percobaan 34c rs
DESCRIPTION
Mikrobiologi LingkunganTRANSCRIPT
Percobaan 34 C: Denitrifikasi
I. TUJUAN
1. Mengetahui proses denitrifikasi pada aktivitas mikrobiologi tanah.
2. Menunjukkan reduksi nitrat menjadi gas nitrogen (N2).
3. Mengetahui jenis bakteri yang mampu melakukan denitrifikasi.
II. PRINSIP
Setelah nitrifikasi, proses selanjutnya dalam siklus nitrogen adalah
denitrifikasi. Proses ini merupakan pembentukan gas Nitrogen dengan
mereduksi senyawa hasil nitrifikasi, yaitu nitrat secara bertahap. Percobaan ini
menggunakan medium yang mengandung nitrat, substrat untuk pembentukan
gas nitrogen dan tabung durham untuk mendeteksi evolusi gas nitrogen. Gas
Nitrogen yang terbentuk dapat dideteksi dengan kehadiran gelembung gas di
tabung durham. Denitrifikasi tidak terjadi jika di dalam tabung durham tidak
terdapat gas.
III. TEORI DASAR
Proses denitrifikasi merupakan bagian dari siklus nitrogen nitrogen.
Denitrifikasi secara umum merupakan proses reduksi nitrat (NO3-) secara
bertahap menjadi nitrit (NO2-), Nitrouse Dioxide (N2O), Nitrouse Oxide
(NO), sampai menjadi N2.
Ada dua tahap konversi dalam proses denitrifikasi yaitu :
1. Tahap nitrat menjadi nitrit
2. Tahap nitrit menjadi gas nitrogen
Sehingga keseluruhan proses secara berurutan adalah :
NO3 NO2 NO N2O N2
Gambar 1. Posisi Denitrifikasi dalam siklus Nitrogen
Reduksi nitrat menjadi nitrit pada mikroorganisme fakultatif anaerob
terjadi pada kondisi tanpa oksigen atau kondisi anaerob. Pada proses ini,
bakteri menggunakan senyawa anorganik seperti nitrat atau sulfat sebagai
akseptor elektron terminal. Enzim nitrat reduktase mengkatalisasi transfer
elektron dari sitokrom b sehingga nitrat tereduksi menjadi nitrit. Sehingga,
jika oksigen dalam tanah kurang maka akan berlangsung denitrifikasi, yaitu
nitrat direduksi sehingga terbentuk nitrit dan akhirnya menjadi amoniak yang
tidak dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan.
Nitrogen dalam bentuk inorganic merupakan akseptor electron yang umum
digunakan dalam respirasi anaerobic. Gambar 2 di bawah merupakan tabel
bentuk-bentuk nitrogen inorganic dengan tingkat oksidasinya.
Gambar 2. Tabel Tingkat Oksidasi Nitrogen Inorganik
Gambar 3. Proses Reduksi Nitrat pada Pada Respirasi Anaerob(Sumber: Brock Biology of Microorganism)
Gambar 3 di atas menunjukkan bagaimana bakteri dapat mereuksi nitrat
pada proses respirasi secara anaerob. Bagian c menunjukkan proses reduksi
nitrat dan nitrooksida terjadi di protein integral yang dibantu dengan enzim
perisplasmic. Proses transfer electron secara aerobik, respirasi nitrat, dan
denitrifikasi pada gambar 3 tersebut dibandingkan. Enzim yang pertama kali
berperan untuk reduksi nitrat adalah nitrate reductese, sebuah “molybdenum”
yang mengandung membrane terintegrasi yang dapat menekan oksigen
(oksigen sebagai akseptor electron). Pada kondisi anoksik (tanpa oksigen),
nitrat harus selalu tersedia sebagai akseptor electron.
Produk pertama dari reduksi nitrat adalah ion nitrit. Enzim nitrit reduktase
kemudian mengubahnya menjadi NO. Beberapa organisme mereduksi nitrit
menjadi ammonia melalui proses disimilasi, dan gas nitrogen yang dihasilkan
sangat besar. Hal iniah yang menyebabkan beberapa produk denitrifikasi
seperti N2O dan NO di lingkungan sangat signifikan. N2O berubah menjadi
NO akibat adanya sinar matahari dan nitrit terbentuk akibat NO bereaksi
dengan ozon di atmosfer. Ketika hujan, nitrit akan menyebabkan hujan asam
(Madigan, 2015)
Proses denitrifikasi tidak lepas dari peranan bakteri denitrifikasi
(denitrifier). Bakteri denitrifikasi adalah kelompok bakteri yang memiliki
kemampuan untuk melakukan reaksi reduksi senyawa nitrat (NO3-) menjadi
senyawa nitrogen bebas (N2). Pada beberapa kelompok bakeri denitrifikasi,
dapat ditemukan senyawa nitrogen oksida (NO) sebagai hasil sampingan
metabolisme. Proses ini pada umumnya berlangsung secara anaerobik (tanpa
melibatkan molekul oksigen, O2).
Contoh bakteri yang mampu melakukan metabolisme ini
adalah Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, dan Paracoccus
denitrificans (Calrson & Ingraham, 1983). Sumber lain menyebutkan Bakteri
yang melakukan proses denitrifikasi meliputi Achromobacter, aerobacter,
alcaligenes, bacillus, brevibacterium, flavobacterium, micrococcus, proteus,
pseudomona dan spirillum.
Gambar 2. Proses reduksi nitrat menjadi gas nitrogen
(sumber: Brock Biology of Microorganism)
Denitrifikasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: kelembapan tinggi,
pH netral (6,8-8,0), ketersediaan karbon, kadar oksigen terlarut dan temperatur
yang tinggi.
Gambar 3. Bakteri Denitrifikasi: Pseudomonas aeruginosa
IV. ALAT DAN BAHAN
ALAT BAHAN
1. Tabung reaksi 4 + Tabung
Durham 4
2. Pembakar Bunsen
3. Jarum inokulasi
4. Pipet tetes
5. Inkubator
1. Kultur bakteri Pseudomonas
dan bakteri Bacillus sp berumur
24 jam.
2. Sampel tanah subur dah tidak
subur.
3. Kaldu nitrat
V. HASIL PENGAMATAN
Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2015 dan 1 April 2015
No. Jenis Sampel Gambar Hasil Pengamatan Keterangan
1. Bakteri
Pseudomonas
Gambar 34C-1. KondisiBakteri Pseudomonas Hari ke-7
(Sumber: Kelompok 17)
Gambar 34C-2. Kondisi BakteriPseudomonas Hari ke-14(Sumber: Kelompok 17)
Warna medium
kaldu nitrat
menjadi keruh dan
terdapat sedikit
gelembung gas
pada tabung
durham.
Pengamatan H+7
hingga H+14
menunjukkan
peningkatan
kekeruhan pada
medium.
2. Bakteri
Bacillus sp
Gambar 34C-3. Kondisi BakteriBacillus Hari ke-7
(Sumber: Kelompok 14)
Gambar 34C-4. Kondisi BakteriBacillus Hari ke-14
(Sumber: Kelompok 14)
Warna medium
kaldu nitrat
menjadi keruh dan
terdapat sedikit
gelembung gas
pada tabung
durham.
Pengamatan H+7
hingga H+14
menunjukkan
peningkatan
kekeruhan pada
medium serta
penambahan
jumlah gas di
tabung durham.
3. Tanah Subur
Gambar 34C-5. Kondisi SampelTanah Subur Hari ke-7(Sumber: Kelompok 7)
Warna medium
(kaldu nitrat)
menjadi keruh dan
terdapat sedikit
gelembung gas
pada tabung
durham. Muncul
pula endapan tanah
serta beberapa
tanah yang
mengambang di
permukaan.
Pengamatan H+7
hingga H+14
Gambar 34C-6. Kondisi SampelTanah Subur Hari ke-14(Sumber: Kelompok 7)
menunjukkan
peningkatan
kekeruhan
medium.
4. Tanah Tidak
Subur
Gambar 34C-7. Kondisi SampelTanah Tidak Subur Hari ke-7
(Sumber: Kelompok 12)
Warna medium
(kaldu nitrat)
menjadi keruh dan
terdapat
gelembung gas.
Terdapat endapan
tanah.
VI. ANALISIS
Tabel 1. Produksi gas Nitrogen pada beberapa Bakteri berdasarkan Hasil
Pengamatan
No. Sampel Produksi gas Nitrogen
1. Pseudomonas +
2. Bacillus +
3. Tanah subur +
4. Tanah tidak subur ++
Keterangan : + Positif terdapat gelembung (teramati secara kualitatif)
Pada percobaan 34-C ini, akan ditunjukkan proses denitrifikasi oleh
beberapa jenis bakteri uji, diantaranya Pseudomonas, Bacillus, serta sampel
tanah subur dan tidak subur. Bakteri yang dapat melakukan proses
denitrifikasi adalah bakteri yang mengeluarkan gas Nitrogen dari senyawa
nitrat. Percobaan ini menggunakan kaldu nitrat sebagai sumber nutrisi bakteri
untuk diubah secara bertahap menjadi nitrit, ammonia, nitrooksida, dan gas
nitrogen.
Medium yang digunakan untuk semua jenis bakteri berupa kaldu nitrat.
Medium ini akan menjadi sumber energi bagi bakteri untuk kemudian diubah
menjadi gas nitrogen. Pengamatan tidak dilakukan untuk hasil nitrit, ammonia,
dan nitrooksida. Hanya gas nitrogen yang akan diamati sebagai hasil akhir
reduksi nitrat. Gas nitrogen ditangkap oleh tabung durham. Aktivitas reduksi
nitrat menjadi gas nitrogen ini dapat diukur secara kualitatif dari banyaknya
gas nitrogen yang tertangkap di tabung durham.
Bakteri pertama yang diuji adalah Pseudomonas. Hasil pengamatan
pertama (H+7) menunjukkan terjadinya perubahan warna medium. Medium
menjadi keruh akibat adanya pertumbuhan Pseudomonas. Selain itu, pada
tabung durham ditunjukkan adanya sedikit gelembung gas. Dari hasil
pengamatan tersebut, dapat disimpulkan bahwa Pseudomonas merupakan
bakteri denitrifier. Pernyataan ini sesuai dengan literatur bahwa bakteri
bergenus Pseudomonas adalah bakteri denitrifier utama.
Bakteri selanjutnya adalah Bacillus sp. Seperti halnya Pseudomonas,
bakteri ini pun merupakan golongan bakteri denitrifier. Adanya gas yang
tertangkap di tabung dirham menunjukkan bakteri ini mampu melakukan
denitrifikasi. Hasil pengamatan sesuai dengan literatur bahwa Bacillus
merupakan bakteri denitrifier. Selain itu, kekeruhan medium kaldu nitrat
bertambah yang menunjukkan adanya aktivitas pertumbuhan bakteri Bacillus.
Idealnya, terdapat suatu kondisi yang menunjukkan pengurangan cadangan
nitrat sehingga aktivitas pertumbuhan bakteri menjadi terhenti (parameter ini
tidak diamati karena modul XII ini belum membahas pertumbuhan bakteri).
Objek yang akan diamati selanjutnya adalah sampel tanah subur. Tanah
merupakan reservoar yang baik bagi berbagai macam bakteri. Terdapat dua
jenis tanah yang diamati, yaitu tanah subur dan tanah tidak subur. Tanah subur
merupakan tanah yang bersifat sedikit asam. Percobaan terhadap tanah subur
memperoleh hasil adanya gelembung gas dan perubahan warna kaldu nitrat
menjadi lebih kuning dan keruh. Adanya gelembung gas mengindikasikan
bahwa terdapat bakteri denitrifier pada sampel tanah.
Terakhir, percobaan yang dilakukan pada tanah tidak subur diperoleh
adanya gelembung gas dan perubahan warna kaldu menjadi lebih kuning.
Adanya gelembung gas ini menandakan adanya perubahan nitrat menjadi gas
gas nitrogen (N2). Artinya, sampel tanah tidak subur yang diamati
mengandung bakteri yang mampu melakukan denitrifikasi.
Produksi gas yang teramati pada tabung durham menunjukkan jumlah gas
yang sedikit. Pengamatan terhadap tabung ini dilakukan secara kualitatif dan
subjektif, tergantung pengamat. Sebagaimana dijelaskan pada teori dasar, pH
yang dibutuhkan untuk proses denitrifikasi berkisar 6,8-8.
Inkubasi terhadap bakteri dilakukan pada suhu 25°C dan pH yang tidak
diketahui. Faktor ini dapat memengaruhi produksi gas yang dihasilkan.
Namun, adanya gas dalam jumlah sedikit ini sudah membuktikan bahwa ada
beberapa bakteri yang mampu mereduksi nitrat menjadi gas nitrogen. Dari
hasil pengamatan pula diperoleh bahwa jumlah gelembung pada tanah tidak
subur (sedikit basa) lebih banyak dibandingkan dengan tanah subur. Proses
denitrifikasi membutuhkan pH sekitar 6,8-8 atau sedikit basa. Selain pH,
ketersediaan oksigen dapat menentukan terjadinya proses denitrifikasi atau
tidak. Karena denitrifikasi terjadi dalam kondisi anaerob, maka bakteri
denitrifier pun bersifat anaerob pula. Hasil literature menunjukkan bahwa
Pseudomonas merupakan bakteri denitrifikasi. (Tchobanoglous, FL, & HD,
2003). Padahal, Pseudomonas merupakan bakteri aerobik obligat. Setelah
dikaji lebih lanjut, referensi lain menyebukan bahwa beberapa bakterti
denitrifier melakukan respirasi aerobic pula jika oksigen tersedia, meskipun
ion nitrat pun ada (Madigan, 2015). Bakteri denitrifier mayoritas nereduksi
akseptor electron lain secara anaerobik, misalnya Fe3+ dan akseptor organik
lain.
Bakteri yang mampu mendenitrifikasi nitrat menjadi gas nitrogen mampu
menghasilkan beberapa enzim, yaitu nitrat reductase, nitrite reductase, nitric
oxide reductase, dan nitrous ocxide reductase. Adanya perbedaan jumlah
gelembung pada tabung durham dipengaruhi faktor-faktor berikut:
1. Jumlah tanah atau bakteri yang diinokulasikan.
Semakin banyak bakteri atau tanah yang diinokulasi, maka semakin intens
proses denitrifikasi yang terjadi sehingga jumlah gas nitrogen yang
dihasilkan semakin banyak.
2. Suhu
Semakin optimum suhu inkubator, maka semakin optimum aktivitas
bakteri denitrifier.
3. Kondisi anaerobik
Semakin rendah oksigen, maka semakin besar probabilitas terjadinya
proses denitrifikasi. Bakteri denitrifier akan menggunakan nitrat sebagai
akseptor elektron akibat terbatasnya jumlah oksigen.
4. Waktu inkubasi
Semakin lama waktu inkubasi, maka semakin banyak pula gas nitrogen
yang dihasilkan akibat penambahan jumlah bakteri yang melakukan proses
denitrifikasi.
VII. KESIMPULAN
1. Proses denitrifikasi secara umum merupakan proses reduksi nitrat (NO3)
secara bertahap menjadi nitrit (NO2), Nitrouse Dioxide (N2O), Nitrouse
oxide (NO), sampai menjadi N2 dalam kondisi anaerobik. Proses ini
seringkali melibatkan bakteri, yaitu bakteri kelompok denitrifier.
2. Aktivitas denitrifikasi dapat dilihat dari adanya produksi gas nitrogen pada
tabung durham. Semakin banyak jumlah gas yang terbentuk, semakin aktif
pula aktivitas denitrifikasi. Jumlah sampel yang diinokulasi pun
memengaruhi produksi gas nitrogen, selain pH, suhu, kelembapan, dan
ketersediaan oksigen. Jumlah gas diamati secara kualitatif dan bersifat
subjektif.
3. Sampel yang diuji (Pseudomonas, Bacillus, tanah subur, tanah tidak subur)
menunjukkan hasil positif, yaitu adanya gas nitrogen yang tertangkap pada
tabung durham. Artinya, Pseudomonas dan Bacillus merupakan bakteri
denitrifier. Pada sampel tanah tidak subur dan subur terdapat jenis bakteri
denitrifier.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Calrson, C., & Ingraham, J. (1983). Comparison of denitrification byPseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans.USA: Appl Environ Microbiol.
Madigan, M. T. (2015). Brock Biology of Microorganism. USA: PearsonEducation.
Tchobanoglous, G., FL, B., & HD, S. (2003). Waste water engineering:Treatment an reuse 4th edition. Boston: McGraw-Hill.