Penetapan Kadar Parasetamol dalam Plasma dengan Metode ChafetzA. Tujuan 1. Mahasiswa mampu menetapkan kadar parasetamol dalam darah dengan metode chafetz. 2. Mahasiswa dapat memahami parameter-parameter yang dibutuhkan untuk melakukan validasi suatu penelitian.

B. Dasar Teori Parasetamol atau asetaminofen adalah senyawa turunan para-aminofenol yang memiliki rumus bangun seperti di bawah ini:

HO

NHCOCH3

N-(4-Hydroxy-phenyl)-acetamide

Parasetamol berupa serbuk hablur atau serbuk putih yang tidak berbau dengan rasa agak pahit. Kelarutan parasetamol yakni larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1 N, serta mudah larut dalam etanol (Anonim, 1995). Parasetamol merupakan obat asam lemah dengan pKa 9,5 (Katzung, 1989). Parasetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek antipiretik yang sama dan digunakan sejak tahun 1893. Efek antipiretiknya ditimbulkan oleh gugus aminobnezen. Efek analgesik parasetamol serupa dengan asam salisilat, yaitu menghilangkan nyeri ringan sampai sedang dengan mekanisme yang diduga berdasarkan efek sentralnya. Parasetamol merupakan penghambat biosintesis prostaglandin yang lemah. Dalam plasma, 25 % parasetamol terikat pada protein plasma. Sebagai analgesik, parasetamol sebaiknya tidak diberikan terlalu lama karena kemungkinan menimbulkan nefropati analgesik (Wilmana, 1995). Plasma adalah bagian bening yang terdapat pada lapisan bagian atas darah yang telah diberi antikoagulan dan telah disentrifugasi. Jika sebelum

disentrifugasi, tidak dilakukan penambahan antikoagulan (darah dibiarkan membeku) maka bagian beningnya disebut serum. Pada darah normal, jumlah plasma mencapai 55% dari volume darah. Plasma tersebut mengandung 90% air dan 7% protein (albumin, globulin, fibrinogen), dan 3% zat terlarut yang lain (garam-garam, oksigen, gas, glukosa, hormon, metabolit, nutrient dan zat-zat lain) (Stalcup et al., 1995). Dalam plasma, protein yang terbanyak ditemukan adalah albumin (Montgomery et al., 1992). Dua fungsi utama albumin adalah untuk transport molekul kecil dalam plasma dasn cairan ekstraseluler, dan untuk mempertahankan tekanan osmotik dalam kapiler nonspesifik (Montgomery et al., 1992) yang memiliki 2 tempat ikatan pada setiap molekulnya (Rang et al., 2003). Pengikatan molekul kecil pada protein dapat dituliskan dengan persamaan umum sebagai berikut: [P] + [A] [PA], dimana [P] = protein yang tidak membentuk kompleks dengan molekul kecil, [A] = kadar molekul kecil yang tidak terikat, dan [PA] = kadar kompleks protein-molekul kecil (Montgomery et al., 1992). Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu teknik analisis fisika kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 190-380 nm (UV) dan 380-780 nm (Vis) dengan memakai instrument spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Sedangkan kolorimetri mencakup pengubahan senyawa tidak berwarna menjadi senyawa berwarna dan penentuan fotometrinya dilakukan dalam daerah sinar tampak (400-800 nm) (Roth dan Blaschke, 1981). Metode Chafest sangat spesifik untuk parasetamol meskipun dipengaruhi oleh salisilat (Chamberlain, 1995). Asam salisilat akan memberikan reaksi yang mirip dengan parasetamol, tetapi di dalam plasma asam salisilat baru akan memberikan intensitas warna yang mirip dengan 20 g/ml parasetamol jika kadar asam salisilat di dalam plasma 1000 g/ mL. Sampel yang terkontaminasi oleh heparin yang mengandung kresol sebagai pengawet dapat memberikan hasil yang semu sebesar 200 g/ mL (Widdop, 1986).

Cincin aromatis dari parasetamol akan dinitrasi oleh asam nitrit menjadi 2nitro-4-asetamidofenol. Produk ini kemudian dilarutkan dalam natrium hidroksida sehingga suasananya menjadi basa. Dalam suasana inilah larutan akan memberikan kromofor yang kuat sehingga absorbansi dapat terbaca pada nm (Chafetz et al., 1971).OH

430

OH NO2

OH NO2

HNO2 [O] H+

OH -H2O

NHCOCH3

NHCOCH3

NHCOCH3

Gambar Reaksi Parasetamol dengan Asam Nitrit

(Chafetz et al., 1971). Namun, metode ini tidak dapat mengukur dengan tepat konsentrasi parasetamol dalam plasma di bawah 50 g/ mL sehingga pada konsentrasi tersebut biasanya digunakan metode kromatografi (Widdop, 1986). Dalam klinik, metode ini biasanya digunakan untuk penetapan kadar parasetamol plasma pada kasus overdosis (Chambers dan Jones, 1976). Parameter kesahihan (validasi) metode analisis antara lain akurasi, presisi, spesivitas, linearitas, sensitivitas, dan ruggedness. Akurasi yang baik untuk bioanalisis rentang akurasi 80-120 % masih bisa diterima. Untuk bioanalisis CV= 15-20 % masih diterima. Linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Sensitivity metode analisis adalah kemampuan metode analisis untuk memisahkan perbedaan kecil dalam konsentrasi analit. Ada dua faktor yang mempengaruhi sensitivitas yaitu slope kurva baku dan keterulangan (Skoog, 1994).

Ruggedness digunakan untuk melihat reprodusibilitas hasil analisis menggunakan sampel yang sama dengan berbagai macam kondisi percobaan seperti laboratorium, analisis, instrument, waktu yang berbeda dan lain-lain (Anonim b, 1995). Dalam penetapan kadar obat dalam darah (cairan tubuh), metode yang digunakan harus tepat dan dalam pengerjaannya diperlukan suatu ketelitian yang cukup tinggi agar diperoleh hasil yang akurat. Sehingga nantinya dapat menghindari kesalahan yang fatal. Dalam analisis ini, kesalahan hasil tidak boleh lebih dari 10 %, akan tetapi hal ini tergantung pula pada alat yang digunakan (Ritschel, 1976). Dalam sebuah analisis obat dalam cairan hayati, ada hal-hal penting dalam farmakokinetika yang digunakan sebagai parameter- parameter antara lain : Tetapan laju invasi atau tetapan absorpsi. Volume distribusi : menghubungkan jumlah obat dalam tubuh dengan konsentrasi obat (C) di dalam darah atau plasma. Ikatan protein. Laju eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t1/2) Clearence ginjal, ekstrarenal dan total Luas dibawah kurva dalam plasma (AUC) Ketersediaan hayati Parameter di atas diperoleh dari perubahan konsentrasi bahan obat dan metabolitnya dalam cairan darah (darah, plasma, serum) dan dalam urin terhadap waktu. Kedua cairan tersebut mudah dilewati dan konsentrasi dalm darah yaitu alat transportnya, mencerminkan proses kinetika dalam organisme (Mutschler, 1991).

C. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah labu takar 100 mL, pipet volume, tabung reaksi, pipet ukur 0.5mL, 1mL, 5mL, spektrofotometer, skalpel, sentrifuge, stopwatch, kalkulator, dan kertas grafik numerik. Bahan yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah Asam trikloroasetat (TCA) 20%, Natrium Nitrit 10%, Amonium sulfamat 15%, Parasetamol, Natrium Hidroksida 10%, HCl 6N, antikoagulan, dan darah.

D. Cara Kerja Pembuatan Larutan Stok Ditimbang 100 mg parasetamol dan dilarutkan dengan aquadest panas secukupnya.

Dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL kemudian di-add aquades sampai tanda.

Penetapan OT Dipipet 4 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL.

Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L larutan intermediet, sehingga diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL.

Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan dengan vortex, lalu di-sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N Ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO210 % dan dihomogenkan dengan vortex. Didiamkan selama 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45 menit, untuk pengukuran OT. Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %.

Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10% di-add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit. Baca absorbansi pada panjang gelombang teoritis (430 nm), untuk pengukuran OT Penetapan max

Dipipet 4 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL, sehingga diperoleh larutan intermediet 400 g/mL.

Diambil sebanyak 250 L plasma ditambah 250 L larutan intermediet, sehingga diperoleh larutan parasetamol dengan konsentrasi 200 g/mL.

Dicampur homogen lalu ditambah 2 mL TCA 20%, dihomogenkan dengan vortex, lalu di-sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

Diambil sebanyak 1,5 mL, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N Ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO2 10 % dan dihomogenkan dengan vortex. Didiamkan selama OT. Ditambahkan 1 mL Amonium Sulfat 15 %.

Ditambahkan 3,5 mL NaOH 10% di-add aquadest hingga 10 m dan didegasing 10 menit. Discan max pada range 400-480 nm, untuk pembacaan Pembuatan Kurva Baku Dari larutan stok yang ada, dipipet sebanyak 3; 3,5; 4; 5; 7 mL dan kemudian diadd 10 mL.

max.

Diperoleh seri kadar larutan intermediet 300, 350, 400, 500, 700 g/mL. Masing-masing intermediet diambil sebanyak 250 L, kemudian ditambah 250 L plasma.

Kemudian didapatkan seri larutan baku dengan konsentrasi 150, 175, 200, 250, 350 g/mL

Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di-add aquades 10 mL.

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,.

Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit Dibaca absorbansi padamax.

Pembuatan Blanko Diambil sebanyak 250 L aquades dan 250 L plasma.

Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Diambil 1,5 mL, kemudian di-add aquades 10 mL.

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT.

Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,. Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit

Dibaca absorbansi pada

max.

Pembuatan dan Penetapan Kadar Sampel

Stok sampel dibuat dengan cara: ditimbang 50 mg parasetamol dan dilarutkan dengan aquadest panas secukupnya.

Dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL kemudian di-add aquades sampai tanda.

Untuk mendapatkan larutan intermediet untuk sampel, dipipet sebanyak 3, 4, dan 7 mL dari larutan stok, kemudian di-add hingga 10 mL. Masing-masing larutan intermediate diambil 250 L kemudin ditambahkan

dengan 250 L plasma sehingga didapatkan kadar larutan intermediet sebesar 150, 200, 350 g/mL. Dicampur homogen dan ditambah sebanyak 2 mL TCA, di-vortex, lalu disentrifuge dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.

Diambil 1,5 mL, kemudian di-

add aquades 10 mL.

Ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan ditambahkan (perlahan) 1 mL NaNO2 10 %, dihomogenkan dengan vortex, lalu didiamkan OT. Ditambah 1,0 mL Amonium Sulfamat 15 %, ,.

Ditambah 3,5 mL NaOH 10 % add aquadest hingga tanda, di-degassing 10 menit Dibaca absorbansi pada Dihitung : Perolehan Kembali (recovery) = Kesalahan Sistematik = 100 P% Kesalahan Acak = x 100% = P %max.

E. Data dan Analisis Data

1. Penetapan Operating Time (OT) dan Penentuan max Parasetamol Penimbangan Parasetamol untuk Penentuan OT dan Penentuan max Berat Kertas Berat Kertas + Zat Berat Kertas + Sisa Berat Konsentrasi Stok : 0,3908 g 0,4969 g 0,3967 g 0,1002 g = 100,2 mg

Penetapan Operating Time (OT) Waktu (menit) Absorbansi 5 0,103 10 0,104 15 0,110 20 0,086 25 0,104 30 0,119 35 0,122 45 0,172 Berdasarkan data di atas, tidak diperoleh absorbansi yang stabil sehingga operating time yang digunakan adalah operating time teoritis parasetamol, yaitu 15 menit. A B r y = 0,0811 = 1,4677 x 10-3 = 0,7669 = 1,46877 x 10-3 x + 0,081

Kurva Baku Waktu vs Absorbansi0.2 0.18 0.16 0.14 Absorbansi 0.12 y = 0.0015x + 0.0811 R = 0.5882

0.10.08 0.06 0.04 0.02 0 0 10 20 30 40 50 Waktu (menit)

Series1 Linear (Series1)

Penetapan max Parasetamol Scanning menggunakan panjang gelombang 425-450 nm. Dari hasil scanning diperoleh panjang gelombang maksimum 432,5 nm dengan absorbansi 0,117.

2. Pembuatan Seri Larutan Baku Parasetamol Penimbangan Larutan Stok Parasetamol Berat Kertas Berat Kertas + Zat Berat Kertas + Sisa Berat 0,3908 g 0,4969 g 0,3967 g 0,1002 g = 100,2 mg

Konsentrasi Stok :

Seri Larutan Intermediet Parasetamol (g/mL) C1.V1 = C2.V2 1002 g/mL . 3 mL = C2 . 10 mL C2 = 300,6 g/mL C1.V1 = C2.V2 1002 g/mL . 3,5 mL = C2 . 10 mL C1.V1 = C2.V2 1002 g/mL . 5 mL = C2 . 10 mL C2 = 501 g/mL C1.V1 = C2.V2 1002 g/mL . 7 mL = C2 . 10 mL

C2 = 350,7 g/mL C1.V1 = C2.V2 1002 gmL . 4 mL = C2 . 10 mL C2 = 400,8 g/mL

C2 = 701,4 g/mL

Seri Larutan Baku Internal Parasetamol(g/mL) C1.V1 = C2.V2 300,6 g/mL . 250 L = C2 . 500 L C2 = 150,3 g/mL C1.V1 = C2.V2 350,7 g/mL . 250 L = C2 . 500 L C2 = 175,35 g/mL C1.V1 = C2.V2 400,8 g/mL . 250 L = C2 . 500 L C2 = 200,4 g/mL C1.V1 = C2.V2 501 g/mL . 250 L = C2 . 500 L C2 = 250,5 g/mL C1.V1 = C2.V2 701,4 g/mL . 250 L = C2 . 500 L C2 = 350,7 g/mL

3. Pengukuran Absorbansi Seri Larutan Baku Parasetamol Kelompok A1 : Kadar Terhitung (g/mL) 150,3 175,35 200,4 250,5 350,7 Blangko A = 0,1287 B = 2,6647 x 10-4 Absorbansi 0,269 0,109 0,127 0,194 0,245 0

r = 0,2999 y = 2,664 x 10-4x + 0,1287

Kurva Baku Konsentrasi (g/mL) vs Absorbansi A10.3 0.25 Absorbansi 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 Kadar (g/mL) 300 400 Series1 Linear (Series1) y = 0.0003x + 0.1287 R = 0.09

Kelompok A2 : Kadar Terhitung (g/mL) 150,3 175,35 200,4 250,5 350,7 Blangko A = 0,0522 B = 4,2216 x 10-4 r = 0,9960 y = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522 (kurva baku yang digunakan) Absorbansi 0,115 0,128 0,133 0,162 0,199 0

Kurva Baku Konsentrasi (g/mL) vs Absorbansi A20.25 0.2 Absorbansi 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 Kadar (g/mL) 300 400 Series1 Linear (Series1) y = 0.0004x + 0.0522 R = 0.992

Kelompok A3 Kadar Terhitung (g/mL) 150,3 175,35 200,4 250,5 350,7 Blangko A = 0,0238 B = 6,7066 x 10-4 r = 0,9872 y = 6,7066 x 10-4 x + 0,0238 Absorbansi 0,134 0,141 0,154 0,180 0,266 0

Kurva Baku Konsentrasi (g/mL) vs Absorbansi A30.3 0.25 Absorbansi 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 100 200 Kadar (g/mL) 300 400 Series1 Linear (Series1) y = 0.0007x + 0.0238 R = 0.9746

4. Pengukuran Kadar Parasetamol dalam Sampel Kelompok A1 Penimbangan Parasetamol (g/mL) Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat 0,3994 g 0,4496 g 0,3998 g 0,0498 g = 49,8 mg

Konsentrasi larutan stok sampel: Cinduk = Konsentrasi larutan intermediet: V1 x C1 = V2 x C2 = 298,8 g/mL 3 mL x 996 g/mL = 10 mL x C2 C2 V1 x C1 Konsentrasi larutan 250 L sampel + plasma 250 L: = V2 x C2 = 149,4 g/mL (kadar teoritis) 250 L x 298,8 g/mL = 500 L x C2 C2

Sampel

Absorbansi

Kadar Teoritis Kadar Sebenarnya Recovery

CV(%)

(g/mL) Replikasi I Replikasi II Replikasi III 0,090 0,084 0,087 149,4

(g/mL) 89,5395 75,3269 82,4332 82,4332

(%) 59,9327% 50,4196% 55,1762% 55,1762% x 100% = 8,6207%

SD = % CV = = x 100% = 8,6207 % x 100%= 59,9327% x 100%= 50,4196% x 100%= 55,1762%

7.1063

% Recovery Sampel 1 = % Recovery Sampel 2 = % Recovery Sampel 3 =

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 59,9327% = 40,0673% Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 50,4196% = 49,5804% Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 55,1762% = 44,8238%

Kelompok A2 Penimbangan Parasetamol (g/mL) Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat 0,3998 g 0,4555 g 0,4013 g 0,0541 g = 54,1 mg

Konsentrasi larutan stok sampel: Cinduk = Konsentrasi larutan intermediet: V1 x C1 C2 = V2 x C2 = 432,8 g/mL 4 mL x 1082 g/mL = 10 mL x C2

Konsentrasi larutan 250 L sampel + plasma 250 L: V1 x C1 = V2 x C2 250 L x 432,8 g/mL = 500 L x C2

C2

= 216,4 g/mL (kadar teoritis)

Sampel Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Absorbansi 0,124 0,150 0,154

Kadar Kadar Teoritis Sebenarnya (g/mL) (g/mL) 170,0777 216,4 g/mL 231,6657 241,1408 214,2947

Recovery (%) 78,5941

CV(%)

x 107,0544 111,4329 99,0271 100% = 18,0056%

SD = % CV = x 100% = 18,0056% x 100%= 78,5941% x 100%= 107,0544% x 100%= 111,4329%

38.5850

% Recovery Sampel 1 = % Recovery Sampel 2 = % Recovery Sampel 3 =

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 78,5941% = 21,4059% Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 107,0544% = -7,0544% Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 111,4329% = -11,4329%

Kelompok A3 Penimbangan Parasetamol (g/mL) Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat 0,4038 g 0,4535 g 0,4033 g 0,0502 g = 50,2 mg

Konsentrasi larutan stok sampel: Cinduk = Konsentrasi larutan intermediet: V1 x C1 7 mL x 1004 g/mL C2 = V2 x C2 = 10 mL x C2 = 702,8 g/mL

Konsentrasi larutan sampel + plasma 250 L: V1 x C1 C2 Sampel Replikasi I Replikasi II Replikasi III Absorbansi 0,266 0,257 0,274 351,4 g/mL = V2 x C2 = 351,4 g/mL (kadar teoritis) Kadar Teoritis Kadar Sebenarnya Recovery (g/mL) (g/mL) (%) 506,443 485,124 525,393 505,653 114,121 138,055 149,514 133,897 CV(%) x 100% = 2,8887% 250 L x 702,8 g/mL = 500 L x C2

SD = % CV = x 100% = 2,8887% x 100% = 114,121% x 100% = 138,055% x 100% = 149,514%

14.607

% Recovery Sampel 1 = % Recovery Sampel 2 = % Recovery Sampel 3 =

Kesalahan sistematis sampel 1= 100% - 114,121% = -14,121% Kesalahan sistematis sampel 2 = 100% - 138,055% = -38,055% Kesalahan sistematis sampel 3= 100% - 149,514% = -49,514%

Perhitungan Kadar Sebenarnya Parasetamol dalam Sampel 149,4 g/mL Replikasi Kadar Sebenarnya : y =4,2216 x 10-4x + 0,0522 1 0,090 = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522 x = 89,5395 g/mL Replikasi Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 2 0,084 = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522 x = 75,3269 g/mL Replikasi Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 3 0,087 = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522 x = 82,4332 g/mL 216,4 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,124 = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522 x = 170,0777 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,150 = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522 x = 231,6657 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,154 = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522 x = 241,1408 g/mL 351,4 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,266 =4,2216 x 10-4 x + 0,0522 x = 506,443 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,257 = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 x = 485,124 g/mL Kadar Sebenarnya : y = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 0,274 = 4,2216 x 10-4x + 0,0522 x = 525,393 g/mL

F. Pembahasan Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk menentukan kadar parasetamol dalam plasma dengan metode Chafetz (secara kolorimetri). Prinsip dari kolorimetri adalah pengukuran absorbansi dari zat yang semula tak berwarna diubah menjadi berwarna (direaksikan dengan zat tertentu) yang kemudian diukur serapannya pada daerah tampak/visible (diantara 400-800 nm). Pengukuran ini sendiri didasarkan pada hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert menyatakan bahwa intensitas sinar keluar akan menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal dari zat penyerap. Hukum Beer menyatakan bahwa intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan konsentrasi zat penyerap. Secara matematis, Hukum Lambert-Beer dapat dituliskan menjadi : A=bc dimana: A = absorbansi = daya serap molar b = tebal zat penyerap c = konsentrasi zat penyerap Penggunaan spektrofotometri visibel (untuk pengukuran absorbansi kolorimetri) merupakan jenis spektrofotometri serap yang mengukur serapan radiasi elektromagnetik pada tertentu yang sempit (mendekati monokromatik) yang diserap oleh zat. Prinsip dasar dari spektrofotometri visible adalah senyawa uji yang dikenai radiasi elektromagnetik (REM) berupa cahaya tampak ( diantara 400-800 nm), bila energi REM sesuai dengan energi yang dibutuhkan untuk transisi ke excited state dari ground state, maka elektron akan tereksitasi. Di tingkat eksitasi, elektron akan berada pada keadaan yang tak stabil dan cenderung akan kembali ke ground state sambil melepaskan energi emisi. Cahaya yang dipancarkan ke senyawa, ada yang diabsorbsi dan ada juga yang diteruskan, oleh detektor dengan sistem read out, akan diperoleh angka absorbansi zat uji tersebut. Perbedaan kolorimetri dengan spektrofotometri lainnya adalah:

Perbedaan

Kolorimetri

Spektrofotometri

Spektrofotometri

Visibel Ada atau tidaknya Senyawa warna senyawa diuji dari diukur yang merupakan senyawa tak yang yang Senyawa

UV yang Senyawa yang

diukur dari asalnya diukur merupakan sudah yang warna. memiliki senyawa yang tak memiliki warna.

berwarna, kemudian

dibuat berwarna, baru diukur. yang digunakan Kuvet digunakan 400-800 nm 400-800 nm 200-400 nm yang

yang Kuvet digunakan

yang Kuvet

yang Kuvet

digunakan terbuat digunakan terbuat dari gelas dari kuarsa dibutuhkan

terbuat dari gelas Ada/tidaknya OT Adanya

OT Tidak

dibutuhkan Tidak OT

(Operating Time) OT untuk mengetahui absorbansi yang dihasilkan sudah stabil/tidak.

Kriteria analisis kolorimetri yang baik adalah: 1. Kesebandingan antara warna dan konsentrasi: intensitas warna hendaknya meningkat secara linear dengan naiknya konsentrasi zat yang akan ditetapkan. 2. Kestabilan warna: warna yang dihasilkan hendaknya cukup stabil untuk memberikan hasil pengukuran yang tepat. 3. Reprodusibilitas: hasil yang didapat harus dapat diulang jika dilakukan pada kondisi yang sama. 4. Kejernihan larutan: larutan harus bebas dari endapan agar tidak terjadi penghamburan cahaya maupun menyerap cahaya, yang akan mengganggu hasil pengukuran.

5. Kepekaan tinggi: diharapkan reaksi warna sangat peka walaupun pada zat dengan konsentrasi/ kuantitas yang kecil, namun menyerap kuat pada daerah tampak, bukan pada daerah UV. Asetaminofen/parasetamol dapat diukur kadarnya dengan berbagai metode, antara lain spektrofotometri UV, kromatografi gas dan HPLC. Meskipun sudah terdapat metode kromatografi untuk penetapan kadarnya, metode spektrofotometri masih sering digunakan di dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan metode ini relatif mudah, ekonomis, dan cepat dalam pengerjaannya (dibandingkan dengan metode kromatografi). Metode kolorimetri untuk parasetamol atau yang dikenal dengan metode Chafetz merupakan salah satu metode penetapan kadar parasetamol secara spektrofotometrik. Metode ini didasarkan pada reaksi nitrasi pada cincin benzen dari parasetamol. Reaksi nitrasi merupakan reaksi pembentukan warna pada parasetamol yang merupakan reaksi substitusi aromatik elektrofilik (SAE). Dalam reaksi nitrasi, yang digunakan sebagai agen penitrasi merupakan HNO2/asam nitrit. HNO2 merupakan gas pada suhu kamar. Oleh karenanya, untuk mendapatkan HNO2 dengan mudah, garam NaNO2 direaksikan dengan HCl yang kemudian didiamkan beberapa saat agar reaksi berjalan dengan sempurna. Reaksi yang terjadi:

Gambar 1. Mekanisme pembentukan ion nitrosonium

Elektofil yang terbentuk kemudian akan menyerang cincin benzen dari parasetamol yang bersifat nukleofil. Gugusan nitro kemudian dapat masuk pada posisi orto marupun para pada cincin benzen. Hal ini dikarenakan pada parasetamol terdapat dua gugusan bersifat aktivator (gugus OH dan NH2) yang mengarahkan substituen ke arah para ataupun orto untuk substitusi berikutnya. Namun karena pada posisi para telah terisi oleh gugus amida (NH-CO), maka gugus nitro kemudian akan masuk pada posisi orto dari cincin benzen.

Gambar 2. Mekanisme reaksi nitrasi pada parasetamol. (A) struktur dari asetaminofen (p-asetamidofenol); (B) 2-nitro-4-asetamidofenol, terbentuk dari hasil nitrasi dengan asam nitrit; dan (C) anion 2-nitro-4asetamidofenol yang merupakan gugusan kromofor yang memberikan warna kuning dengan serapan maksimum pada 430 nm (Balley, 1982).

Pada gambar, terlihat bahwa gugus kromofor dari parasetamol mengalami perpanjangan. Pemanjangan gugus kromofor ini akan memperpanjang panjang gelombang yang dapat diserap oleh parasetamol. Pemanjangan ini dinamakan dengan pergesaran batokromik. Pada reaksi, penambahan asam sulfamat bertujuan untuk menghilangkan sisa HNO2 yang mungkin terbentuk pada reaksi :

Oleh karena pada reaksi terbentuk gas N2, maka sebelum dilakukan pengukuran, perlu dilakukan degassing untuk menghilangkan gas yang terbentuk dengan memberikan getaran ultrasonik pada larutan. Hal ini dilakukan agar N 2 yang terbentuk tidak mengganggu saat pengukuran absorbansi dari larutan yang diuji. Pada percobaan digunakan plasma yang berasal dari darah tikus. Darah tikus tersebut diambil dari daerah sinus orbitalis (mata) dan harus ditambahkan antikoagulan untuk mencegah penggumpalan darah, antikoagulan yang digunakan adalah heparin. Setelah penambahan heparin, darah disentrifuge untuk memisahkan plasma (cairan yang berwarna jernih/supernatan) dari sel-sel darah. Plasma lebih dipilih untuk digunakan daripada serum karena dalam plasma terdapat protein (yang mengikat obat) yang tidak ikut mengendap sehingga obat masih ada di dalam plasma yang nantinya akan diukur kadarnya. Tujuan sentrifugasi yaitu untuk mempercepat pengendapan protein sehingga plasma lebih mudah diperoleh, prinsip sentrifugasi ini yaitu pemisahan zat berdasarkan bobot molekulnya. Plasma yang didapat ditambahkan TCA 20% untuk merusak struktur sekunder dan tersier protein yaitu dengan merusak sulfida yang merupakan pembentuk kedua struktur tersebut, akibatnya protein akan mengendap sementara obat tetap berada di dalam plasma. Jika tidak diendapkan maka protein plasma yang dapat berikatan dengan parasetamol akan membentuk molekul yang lebih besar, sehingga dapat mengganggu analisis. Reaksi TCA dengan protein plasma adalah sebagai berikut :

TCA merupakan asam kuat yang memiliki keelektronegatifan yang besar sehingga mampu menarik protein membentuk suatu ikatan. Ikatan ini bersifat reversible karena ikatan yang terjadi antara obat dengan protein plasma adalah ikatan lemah (Van der Walls). Selain itu, karena ikatan obat dengan protein bersifat non-spesifik artinya satu tempat bisa ditempati oleh banyak senyawa

dengan cara mendesak senyawa lain. Oleh karena itu setelah penambahan TCA, larutan kemudian divortex untuk menghomogenkan campuran ini. Supernatan yang diperoleh kemudian diukur kadar parasetamolnya dengan menggunakan metode Chafetz (metode kolorimetri). Plasma darah ini direaksikan dengan HCl 6N, HCl 6N berfungsi menghidrolisis parasetamol dan memberikan suasana asam. Hasil hidrolisis parasetamol akan bereaksi dengan Na nitrit (NaNO2) 10% dan membentuk garam diazonium, larutan campuran parasetamol HCl 6N dan Na nitrit (NaNO2 ) 10% didiamkan selama 15 menit agar pembentukan garam diazonium berlangsung sempurna. Kemudian setelah pendiaman selama Operating Time (15 menit) ditambahkan Asam sulfamat 15 % untuk menghentikan reaksi antara NaNO 2 (Natrium nitrit) dengan parasetamol dalam pembentukan garam diazonium yaitu dengan cara menghilangkan NaNO2 yang berlebihan. Lalu dilakukan penambahan NaOH tujuannya untuk memperpanjang gugus kromofor sehingga warna yang terbentuk akan semakin jelas.

Penetapan Operating Time Dan Panjang Gelombang Maksimum Pada saat akan dilakukan penetapan kadar, sebelumnya harus dilakukan penetapan OT dan max. Tujuan dari penetapan OT adalah untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan untuk memperoleh serapan yang stabil/ konstan dan maksimal. Hal ini menunjukkan reaksi pembentukan senyawa berwarna yang terbentuk sudah stabil/ sempurna, sehingga dihasilkan pembacaan absorbansi yang maksimal juga. Setelah didapatkan OT dari reaksi, dilakukan penetapan max. Panjang gelombang maksimum (max) merupakan panjang gelombang dimana serapan yang terjadi adalah maksimum. Pengukuran absorbansi dilakukan pada max karena dengan perubahan konsentrasi yang kecil, dapat memberikan absorbansi yang berbeda dengan signifikan (lebih sensitif). Hal ini menyebabkan pengukuran menjadi lebih peka dan teliti. Pada percobaan yang telah dilakukan, pada saat penetapan OT, tidak diperoleh serapan yang konstan. Serapan yang dihasilkan memberikan nilai yang fluktuatif. Hal ini membuat praktikan menggunakan OT sebesar 15 menit, sesuai

dengan OT teoritis yang terdapat pada metode Chafetz. Untuk pengukuran max sendiri diperoleh nilai sebesar 432,5 nm ( teoritis sebesar 430 nm).

Kurva Baku Parasetamol Kurva baku parasetamol dibuat dengan membuat seri larutan baku dari larutan stok parasetamol. Digunakan 5 seri konsentrasi parasetamol yaitu 150, 175, 200, 250, 350 g/mL. Pengukuran larutan tersebut dilakukan pada panjang gelombang maksimum parasetamol yaitu 432,5 nm. Dari hasil pengukuran, absorbansi yang diperoleh secara berturut-turut yaitu 0,269; 0,109; 0,127; 0,194; 0,245. Dari hasil absorbansi masing-masing seri larutan, didapatkan persamaan regresi linier y = 2,664 x 10-4x + 0,1287 dengan nilai r = 0,2999. Persamaan kurva baku tersebut tidak digunakan untuk menghitung kadar parasetamol dalam sampel, tetapi digunakan regresi linear milik kelompok A2, yaitu y = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522 dengan nilai r = 0,9960. Pada penetapan kadar sampel, secara teoritis diperoleh kadar rata-rata sampel I = 149,4 g/mL; sampel II = 216,4 g/mL; dan sampel III = 351,4 g/mL. Sedangkan dari hasil pengukuran diperoleh kadar rata-rata Sampel konsentrasi I = 82,4332 g/mL; Sampel konsentrasi II = 214,2947 g/mL dan Sampel konsentrasi III = 505,653 g/mL.

Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak Dan Kesalahan Sistematik Berdasarkan hasil percobaan diperoleh rata-rata % recovery larutan parasetamol dalam plasma dengan konsentrasi 149,4 g/mL = 55,1762%; 216,4 g/mL = 99,0271%; dan 351,4 g/mL = 133,897%. Menurut Munja dan Hanwar (2003), akurasi yang baik untuk kadar kecil adalah 90%-100%, untuk kadar obat yang lebih besar yaitu 95%-105%, akurasi untuk bahan baku biasanya 98%-102%, sedangkan rentang akurasi untuk bioanalisis yang masih dapat diterima yaitu 80%-120%, nilai % recovery tidak ada yang memenuhi persyaratan, kecuali pada konsentrasi 200 g/mL. Hal ini terjadi kemungkinan karena banyak sampel yang hilang selama preparasi (pada konsentrasi 149,4 g/mL) dan karena masih terdapat kandungan zat lain sehingga % recovery terlalu besar (pada konsentrasi 351,4 g/mL)

Untuk kesalahan sistematik dari larutan parasetamol dalam plasma diperoleh pada replikasi I = 40,0673%; replikasi II = 49,5804%; replikasi III = 44,8238%. Semua kesalahan sistematik tersebut tidak memenuhi syarat karena menurut Munja dan Hanwar (2003), kesalahan sistematik yang baik yaitu kurang dari 10%. Kesalahan sistematis merupakan selisih antara 100% kadar dengan % recovery. Untuk persen kesalahan acak masing-masing sampel yaitu Sampel konsentrasi I = 8,6207 %, Sampel konsentrasi II = 18,0056 % dan Sampel konsentrasi III = 2,8887 %. Menurut Munja dan Hanwar (2003), harga CV (kesalahan acak) yang baik adalah kurang dari 2%, sedangkan untuk bioanalisis CV dengan rentang 15-20% masih dapat diterima. Dari hasil perhitungan, %CV yang didapat dari semua sampel memenuhi persyaratan. Untuk linearitas, dari percobaan diperoleh persamaan kurva baku kelompok A1: y = 2,664 x 10 -4 x + 0,1287; A2: y = 4,2216 x 10 -4 x + 0,0522; A3: y = 6,7066 x 10-4 x + 0,0238 dengan nilai koefisien korelasi (r) berturut-turut (dari A1 hingga A3) adalah 0,2999; 0,9960; 0.9872. Persamaan ini selanjutnya digunakan dalam penentuan kadar terukur dari sampel. Salah satu jaminan suatu metode dikatakan memenuhi syarat linearitas, nilai yang diharapkan adalah untuk b mendekati 0 dan r = 1 tergantung arah garisnya. Suatu metode dikatakan memenuhi syarat linearitas jika nilai r tidak kurang dari 0,999. Dari tiga kelompok yang ada, nilai r yang didapatkan kurang dari 0,999 maka dari itu dapat disimpulkan bahwa untuk paramater linearitas, baik kelompok A1 hingga A3, ketiganya masih belum memenuhi parameter linearitas.

G. Kesimpulan 1. Prinsip penetapan kadar parasetamol dengan metode Chafetz (metode kolorimetri) adalah pengukuran absorbansi dari zat yang semula tak berwarna diubah menjadi berwarna (direaksikan dengan zat tertentu) yang kemudian diukur serapannya pada daerah tampak/visible (diantara 400800 nm). 2. Persamaan kurva baku yang diperoleh kelompok A1: y = 2,664 x 10-4x + 0,1287; A2: y = 4,2216 x 10-4 x + 0,0522; A3: y = 6,7066 x 10-4 x + 0,0238 dengan nilai koefisien korelasi (r) berturut-turut (dari A1 hingga A3) adalah 0,2999; 0,9960; 0,9872. Persamaan yang digunakan untuk melakukan perhitungan adalah regresi kelompok A2. 3. Hasil recovery (perolehan kembali) yang didapat untuk sampel kadar 149,4 g/mL adalah 59,9327% (replikasi I), 50,4196% (replikasi II), 55,1762% (replikasi III); 216,4 g/mL adalah 78,5941% (replikasi I), 107,0544% (replikasi II), 111,4329% (replikasi III); dan 351,4 g/mL adalah 114,121% (replikasi I), 138,055% (replikasi II), 149,514% (replikasi III). 4. Hasil kesalahan sistematik yang didapat untuk sampel dengan kadar 149,4 g/mL adalah 40,0673% (replikasi I), 49,5804% (replikasi II), 44,8238% (replikasi III); 216,4 g/mL adalah 21,4059% (replikasi I), -7,0544% (replikasi II), -11,4329% (replikasi III); dan 351,4 g/mL adalah -14,121% (replikasi I); -38,055% (replikasi II), -49,514% (replikasi III). 5. Hasil kesalahan acak yang didapat untuk sampel dengan kadar 149,4 g/mL adalah 8,6207%; 216,4 g/mL adalah 18,0056% dan 351,4 g/mL adalah 2,8887%.

H. Daftar Pustaka Anonim a, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 765, Depkes RI, Jakarta Anonim b, 1995, United States of Pharmacopeica, 23rd ed, 1932-1983, New York, United State of America Chafetz et al., 1971, Selective Colorimetric Determination of Acetaminophen, J.Pharm. Sci.,60 93), 463-466 Chamberlain, J., 1995, The Analysis of Drugs in Biological Fluids, 2 rd ed., 39-40, 84, CRC Press Inc, New York Chambers dan Jones, 1976, Comparison of a Gas Chromatographic and Colorimetric Method for the Determination of Plasma Paracetamol. Ann. Clinn. Biochem., 13(4),433-4 Katzung, 1989, Basic and Clinical Pharmacology, diterjemahkan oleh Binawati, H.K., Budi, I., Christianto, S., Hermawan, S., Yurita, H.H., Gunadi, B., Petrus, A., edisi 3, 3, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Montgomery et al., 1992, BioChemistry: A Case Oriented Approach, Alih bahasa Staff Pengajar FKUI. Edisi V, Jilid I, 80-91, Binarupa Aksara, Jakarta Mulja, M., Hanwar , D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Laboratorium yang Baik, Majalah Farmasi Airlangga, Volume VI, 73, Airlangga University Press, Surabaya Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Cetakan Pertama, 6-9, Airlangga University Press, Surabaya Mutschler, Ernst, 1991, Dinamika Obat, ed. V, hal 16-17, 36 , 90, Pnenrbit ITB, Bandung Rang et al., 2003, Pharmacology, 5th Ed., 96-97, Chorchill Livingstone, Ednburg, London, New York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto Ritschel, W. A, 1976, Handbook of Basic Pharmacokinetics, 1st edition, hal 78, Drug Inteligence Publication Inc. Hamillton, USA Roth, H.J., Blaschke, 1981, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh sarjoko Kisman dan Slamet Ibrahim, 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Skoog, A., D., West, M., Donald, J., F., 1994, Analytical Chemistiy, 6rh ed, 161195, Saunde College Publishing, United Stated of America Stalcup et al., 1995, Medwork: Anatomy and Physiology, Chapter 13, section 2.2, page 2 of 2, Victory Technology Inc.

Widdop, B., 1986, Hospital Toxicology and Drug Abuse Screening, in Moffat A. C.,Jackson J.V., Moss, M.S., Widdop, B.,Greenfield, E.S., (Eds) Clarkes Isolation and Identification of Drug in Pharmaceutical, Body Luids, and Post Mortem Material, 2nd Ed., 23, The Pharmaceutical Press, London Wilmana, P.F., 1995, Analgesik-Antipiretik, Analgesik Anti-Inflamasi Nonsteroid dan Obat Pirai, dalam Ganiswara, S.G., Farmakologi dan Terapi, Edisi IV, 214, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran-Universitas Indonesia, Jakarta