan) dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan

perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari

dan dilakukan perbandingan.

7. Penetapan kadar tetrasiklin dalam daging

Kadar tetrasiklin dihitung dengan memasukkan respon AUC dalam

persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran

sehingga didapatkan konsentrasi awal dalam daging.

No Hari

Panjang Lobster

Kontrol (K)

Panjang Lobster

Perlakuan (P)

Selisih Dengan

Hari ke 0

Cm Cm K P

1 0

2 3

3 5

4 7

5 14

6 28

No Hari

Berat Lobster

Kontrol (K)

Berat Lobster

Perlakuan (P)

Selisih Dengan

Hari ke 0

Gram Gram K P

1 0

2 3

3 5

4 7

5 14

6 28


45

G. Rancangan Penelitian


46

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh

tetrasiklin (antibiotik) dalam pakan terhadap perkembangan lobster air tawar

dalam habitat hidup lobster dibandingkan dengan kontrol dalam jangka waktu

tertentu. Ada empat parameter yang diteliti dalam penelitian ini, meliputi jumlah

populasi mikroba dalam air, kandungan protein dalam sedimen, panjang dan berat

lobster serta penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster sebagai indikator

adanya akumulasi. Penelitian ini diawali dengan persiapan habitat dan pakan serta

pembagian kelompok lobster.

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar

Dalam penelitian ini digunakanbudidaya permodelan yaitu dengan

melakukan modifikasi terhadap model pembiakan semi intensif, meliputi

pemberian sedimen dalam habitat, pemberian perlindungan (rumah lobster) dan

tidak ada penggantian air selama perlakuan. Alat dan bahan yang dibutuhkan

untuk persiapan habitat adalah sedimen, air, rumah lobster, dan aerator. Sedimen

berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi lobster air tawar crayfish yang

mengendap sehingga habitat yang dibuat menyerupai habitat di alam. Dalam

pemeliharan lobster air tawar crayfish ini diperlukan media yang layak untuk

tumbuh kembangnya, seperti kesadahan, ketersediaan oksigen, derajat keasaman,

suhu dan kandungan kimia dalam air. Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster

air tawar crayfish dapat hidup dalam air dengan kondisi kesadahan 50 mg/L


47

CaCO3, kadar oksigen terlarut air sumur >4 ppm, suhuberkisar antara 25-29

°C

dan derajat keasamaan berkisar antara 6-9,5. Air yang digunakan dalam budidaya

lobster air tawar crayfish ini merupakan air sumur yang sudah memenuhi kriteria

kualitas air sehingga selanjutnya digunakan sebagai media pemeliharan selama

perlakuan. Tindakan kontrol terhadap kondisi air tetap dilakukan seperti aerasi

dan pencegahan paparan sinar matahari dengan tujuan menjaga ketersediaan

oksigen dalam media pemeliharaan selama proses perlakuan dan mencegah

rusaknya struktur tetrasiklin akibat sinar matahari. Lobster yang digunakan

dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas

Gadjah Mada dan dinyatakan sebagai lobster air tawar jenis crayfish (Cherax

quadricarinatus).

B. Tahap Persiapan Pakan Lobster

Pakan yang digunakan merupakan pakan jadi dengan penambahan

senyawa tetrasiklin HCl sebagai pencegah penyakit pada lobster. Tetrasiklin HCl

yang digunakan adalah tetrasiklin dengan kualitas teknis sehingga perlu dilakukan

penetapan kadar tetrasiklin HCl terlebih dahulu agar diketahui kadarnya. Selain

itu, untuk mendapatkan daya penghambatan pertumbuhan mikroba yang optimal,

maka dilakukan optimasi terhadap dosis tetrasiklin HCl yang digunakan.

1. Validasi dan analisis kadartetrasiklinHCl (TCH) dalam sediaan kapsul

Penetapan kadar TCH dalam kapsul dilakukandengan menggunakan

metode spektrofotometri uv. Sebelum dilakukan penetapan kadar TCH maka perlu

dilakukan validasi terhadap metode yang digunakan meliputi linearitas, akurasi,


48

presisi, LOD dan LOQ. Berdasarkan ketentuan FDA (2013), metode penetapan

kadar senyawa tunggal yang baik memiliki kriteria linearitas (r2>0,995), akurasi

(%D <20%), dan presisi (%RSD <20%). Sesuai tabel hasil validasi metode

penetapan kadar senyawa tunggal TCH dalam sampel kapsul, metode ini

memenuhi kriteria.

Tabel IV. Hasil validasi penetapan kadar TCH dalam kapsul

Parameter Hasil

Linearitas 0,15-0,5 mg/ml, r

2 =0,9953,

y = 1,5176x + 0,0668

Akurasi (%D) 0,6326%

Presisi (%RSD) 6,2821%

LOD 0,0321 mg/ml

LOQ 0,0972 mg/ml

Analisis kadar TCH dalam kapsul dilakukan dengan menggunakan

spektrofotometri uv pada panjang gelombang maksimum 276 nm. Kadar TCH

yang didapat adalah sebesar 94,1357% b/b. Farmakope Indonesia (1995)

menyatakan bahwa kadar TCH dalam kapsul yang dapat diterima adalah kadar

dalam interval 90-125%, maka kapsul TCH dapat digunakan untuk perlakuan

dalam penelitian ini.

2. Optimasi dosis TCH

Dosis TCH yang digunakan untuk perlakuan sebesar 4,5 g/kg pakan

kering (Johnson, 2010) dan dilakukan optimasi dosis TCH sebesar 2,25 g/kg; 4,5

g/kg; dan 9,0 g/kg pakan. Dosis yang paling efektif yaitu dosis yang memberikan

jumlah populasi mikroba paling kecil, ditetapkan dengan melihat jumlah koloni

mikroba yang tumbuh (cfu/cm2) dalam air habitat lobster yang diberi perlakuan

antibiotik. Antibiotik merupakan senyawa kimia yang memiliki aktivitas


49

menghambat pertumbuhan mikroba sehingga dengan melihat jumlah populasi

mikroba dalam air, dapat ditentukan dosis antibiotik yang menghambat

pertumbuhan mikroba paling efektif.

Tabel V. Jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis TCH

Perlakuan Jumlah populasi mikroba (cfu/cm2)

Tanpa tetrasiklin 2,4 x 103

2,25 g/kg 4,8 x 105

4,5 g/kg 25

9,0 g/kg 2,3 x 103

Sesuai dengan hasil jumlah populasi mikroba pada sampel air, dipilih

dosis TCH paling efektif adalah 4,5 g/kg pakan dengan jumlah populasi mikroba

paling kecil yaitu 25 cfu/cm2.

3. Pembuatan dan pemberian perlakuan pakan antibiotik

Pembuatan pakan dan sistem pemberiannya ditentukan sesuai dengan

jumlah lobster dan cara lobster mencerna makanan yang diberikan. Lobster

crayfish ini merupakan hewan nocturnal yaitu bersifat aktif pada malam hari

sehingga pemilihan waktu pemberian porsi pakan lebih besar pada malam hari

(Lukito dan Prayugo, 2007). Pembuatan pakan berantibiotik ini dilakukan dalam

interval 5 hari sekali untuk 5 akuarium dengan tujuan menstabilkan efektivitas

antibiotik dalam pakan lobster, karena pembuatan pakan lebih dari 5 hari terjadi

pertumbuhan jamur pada pakan. Pemberian pakan berantibiotik pada lobster

dilakukan selama 1 bulan (28 hari) pada 6 akuarium yang berbeda yaitu 1

akuarium sebelum perlakuan (hari ke 0) dan 5 akuarium perlakuan selama 3, 5, 7,

14, dan 28 hari. Sebagai pembanding, 6 akuarium untuk kelompok kontrol (pakan

tanpa antibiotik) yaitu 1 akuarium (hari ke 0) dan 5 akuarium diberi pakan tanpa


50

antibiotik selama 3, 5, 7, 14, dan 28 hari. Sampling dilakukan dengan mengambil

sampel air, sedimen dan lobster yaitu pada hari setelah jangka waktu perlakuan

pada pukul 06.00 WIB agar kondisi saat sampling sama.

C. Tahap Ekstraksi Protein

Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan

metode pewarnaan yaitu metode coomassie brilliant blue R (CBB R) dan

dideteksi dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Protein

dalam penelitian ini berada dalam matriks sedimen sehingga perlu dilakukan

preparasi sampel supaya protein dapat keluar dari matriks sedimen dan terbentuk

struktur protein yang lebih sederhana sehingga dapat dideteksi dengan

menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak deriatif.

Protein dalam sedimen ini diekstraksi dengan menggunakan basa yaitu

NaOH dengan cara merusak matriks sedimen dan melepas protein ke dalam air.

Selain itu, basa juga mengakibatkan denaturasi protein menjadi senyawa lebih

sederhana. Sebagian besar protein di alam memiliki struktur tersier bahkan

quarterner. Struktur tersier ini terbentuk akibat adanya interaksi antar asam amino

di rantai polipeptida. Adanya proses denaturasi (gambar 4) mengakibatkan

interaksi-interaksi gugus yang membentuk struktur tersier menjadi lemah

sehingga kemungkinan untuk terputus sangat besar dan pembentukan protein

struktur primer dapat terjadi (Campbell, Reece, Mitchell, 2002).


51

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi (Campbellet al., 2002)

D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif

Menurut Harmita (2006), validasi merupakan suatu tindakan penilaian

terhadap parameter tertentu dalam prosedur penetapan, yang digunakan untuk

membuktikan bahwa parameter yang dipilih sudah memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya. Suatu validasi terhadap metode dapat dilakukan dengan melihat

aspek akurasi, presisi, linearitas dan sensitivitas yang menunjukkan suatu metode

menghasilkan parameter atau data yang valid dan dapat dipertanggung jawabkan.

Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan

metode CBB dan spektrofotometri sinar tampakini divalidasi terkait linearitas

yaitu dengan pembuatan kurva baku dan persamaan regresi linear. Linearitas

menunjukkan respon atau parameter yang didapat sudah sesuai jika nilai koefisien

korelasi (r) mendekati angka satu. Pada metode penetapan kadar protein ini

didapatkan persamaan regresi y = 0,0589x + 0,1018 dan R² = 0,9709.

Pada penelitian ini dilakukan juga pembuatan kurva adisi untuk melihat

pengaruh matriks dalam sedimen terhadap penetapan kadar protein dalam

sedimen. Kurva adisi yang dibuat terdiri dari 6 titik yaitu mulai dari adisi 0, 10,

30, 50, 70, dan 90 mg BSA. Kurva adisi yang didapat memiliki persamaan regresi

linear y = 0,5813x + 0,054 dan R² = 0,9907.


52

Ada tidaknya efek matriks dalam sedimen dapat diketahui dengan

membandingkan kurva baku solven dengan kurva adisi pada gambar 5. Kurva

adisi memberikan respon yang meningkat lebih tinggi daripada respon pada kurva

baku solven. Hal ini menunjukkan adanya intervensi dari matriks sedimen pada

penetapan kadar protein sehingga untuk menentukan kadar protein dalam sedimen

ini digunakan persamaan regresi linear kurva adisi supaya merepresentasikan

kondisi yang sebenarnya.

Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein

Akurasi penetapan kadar protein dinyatakan dalam %D yaitu persen

difference. %D pada penetapan kadar protein ini didapatkan dari perbandingan

selisih konsentrasi diketahui dan konsentasi terhitung, dengan konsentrasi

diketahui dari kurva adisi. Berdasarkan FDA (2013), kriteria %D adalah <20%.

Pada tabel VI, menunjukkan hasil %D kurang dari 20% mulai dari adisi 30 mg

sedangkan adisi 10 mg tidak memenuhi kriteria akurasi sehingga dieksklusi dan

persamaan regresi linear yang digunakan mulai dari titik adisi 30 mg dengan

konsentrasi 0,16 mg/ml hingga adisi 90 mg dengan konsentrasi 0,48 mg/ml.

y = 0.055x + 0.1122

R² = 0.9826

y = 0.5813x + 0.054

R² = 0.9907

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 1 2 3 4

Tin

gg

i d

eriv

at

(cm

)

Konsentrasi (mg/ml)

Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi

Kurva baku

solven

Kurva adisi

Linear (Kurva

baku solven)

Linear (Kurva

adisi)


53

Tabel VI. %D kurva adisi protein

Adisi (mg) Konsentrasi (mg/ml) %D

10 0,05 67,9161

30 0,16 18,8720

50 0,27 13,5893

70 0,37 4,8465

90 0,48 2,5106

Presisi penetapan kadar protein ini dinyatakan dalam %RSD dari kurva

adisi. Berdasarkan FDA (2013), suatu metode dikatakan memiliki keterulangan

atau presisi yang baik jika nilai %RSD <20%. Pada penetapan kadar protein

dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar

tampak derivatif ini menunjukkan %RSD sebesar 12,554% sehingga kriteria

terpenuhi. Sensitivitas metode merupakan tingkat kepekaan suatu metode dalam

mendeteksi senyawa tertentu pada konsentrasi terkecil. Sensitivitas dinyatakan

dengan nilai LOQ. LOQ persamaan kurva adisi ini sebesar 0,0922 mg/ml.

E. Analisis Sampel

1. Analisis populasi mikroba dalam air habitat lobster

Antibiotik merupakan senyawa alami maupun buatan yang dapat

mempengaruhi pertumbuhan mikroba (bakteri) di alam. Terdapat dua macam

mekanisme dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba yaitu bakteriosidal dan

bakteriostatik. Pada gambar 6, dinyatakan bahwa bakteriostatik tidak menurunkan

log jumlah bakteri yang hidup tetapi menekan pertumbuhan bakteri sehingga

grafik log jumlah bakteri hidup menjadi datar. Berbeda dengan grafik log jumlah

bakteri hidup pada penambahan senyawa bakteriosidal yang mengalami

penurunan akibat bakteri mati (Scholar dan Pratt, 2000).


54

Gambar 6. Bakterosidal dan bakteriostatik antibiotik (Scholar dan Pratt, 2000)

Menurut Krasner dan Shors (2014), antibiotik memiliki spektrum

aktivitas bakteriostatik atau bakteriosidal pada jenis bakteri tertentu. Beberapa

antibiotik efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan yang lain

efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif. Tetrasiklin merupakan

senyawa antibiotik dengan mekanisme bakteriostatik dan memiliki spektrum yang

luas dalam mempengaruhi pertumbuhan mikroba (gram positif dan gram negatif).

Penetapan jumlah populasi mikroba dalam air habitat lobster air tawar

dilakukan dengan menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dan dilakukan

oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan

menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba (cfu) dengan colony counter.

Perhitungan jumlah koloni mikroba ini tidak spesifik terhadap mikroba tertentu

melainkan menghitung semua mikroba yang hidup yang dapat bertumbuh

membentuk koloni.

Pada tabel III, menunjukkan ada beragam jenis bakteri yang dapat hidup

di lingkungan air limbah bahkan dalam air bersih sekalipun dan meliputi mikroba

normal alam dan mikroba yang bersifat patogen.


55

Gambar 7. Log jumlah populasi mikroba kelompok kontrol dan antibiotik

Gambar 7, menyatakan log jumlah populasi mikroba. Pada hari ke 0

hingga hari ke 7, kelompok kontrol maupun kelompok antibiotik memiliki nilai

log jumlah populasi mikroba tidak jauh berbeda. Pada hari ke 14 hingga 28 terjadi

perbedaan log jumlah populasi mikroba antara kontrol dan perlakuan yaitu log

jumlah populasi mikroba pada kelompok antibiotik lebih tinggi dibandingkan

dengan kelompok kontrol. Hasil ini menunjukkan ketidaksesuaian efek tetrasiklin

sebagai antimikroba. Pada kasus ini, peneliti belum bisa mengambil kesimpulan

terhadap terjadinya peningkatan log jumlah populasi mikroba pada kelompok

antibiotik.

Gambar 8. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok kontrol)

0.0000

2.0000

4.0000

6.0000

8.0000

0 3 5 7 14 28

Kontrol Antibiotik

0.0000

1.0000

2.0000

3.0000

4.0000

5.0000

6.0000

7.0000

0 20 40

Lo

g j

um

lah

po

pu

lasi

mik

ro

ba

Hari

Kontrol

Poly.

(Kontrol)


56

Gambar 9. Kurva log jumlah populasi mikroba versus hari (kelompok antibiotik)

Pada gambar 8, tren polinimial yang terjadi adalah penurunan log jumlah

populasi mikroba selama perlakuan hingga 28 hari. Jika dibandingkan dengan

gambar 9, tren polinomial yang terjadi dikatakan tidak mengalami penurunan

maupun peningkatan yang nyata. Mengacu pada penelitian terdahulu oleh

Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), jumlah populasi bakteri

mengalami peningkatan pada ikan yang diberi antibiotik selama penyimpanan di

ruang pendingin. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi penurunan efek antibiotik

terhadap populasi bakteri.

Jika gambar 8 dan gambar 9 dibandingkan maka dapat dikatakan terjadi

perbedaan tren polynomial terhadap log jumlah populasi mikroba selama hari

perlakuan. Menurut Scholar dan Pratt (2000), pada gambar 6, tren log jumlah

koloni bakteri terhadap waktu pada perlakuan bakteriostatik tidak menunjukkan

peningkatan maupun penurunan. Pada gambar 9 menunjukkan tren yang mirip

yaitu tidak terjadi peningkatan maupun penurunan. Hasil ini dapat menyatakan

adanya kemungkinan efek tetrasiklin terjadi tetapi perlu penelitian lebih lanjut

terhadap bakteri secara spesifik yang ada dalam air habitat lobster. Keberadaan

mikroba di lingkungan sangat bervariasi. Tetrasiklin merupakan antibiotik dengan

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

0 20 40 Lo

g j

um

lah

po

pu

lasi

mik

ro

ba

Hari

Antibiotik

Poly.

(Antibiotik)


57

spektrum luas menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak pasti dapat

menghambat pertumbuhan semua jenis mikroba.

2. Analisis kadar protein dalam sedimen

Penetapan kadar protein dalam sedimen dilakukan dengan tujuan

mengamati kadar protein yang masih ada di dalam sedimen yang belum dirombak

oleh mikroba maupun pakan lobster air tawar yang belum dimakan. Penetapan

kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode CBB R dan dideteksi

dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang telah dikembangkan oleh

Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini. Sebelum dilakukan

penetapan kadar, validasi dilakukan pada metode CBB R dan spektrofotometri

sinar tampak derivatif. Validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, dan

sensitivitas.

Kadar protein dalam sedimen akan menunjukkan eksistensi pengaruh

pakan berantibiotik terhadap kualitas habitat lobster air tawar. Adanya kuman atau

mikroba dalam suatu habitat akan mempengaruhi ketersediaan nutrisi yaitu

protein dalam air yang berguna untuk pertumbuhan lobster. Mikroba normal alam

akan membantu penguraian protein dan bahan organik lain menjadi komponen

yang lebih sederhana sehingga siklus kimia normal (kandungan bahan organik)

dalam air dapat terdaur ulang. Kehadiran antibiotik dalam habitat akan

mempengaruhi perkembangan mikroba khususnya bakteri. Berkurangnya jumlah

populasi mikrobanormal dalam air akan mempengaruhi kualitas hidup lobster.

Kadar protein dalam sedimen ini ditetapkan dengan menggunakan

metode pewarnaan yaitu metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak


58

derivatif. Pewarnaan CBB ini bertujuan untuk memberikan profil warna terhadap

protein sehingga protein dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer

pada panjang gelombang sinar tampak.

Pada gambar 3, reaksi yang terjadi antara protein dan reagen CBB ini

adalah ikatan ionik, elektrostatik dan van der Waals antara asam sulfonat dan

rantai samping protein (arginin, lisin, dan histidin) yang akan menyebabkan

reduksi warna menjadi biru (Otlets, 2005). Selain ketiga mekanisme reaksi itu,

CBB juga berinteraksi dengan bagian hidrofobik protein seperti pada gambar 3.

Protein yang berinteraksi secara bebas dengan struktur CBB adalah struktur

protein primer seperti pada gambar 4. Pada penelitian ini perubahan warna yang

terjadi adalah warna ungu menjadi biru. Semakin tinggi jumlah protein yang

berinteraksi dengan CBB semakin memudar warna ungu dari CBB.

Pada penetapan kadar protein dalam sampel sedimen didapatkan hasil

berupa kadar protein (mg) dalam tiap gram sedimen. Kadar protein yang

didapatkan dievaluasi dengan menyelisihkan kadar protein pada kontrol dan

perlakuan dengan hari ke 0 lalu diplotkan dalam kurva dan dibandingkan. Jika

dilihat pada gambar 10, tren menunjukkan peningkatan kadar protein dalam

sedimen pada kedua kelompok. Tren kedua kelompok perlu diuji t supaya dapat

menyatakan ada perbedaan atau tidak. Setelah diuji t tidak berpasangan dengan

taraf kepercayaan 95% didapatkan hasil bahwa kadar protein kelompok kontrol

tidak berbeda nyata dengan kadar protein kelompok antibiotik, tertera pada

lampiran 36.


59

Gambar 10. Kurva kadar protein dalam sedimen selama hari perlakuan

3. Pertumbuhan lobster air tawar terkait panjang dan berat lobster

Menurut Lukito dan Prayugo (2007), lobster dengan umur 2-3 bulan

(juvenile) merupakan fase pertumbuhan optimum sehingga membutuhkan banyak

nutrisi dengan kata lain lobster mengkonsumsi pakan dalam jumlah besar. Pada

aspek pertumbuhan lobster dilakukan pengukuran pada panjang dan berat lobster.

Lobster air tawar mengkonsumsi pakan untuk memenuhi kebutuhan nutrisi untuk

bertumbuh menjadi lebih besar. Pengukuran panjang dan berat lobster ini

dilakukan untuk melihat pengaruh tetrasiklin dalam pakan terhadap laju

pertumbuhan lobster air tawar. Evaluasi data dilakukan dengan membandingkan

panjang dan berat antara kelompok kontrol dan perlakuan (telah diselisihkan

dengan hari 0) dalam kurva. Pengukuran panjang dan berat dilakukan pada lobster

air tawar padahari ke 0 sampai 14. Data panjang dan berat lobster pada hari ke 28

dieksklusi karena terjadi kematian masal lobster pada kelompok perlakuan

antibiotik. Pada gambar 11, menunjukkan laju pertambahan panjang lobster air

tawar kelompok antibiotik meningkat sama dengan kelompok kontrol. Pada

gambar 12, menunjukkan laju pertumbuhan berat lobster air tawar kedua

y = 5.7389x - 38.564

y = 5.2599x - 23.353

-40.0000

-20.0000

0.0000

20.0000

40.0000

60.0000

80.0000

100.0000

120.0000

140.0000

0 10 20 30

seli

sih

kad

ar

pro

tein

den

gan

H

-0

Hari

Kelompok kontrol

kelompok antibiotik

Linear (Kelompok

kontrol)

Linear (kelompok

antibiotik)


60

kelompok meningkat pula. Setelah dilakukan uji t tidak berpasangan dengan taraf

kepercayaan 95% terhadap kedua kelompok didapatkan hasil bahwa laju

pertumbuhan lobster kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan lobster

kelompok antibiotik. Hal ini menunjukkan bahawa lobster air tawar pada kedua

kelompok memiliki aktivitas makan yang sama.

Gambar 11. Kurva perbandingan panjang lobster kelompok kontrol dan antibiotik

Gambar 12. Kurva perbandingan berat lobster kelompok kontrol dan antibiotik

F. Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster

Tujuan penetapan kadar TC dalam daging lobster ini adalah untuk

melihat adanya TC yang terakumulasi dalam daging lobster setelah diberi

y = 0.039x - 0.1682

y = 0.0488x - 0.1455

-0.2000

-0.1000

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

0 5 10 15

Pa

nja

ng

(cm

)

Hari

Kontrol

Antibiotik

Linear (Kontrol)

Linear

(Antibiotik)

y = 0.0083x + 0.2441

y = 0.0145x + 0.3645

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

0 5 10 15

Ber

at

(gra

m)

Hari

Kontrol

Antibiotik

Linear (Kontrol)

Linear

(Antibiotik)


61

perlakuan selama 28 hari. Penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan dengan

menggunakan metode HPLC yaitu penetapan kadar suatu senyawa dengan cara

memisahkan dan menganalisis analit dari komponen lain dalam matriks sampel

dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak (Snyder,

Kirkland, dan Dolan, 2010). Pada penelitian ini, peneliti ingin menghitung kadar

TC dalam bentuk TC basa sehingga perlu dilakukan preparasi sampel sebelum

proses ekstraksi sehingga analit dapat terambil dalam bentuk TC basa. Sebelum

dilakukan penetapan kadar TC dengan metode HPLC ini perlu dilakukan orientasi

dan optimasi agar hasil yang digunakan merupakan hasil yang paling optimum

maka dilakukan orientasi penentuan puncak TC, panjang gelombang TC dan

optimasi fase gerak.

1. Preparasi dan ekstraksi TC dalam daging lobster

Ekstraksi TC dalam sampel daging yang sudah digerus dilakukan dengan

menggunakan HCl : akuabides (1:1). HCl merupakan asam kuat dengan nilai

derajat keasaman 1. Sifat eksotermis dari HCl mengakibatkan energi panas dapat

terjadi dalam suatu sistem larutan (Frankel, 2012). Penggunaan HCl : akuabides

ini ditujukan untuk mengambil TC dalam bentuk garam tetrasiklin HCl (TCH)

dari matriks daging dengan mekanisme pemecahan struktur lemak daging lobster

dan denaturasi protein sehingga TC dapat terlarut dalam HCl : akuabides. Reaksi

denaturasi protein dapat dilihat pada gambar 4. Reaksi oksidasi lemak yaitu pada

trigliserida oleh asam dapat dilihat pada gambar 13.


62

Gambar 13. Reaksi oksidasi trigliserida oleh asam (Frankel, 2012)

Analit yang dituju dalam sampel daging adalah tetrasiklin basa (TC)

karena digunakan HPLC fase terbalik yang mana analit harus bersifat non polar

dibandingkan dengan fase geraknya agar bisa terpisah dengan baik, maka perlu

dilakukan pembentukan TC bersifat basa dengan polaritas lebih rendah dari

bentuk garamnya yaitu tetrasiklin HCl (TCH). Preparasi selanjutnya, TC yang

sudah terambil (dalam bentuk TCH) dari matriks daging direaksikan dengan

NaOH sehingga terjadi reaksi kesetimbangan dengan reaksi sebagai beikut :

Tetrasiklin HCl + NaOH Tetrasiklin + NaCl + H2O

(garam) (basa) (basa) (garam)

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ekstraksi cair-cair yaitu

asetonitril dan buffer McIlvaine (pH 4) dengan bantuan NaCl dengan tujuan TC

basa akan terlarut dalam asetonitril dan zat lain terlarut dalam buffer McIlvaine.

Ekstraksi menggunakan asetonitril dan buffer McIlvaine dengan penambahan

garam NaCl dilakukan dengan tujuan mengadakan efek salting out yaitu menarik

air sehingga terjadi pemisahan antara air dan asetonitril. Pada awalnya tujuan

peneliti mengambil fase asetonitril untuk kemudian dilakukan penguapan, tetapi

tidak terjadi pemisahan secara sempurna sehingga pada sampel secara langsung


63

dilakukan proses penguapan dengan menggunakan rotary evaporator dengan

anggapan bahwa zat lain ikut menguap bersama asetonitril.

2. Orientasi panjang gelombang TC

Orientasi panjang gelombang TC dilakukan pada 20 ppm standar TCH

dalam HCl (dengan proses ektraksi) dengan melihat spektrum absorbansi TC

(setelah dilakukan perlakuan ekstraksi) dengan menggunakan spektrofotometri uv.

Pada orientasi panjang gelombang TC ini didapatkan panjang gelombang

maksimal pada 270 nm dapat dilihat pada lampiran 25.

3. Penetapan puncak TC

Penetapan puncak TC dilakukan dengan menggunakan standar TCH

yang dilarutkan dalam asetonitril : buffer McIlvaine dan dilakukan deteksi dengan

menggunakan HPLC. Kromatogram standar TCH ditunjukkan pada gambar 14,

terdapat puncak pada waktu retensi 5,1 sehingga waktu retensi 5,1 dipilih sebagai

waktu retensi TCH dalam fase gerak.

Gambar 14. Kromatogram standar TCH dalam pelarut fase gerak

Penetapan puncak TCH dalam daging yang diekstraksi yaitu TC basa

juga dilakukan untuk menentukan puncak TC basa. Kromatogram hasil deteksi

TCH


64

TC basa dengan menggunakan HPLC yaitu pada gambar 16. Pada gambar 16,

menunjukkan adanya 3 puncak tertinggi pada waktu retensi 3,9; 5,7; dan 10,0.

Selanjutnya dilakukan perbandingan dengan kromatogram blangko yaitu pelarut

dengan perlakuan ekstraksi tanpa TCH. Pada gambar 15, ternyata pada waktu

retensi 3,9 juga terdapat puncak seperti pada kromatogram standar TC (gambar

16). Kromatogram standar TC (gambar 16) menunjukkan ada dua puncak tertinggi

yang tidak ditemukan pada kromatogram blangko sehingga 2 puncak pada waktu

retensi 5,7 dan 10,0. Jika gambar 16 dibandingkan dengan gambar 14 maka dapat

ditentukan bahwa pada waktu retensi 5,7 adalah puncak dari TCH dan pada waktu

retensi 10,0 adalah puncak dari TC basa. Sesuai dengan sifat polaritas tetrasiklin

basa (TC) dan garam tetrasiklin HCl (TCH) akan menentukan waktu retensinya

juga. TCH bersifat lebih polar dibanding TC basa sehingga akan terelusi lebih

dulu.

Gambar 15. Kromatogram blanko (tanpa TCH)

Gambar 16. Kromatogram standar TC basa

TCH TC


65

Pembentukan dua puncak ini dapat disebabkan karena ketidak

sempurnaan dalam ekstraksi sehingga untuk menetapkan kadar tetrasiklin dalam

daging dengan kondisi adanya dua puncak tetrasiklin, maka dilakukan

penjumlahan antara puncak pada waktu retensi 5,7 dan 10,0 untuk

merepresentasikan tetrasiklin total yang ada dalam sampel daging lobster. Dalam

antisipasi kegagalan ekstraksi perlu dilakukan optimasi kembali terhadap ekstraksi

yang digunakan dalam penelitian ini.

4. Optimasi fase gerak HPLC

Optimasi fase gerak dilakukan untuk mendapatkan formula fase gerak

yang tepat untuk memisahkan TC basa dan senyawa lain sehingga TC basa dapat

terdeteksi tanpa adanya penumpukan peak. Optimasi fase gerak ini dilakukan pada

20 ppm standar TCH (telah dilakukan preparasi dan ekstraksi) dengan

menggunakan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4) dan acetonitiril :

buffer McIlvaine (pH 4). Asetonitril dan metanol merupakan pelarut yang sering

digunakan untuk melarutkan senyawa tetrasiklin. Pada kromatogran gambar 18,

terdapat 2 puncak paling tinggi pada penggunaan fase gerak asetonitril : buffer

McIlvaine (pH 4). TC basa dengan konsentrasi yang sama dideteksi dengan

menggunakan HPLC dan fase gerak metanol : buffer McIlvaine (pH 4)

menghasilkan kromatogram pada gambar 17. Berdasarkan kromatogram yang

dihasilkan dengan menggunakan kedua pelarut, asetonitril : buffer McIlvaine

dipilih sebagai fase gerak yang paling optimum untuk memisahkan analit pada

penelitian ini.


66

Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak metanol : buffer McIlvaine

Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine

G. Validasi Metode HPLC

Validasi metode penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan untuk

menjamin metode HPLC dalam menetapkan kadar TC. Validasi yang dilakukan

meliputi linearitas, akurasi, presisi, sensitivitas (LOQ) dan selektivitas (resolusi).

Pada penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan juga perbandingan kurva

baku solven dan kurva adisi. Persamaan regresi linear yang didapat yaitu pada

tabel VII. Nilai slope pada kedua kurva (tabel VII) memiliki selisih yang besar

sehingga matriks sampel dapat mempengaruhi penetapan kadar TC.

Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi

Kurva R2 Slope Persamaan regresi linear

Baku solven 0,9919 209507 y = 209507x – 46814

Adisi 0,9976 90169 y = 90169x + 8799

TCH TC


67

Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC

Pada gambar 19, terlihat bahwa kurva baku solven memiliki respon yang

lebih tinggi daripada kurva adisi terhadap deteksi HPLC. Dalam penelitian ini,

efek matriks yang terjadi adalah menurunkan kadar TC sehingga digunakan kurva

adisi untuk melakukan penetapan kadar TC dalam daginng, agar dapat

merepresentasikan kondisi yang sebenarnya.

Linearitas pada kurva baku solven dinyatakan dengan nilai R2

sebesar

0,9919 dengan persamaan regresi linear y = 209507x-46814 sedangkan pada

kurva adisi didapatkan nilai R2

sebesar 0,9976 dengan persamaan regresi linear y

= 90169x+8799. Sensitivitas pada metode dilakukan dengan menyatakan nilai

LOQ pada kurva adisi yaitu sebesar 1 ppm. LOQ metode HPLC menggunakan

kurva adisi yang didapat sebesar 0,53 ppm sehingga konsentrasi 0,2 ppm pada

kurva adisi tidak masuk dalam LOQ.

Akurasi dinyatakan dengan persen difference (%D) yang didapatkan dari

kurva adisi dapat dilihat pada tabel. Ketentuan dari FDA, menyatakan metode

yang akurat memiliki nilai %D dan %RSD kurang dari 20%. Akurasi pada kurva

adisi yang digunakan pada tabel VIII, menyatakan %D lebih dari 20% pada

konsentrasi 0,2 dan 1 ppm. Hasil menunjukkan akurasi yang tidak sesuai kriteria.

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 5 10 15 A

UC

Konsentrasi (ppm)

Kurva adisi

Kurva baku solven

Linear (Kurva adisi)

Linear (Kurva baku solven)


68

Tabel VIII. %D kurva adisi

Konsentrasi (ppm) %D

0,2 134,7459

1 30,2421

3 0,7057

7 0,3219

10 0,3422

Penetapan presisi dilakukan pada kurva adisi terhadap 4 titik mulai dari

1-10 ppm dan didapatkan %RSD <20% yaitu 17,2625% sehingga presisi masih

masuk kriteria pada konsentrasi 1-10 ppm. Karena keterbatasan waktu pada

penetapan kadar TC dalam daging lobster ini, maka tetap digunakan persamaan

regresi linear dari konsentrasi 0,2-10 ppm karena AUC sampel yang tidak masuk

interval kurva adisi bila digunakan kurva adisi dari 1-10 ppm maka hasil

penelitian ini hanya dapat dinyatakan secara kualitatif.

Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode dalam memisahkan

analit secara tepat dan spesifik, parameter yang diamati adalah resolusi. Menurut

Snyder et al. (2010), suatu metode analisis dikatakan selektif apabila memiliki

resolusi ≥ 1,5. Nilai ini menunjukan pemisahan antara puncak kromatogram sudah

terjadi secara sempurna.

Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi sampel TC

Sampel Waktu retensi Resolusi Rata-rata nilai resolusi

1 5,8 0,191

2,213 10,1 2,223

2 5,8 2,223

10,1 3,656

3,208 3

5,8 2,203

10,1 3,744

Tabel X menunjukan rata-rata resolusi dari puncak TC dengan puncak

lain yang terdekat adalah ≥ 1,5, yaitu 2,213 pada waktu retensi 5,8 dan 3,208


69

pada 10,1. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki

kriteria selektivitas terpenuhi karena dapat memisahkan senyawa analit dari

senyawa-senyawa lain yang ada pada matriks.

H. Penetapan Kadar Tetrasiklin (TC) Dalam Daging Lobster

Penetapan kadar tetrasiklin (TC) dalam daging dilakukan pada lobster air

tawar perlakuan hari ke 14 dan ke 28 untuk melihat ada tidaknya peningkatan

kadar akumulasi TCH yang cukup terlihat dalam daging lobster. TCH memiliki

sifat larut yang cukup baik di dalam air sehingga kemungkinan untuk mengendap

dan terakumulasi dalam tubuh lobster sangat kecil. TCH memiliki harga logP

sebesar -1,37 yang menunjukkan kelarutan di dalam air yang tinggi (Hansh, Leo,

dan Hoekman, 1995). Tetapi TCH memiliki sifat tidak stabil dengan ion logam

seperti Mg dan Ca. TC dapat berikatan kovalen dengan ion logam menjadi suatu

kompleks kelat sehingga fungsinya sebagai anti mikroba tidak muncul. Kompleks

kelat TCH-Ca ini sulit didegradasi sehingga tetap berada dalam habitat dan

kemungkinan untuk termakan oleh lobster sangat besar sehingga terjadi akumulasi

dalam daging lobster.

Gambar 20. Kompleks TC dengan ion logam


70

Kadar TCH dalam daging yang ditetapkan adalah pada hari perlakuan 14

dan 28 daging lobster. Pada hari perlakuan ke 14, data kadar TC dalam daging

dieksklusi karena memiliki %RSD yang besar(presisi kadar tidak terpenuhi). Pada

perlakuan hari ke 28 didapatkan presisi sebesar 1,41901 dan rata-rata kadar

akumulasi TC sebesar 53,0970 ug/g.

Tabel X. Kadar tetrasiklin total dalam daging lobster

Replikasi Kadar TC (ug/g) Rata-rata (ug/g)

1 53,9382

53,0970 2 52,8686

3 52,4842

I. Keterbatasan Penelitian

Penelitian ini memiliki banyak kekurangan yaitu pada penetapan kadar

tetrasiklin dalam daging lobster tidak digunakan standar internal sebagai faktor

koreksi terhadap proses ekstraksi. Proses ekstraksi yang tidak dioptimasi sehingga

terjadi dua puncak pada kromatogram. Kurva baku adisi yang digunakan untuk

menetapkan kadar protein dalam sedimen dan tetrasiklin dalam daging lobster

tidak memenuhi kriteria. Pada pembagian lobster dalam akuarium sebelumnya

tidak diukur panjang dan berat per akuarium melainkan diambil rata-rata

keseluruhan lobster. Selain itu tidak dilakukan pengecekan kualitas air per

sampling.


71

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan berpengaruh terhadap jumlah

populasi mikroba.

2. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap kadar

protein dalam sedimen.

3. Adanya antibiotik tetrasiklin dalam pakan tidak berpengaruh terhadap laju

pertumbuhan lobster air tawar.

4. Terjadi akumulasi antibiotik tetrasiklin sebesar 53,0970 µg/g.

B. Saran

1. Perlu dilakukan pengamatan dan evaluasi jumlah populasi mikroba secara

spesifik pada jenis bakteri untuk dapat menyatakan efek tetrasiklin.

2. Perlu dilakukan optimasi kembali terkait ekstraksi tetrasiklin dalam daging.

3. Perlu dilakukan pengecekan kualitas air per hari perlakuan.


72

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, H., 2004, Principles and Reactions Of Protein Extraction, Purification,

and Characterization, CRC Press, USA. Pp. 35-37.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Reublik

Indonesia, Jakarta, pp. 781-782, 1061.

Anonim, 2013, Bioanalytical Method Validation, CDER, Food and Drug

Administration.

Ansari, M., dan Raissy, M., 2010, In vitro Susceptibility of Commonly Used

Antibiotics against Vibrio spp. Isolated from Lobster (Panulirus

homarus), African Journal of Microbiology Research,4(23), 2629-2631.

Bachtiar, Y., 2006, Usaha Budi Daya Lobster Air Tawar di Rumah, P.T.

AgroMedia Pustaka, Jakarta, pp. 42.

Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell, L. G., 2002, Biologi, Erlangga,

Jakarta, pp. 77-80.

Chan, C. C., Lam, H.,dan Zhang, X. M., 2004, Analytical Method validation and

Instrument Performance Verification, John Wiley & Sons, Inc., New

York, pp. 16-17, 105, 156.

Dachriyanus, (2004), Analisis Struktur Senyawa Organik Secara

Spektrofotometri, Cetakan pertama, CV. Trianda Anugrah Pratama,

Padang, pp. 1-2.

Dennison, Clive., 2003, A Guide to Protein Isolation, 2nd

edition, Kluwer

Academic Publishers, Netherlands, pp.13-19, 23-28

Effendy, 1998, Memelihara Ikan Mas Koki Dalam Akuarium, Kanisius,

Yogyakarta.

Ermer, J. dan Miller, J.H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical

Analysis, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, New York, pp. 21-

24.


73

Frankel, E. N., 2012, Lipid Oxidation, 2nd

edition, Woodhead Publishing, USA,

pp. 10-12.

Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, pp. 378-417, 456-480.

Glencross, H., Ahmed N., dan Wang Q., 2011, Biomedical Science Practice

Experimental and Professional Skills, Oxford University Press, New

York, pp.359,360.

Georgiou, C. D., Grintzalis, K., Zervoudakis, G., dan Papapostolou, I., 2008,

Mechanism of Coomassie brilliant blue G-250 Binding to Proteins: A

Hydrophobic Assay for Nanogram Quantities of Proteins, Anal Bioanal

Chem, 391, 391–403.

Harmita., dan Radji, M., 2006, Buku Ajar Analisis Hayati, Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 125-126.

Hansch, C., Leo, A., D. Hoekman,1995, Exploring QSAR - Hydrophobic,

Electronic, and Steric Constants, Washington, DC, American Chemical

Society, pp. 177.

Hossain, Sharker, Haque, Reza, dan Mondal (2014), Effects of antibiotic on the

bacterial microflora in two commercially important catfish species,

Clarias batrachus and Heteropneustes fossilis in Bangladesh, Journal of

Coastal Life Medicine, 2(11): 845-848.

Jenie, Betty S.L dan Rahayu, W. P., 1993, Penanganan Limbah Industri Pangan,

Kanisius, Yogyakarta, pp.27-28.

Johnson, B., 2010, Oxytetracycline (Terramycin® 200 for Fish) Medicated Feed

Clinical Field Trials- INAD 8069,

http://www.fws.gov/fisheries/aadap/inadsavailable/medicatedfeeds/Oxyte

tracycline-shrimp/index.html, diakses tanggal 2 Desember 2015.

Kazakevich, Y. dan Lobrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientists,

John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 145-157.

Krasner, R. I., 2014, The Microbial Challenge : A Public Health Perspective, 3rd

edition, Jones & Bartlett Learning, USA, pp. 399-400.


74

Kruger N. J., 1994, The Bradford method for protein quantitation, in Methods in

Molecular Biology, Vol. 32 : Basic Protein and Peptide Protocols (J.M.

Walker, ed.), Humana Press, New Jersey, pp. 9-15.

Kurniawan, D.,2010, Bioremediasi Sedimen Tambak Udang, Laporan Penelitian,

Fakultas Perikanan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman, Samarinda.

Lim, K., 2006, Pembenihan Lobster Air Tawar : Meraup Untung Dari Lahan

Sempit, AgroMedia Pustaka, Jakarta.

Lukito, A., dan Prayugo, S., 2007, Panduan Lengkap Lobster Air Tawar, Penebar

Swadaya, Jakarta, pp. 6-9, 56-74.

Mayer, L, M., Schick, L, L., dan Setchell, F, W., 1986, Measurement of Protein in

Nearshore Marine Sediment, Inter-Research, 30,159-165.

Nur, A., 2011, Manajemen Pemeliharaan Udang Vaname, Direktorat Jendral

Perikananan Budidaya Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau

Jepara, Jakarta, pp. 2-10, 13-19, 23.

Nurhidayati, L., 2007, Spektrofotometri Derivatif dan Aplikasinya dalam Bidang

Farmasi, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 5(2), 93-99.

Otlets, S., 2005, Methods of Analysis of Food Components and Additives, Taylor

& Francis Group, United States, pp. 79.

Rosenberg, I. M., 2005, Protein Analysis and Purification Benchtop Techniques,

Second Ed, Springer Scince and Business Media, USA, pp. 20-27.

Scholar, E. M., dan Pratt, W. B., 2000, The Antimicrobial Drugs, 2nd

edition,

Oxford University Press, New York, pp. 260-261.

Snyder, L. R., Kirkland, J. J., dan Dolan, J. W., 2010, Introduction Modern Liquid

Chromatography, 3rd

ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 1-5,

54-55, 88-144.

Subronto dan Tjahjati, 2001, Pedoman Pengobatan pada Hewan Ternak, Bentang

Pustaka, Yogyakarta, pp. 137, 145-147.


75

Sukmajaya, Ir. Y. dan Suharjo, I., 2003, Mengenal lebih Dekat Lobster Air Tawar,

Komoditas Perikanan Prospektif, PT Agromedia Pustaka Utama,

Tangerang, pp. 56, 57.

Vaz-Moreira, I., Nunes, O. C., dan Manaia, C. M., 2014, Bacterial Diversity And

Antibiotic Resistance In Water Habitats: Searching The Links With The

Human Microbiome, Federation of European Microbiology Societies,

38, 761–778.

Weifen,W., Hong, L., Changhu, X., dan Jamil, K., 2004, Elimination of

Chloramphenicol, Sulphamethoxazole And Oxytetracycline In Shrimp,

Penaeus Chinensis Following Medicated-Feed Treatment, Environment

International, 30, 367-373.


76

LAMPIRAN


77

Lampiran 1. Surat permohonan working standar tetrasiklin HCl


78

Lampiran 2. COA working standar tetrasiklin HCl


79

Lampiran 3. COA reagen coomasie R


80

Lampiran 4. COA albumin (BSA)


81

Lampiran 5. Hasil determinasi lobster air tawar


82


83


84

Lampiran 6. Kurva baku penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul

Konsentrasi (mg/ml) Absorbansi

0.15 0.293

0.2 0.374

0.25 0.432

0.3 0.527

0.35 0.621

0.4 0.667

0.45 0.733

0.5 0.833

Lampiran 7. Tabel hasil penetapan kadar tetrasiklin HCl dalam kapsul

y = 1.5176x + 0.0668 R² = 0.9953

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.2 0.4 0.6

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi (mg/ml)

Kurva Baku

Penimbangan

Sampel g Keterangan Absrobansi

Konsentrasi

(mg/ml)

Konsentrasi

(% b/b)

0.2514 Replikasi 1 0.4290 0.2387 94.9349

0.251 Replikasi 2 0.4230 0.2347 93.5110

0.2512 Replikasi 3 0.4250 0.2360 93.9612


85

Lampiran 8. Hasil jumlah populasi mikroba pada optimasi dosis tetrasiklin


86

Lampiran 9. Hasil jumlah populasi mikroba air hari ke 0


87



88


89



90


91



92


93



94


95



96


97

Lampiran 15. Tabel data jumlah populasi mikroba

Perlakuan

selama

(hari)

Kelompok Kontrol

Kelompok Antibiotik

Populasi

Mikroba

Log Populasi

Mikroba

Populasi

Mikroba

Log Populasi

Mikroba

0 370000 5,5682 370000 5,5682

3 3200000 6,5051 2900000 6,4624

5 30000 4,4771 31000 4,4914

7 290000 5,4624 98000 4,9912

14 2200 3,3424 1000000 6,0000

28 32000 4,5051 340000 5,5315

Lampiran 16. Tabel data tinggi derivat kurva baku solven protein

Konsentrasi (mg/ml) Tinggi derivate (cm)

0,4 0,13

0,8 0,15

1,2 0,18

1,6 0,20

2,0 0,23

2,4 0,25

2,8 0,28

3,2 0,28

3,6 0,30

Lampiran 17. Tabel data tinggi derivat kurva adisi protein

Adisi

(mg)

Konsentrasi

(mg/ml)

Tinggi

derivat

10 0,05 0,13

30 0,16 0,15

50 0,27 0,20

70 0,37 0,28

90 0,48 0,33

Lampiran 18. Contoh perhitungan %D


98

Lampiran 19. Contoh perhitungan %RSD

x (mg/ml) y (cm) RF (y/x) SD Rata-rata

0,16 0,15 0,9375

0,10825 0,78125 0,27 0,2 0,75

0,37 0,28 0,75

0,48 0,33 0,6875

Lampiran 20. Contoh perhitungan LOQ

Persamaan regresi linear y = bx+ a

y = 90169x + 8799

Standar deviasi 14394,40

Slope (b) 90169

Lampiran 21. Contoh spektrum derivatif protein


99

Lampiran 22. Data kadar protein dalam sedimen

Hari

perlakuan

Kadar protein (mg/g) Kadar protein

(selisih dengan hari ke 0)

kontrol antibiotik kontrol antibiotik

0 117,7318 117,7318 0 0

3 108,2719 117,9104 -9,4599 0,1786

5 117,9104 132,3681 0,1786 14,6363

7 101,8463 92,2078 -15,8855 -25,5240

14 149,0747 123,3722 31,3429 5,6404

28 246,7443 246,7443 129,0125 129,0125

Lampiran 23. Tabel data panjang lobster air tawar

Hari Kontrol Antibiotik Selisih dengan hari ke 0

Panjang (cm) Panjang (cm) Kontrol Antibiotik

0 5,2500 5,2500 0 0

3 5,3067 5,3867 0,0567 0,1367

5 5,3133 5,3067 0,0633 0,0567

7 5,1385 5,2867 -0,1115 0,0367

14 5,7000 5,8533 0,4500 0,6033

28 5,5071 mati 0,2571 -

Lampiran 24. Tabel data berat lobster air tawar

Hari Kontrol Antibiotik Selisih dengan hari ke 0

Berat (gram) Berat (gram) Kontrol Antibiotik

0 3,2500 3,2500 0 0

3 3,5293 3,8273 0,2793 0,5773

5 3,6660 3,5887 0,4160 0,3387

7 3,3685 3,5760 0,1185 0,3260

14 3,6536 3,8860 0,4036 0,6360

28 3,9829 mati 0,7329 -

Lampiran 25. Spektrum orientasi panjang gelombang tetrasiklin


100

Lampiran 26. Tabel data AUC kurva baku solven tetrasiklin

Konsentrasi (ppm) AUC

0,2 59168,7

1,2 234696,3

2,4 470502,0

3,6 604299,0

4,8 954569,0

6,0 1242458,0

7,2 1319205,3

9,6 2033852,3

12,0 2506746,3

Lampiran 27. Tabel data AUC kurva adisi tetrasiklin

Adisi (ppm) Konsentrasi (ppm) AUC

2 0.2 2533

10 1 126237

30 3 277397

70 7 642014

100 10 907403

Lampiran 28. Contoh kromatogram kurva baku solven

Lampiran 29. Contoh kromatogram kurva adisi tetrasiklin


101

Lampiran 30. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 14

Lampiran 31. Contoh kromatogram tetrasiklin dalam sampel daging hari ke 28

Lampiran 32. Kandungan pakan dan merek dagang pakan

Lampiran 33. Proses perlakuan


102

Lampiran 34. Sedimen lobster air tawar

Lampiran 35. Perbandingan jumlah sedimen pada hari ke 28

Lampiran 36. Contoh perhitungan uji t tidak berpasangan (p<0,05)

H0 X1=X2 X1(kadar protein kelompok kontrol)

H1 X1≠X2 X2(kadar protein kelompok antibiotik)

H0 = kadar protein kelompok kontrol tidak berbeda nyata dengan kadar protein

kelompok antibiotik.

H1 = kadar protein kelompok kontrol berbeda nyata dengan kadar protein kelompok

antibiotik.

Rumus :


103

Perhitungan :

Kesimpulan :

H1 diterima jika t hitung ≥ t tabel

1,1577< 2,306

Maka H1 ditolak sehingga kadar protein kelompok kontroltidak berbeda nyata dengan

kadar protein kelompok antibiotik.

Lampiran 37. Tabel uji t tidak berpasangan terhadap panjang dan berat losbter

Parameter df (n=4) S t hitung Keterangan t tabel

Panjang 6 0,023825 -2,7814 < 2,447

Berat 6 0,020480 -5,7025 <


104

BIOGRAFI PENULIS

Penulis dengan nama lengkap Aditya Christian

Firmanto dilahirkan di Pati pada tanggal 19 April 1993

sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis

skripsi berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan

Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein

Sedimen Dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan

Menggunakan Pengembangan Metode Analisis

Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan

Lobster Air Tawar (Cherax Quadricarinatus)”

menempuh pendidikan formal yang ditempuh penulis

adalah TK Petiwi Wedarijaksa (1997-1999), SD

Kanisius Pati (1999-2005), SMP Kanisius Pati (2005-

2008), SMA Negeri 1 Pati (2008-2011). Pada tahun

2011, penulis melanjutkan pendidikan di program studi S1 Fakultas Famasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah menjadi

asisten dosen pada praktikum Kimia Dasar dan Kimia Organik. Selain itu, penulis

juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan kampus antara lain sebagai anggota

Paduan Suara Mahasiswa Sanata Dharma, pernah mengikuti beberapa perlombaan

antara lain Bali International Choir Competition mendapat medali emas (2012),

pernah mengisi acara kebudayaan di Hongaria(2014) dan pernah mengikuti

beberapa kepanitiaan antara lain Inisiasi Sanata Dharma sebagai divisi expo

(2013), Pharmacy Performance sebagai divisi keamanan (2011) serta pernah

mengikuti beberapa seminar.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · 2016-01-29 · i pengaruh pemberian pakan...

Documents