Yg bingung :-perhitungan Tm ama gc content itu termasuk bagian overhang dan ekstensi lainnya ga dlm primer- cara milih host yg bener- kuis 2: td kan di soal bilang, kalau gen of interest akan diletakkan di NdeI dan BamHI. Jd di primer forward, kita taro RE utk NdeI atau BamHI yah? Berarti posisi goi nya kebalik dong kan-Cara tau plasmid yang kompatibel buat host-teknis penambahan promotor (harus komplemen sama promotor e.colinya gimana) untuk ekspresi protein

Jawaban dr pak Sahlan- Tm, GC content dihitung dari primer yang TELAH dimodifikasi. Untuk annealing site diusahakan 6 - 10 (untuk spesifisitas). Jadi didesain dulu baru dihitung Tm dan GC content.- Cara milih host yg benar dan kompatibel dilihat dari ORI (origin of replication) dari plasmid tersebut, biasanya dikasih tau ini ORI nya cocok sama E.coli apa aja. - ORI itu buat replikasi aja, jadi kalo mao diekspresikan dilihat lagi promoter yang ada di E.coli tersebut. Kalo ga ada promoternya di plasmid, tambahin lagi di desain primer, yang penting ga kepotong. (Promotor itu bentuknya kodon juga).- Kalo di plasmid sudah ada promotor yang kompatibel ga usah ditambahin lagi di primer. Biarpun dia jaraknya jauh gapapa karena nanti bakal muter pas mao di transkripsi, dan bakal memulai replikasi kalo udah ketemu start codon.- Pemilihan restriction site mana yang dipake di depan start atau stop dilihat dari arah cloning site nya (biasanya kan ada lacZ nya gtu trus ada panahnya). Jadi kalo cloning site nya dimulai dari NdeI sampai BamHI, NdeI buat forward primer, BamHI buat reverse primer. Ga boleh kebalik karena nanti urutan kodon berubah, ekspresinya juga berubah.

Kalo ada yang gw salah ngerti maafkan ya. Boleh diverifikasi sama yg nanya bareng" tadi (Astrid, Ambar, dan Clarjo). 

Karena ini detail"nya ribet (cth: gapapa kan kalo promoternya jauh; di website susah nyari kompatibilitasnya; perlu overhang apa ngga; annealing sitenya mao sepanjang apa; kalo kepanjangan desainnya gimana), gw juga takut salah ngerti apa yg pak Sahlan maksud, jd boleh di tanya lsg ke pak Sahlan ya.