PENUGASAN INHAL BIOKIMIA

METODE ISOLASI DNA

NAMA : ANGGANA FAZA NAZHARA

NIM : 10711124

KELOMPOK : C

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

2013

PENDAHULUAN

DNA atau deoxyribonucleic acid atau asam deoksiribonukleat yaitu sejenis asam nukleat yang termasuk biomolekul utama penyusun setiap organisme. Fungsinya untuk mengatur perkembangan biologis dari seluruh kehidupan setiap individu. Bagian-bagian yang terkandung dalam DNA diantaranya adalah nucleus, kloropas dan mitokondria. Ketiga bagian tersebut memiliki perbedaan satu sama lain, pada DNA yang terdapat di nucleus memiliki bentuk linear dan memiliki asosiasi dengan protein histon, untuk mitokondria dan kloroplas bentuknya sirkular dan tidak memiliki asosiasi dengan protein histon.(1). DNA dapat didefinisikan sebagai polimer asam nukleat yang membawa informasi genetic dari suatu sel terlebih itu adalah makhluk hidup dan susunannya sangatlah sistematis. Informasi genetic tersusun oleh kodon yang terdiri dari 3 pasang basa nukleotida.(2).

Fungsi dari DNA itu sendiri adalah terdiri dari 2 fungsi yang pertama yaitu sebagai autokatalisis dan yang kedua sebagai heterokatalisis, fungsi autokatalisis disini adalah karena DNA dapat mensintesis dirinya sendiri. Lalu DNA berfungsi sebagai heterkatalisis dikarenakan DNA dapat mensintesis molekul kimia yang lainnya, contohnya RNA, protein dan lain-lain.(3).

DNA tersusun dari tiga molekul, yaitu dari basa nitrogen, gugus fosfat dan juga dari gula pentosa. Basa nitrogen yang menyusun DNA terdiri dari du jenis yaitu purin dan pirimidin, didalam purin terdapat 2 jenis yaitu adenine (A) dan guanine (G), sedangkan didalam pirimidin terdapat 2 jenis yaitu timin (T) dan sitosin (C), kedua basa tersebut merupakan basa nitrogen yang berikatan pada atom C nomor satu molekul gula (melalui ikatan N-glukosid). Hasil dari ikatan tersebut adalah suatu molekul yang disebut dengan nukleosida, nukleosida ini nantinya akan berikatan dengan fosfat dan membentuk suatu molekul yang disebut nukleotida. Gugus fosfat yang terkandung didalam DNA akan berikatan dengan ato C nomor 5 melalui ikatan fosfoester, gugus fosfat ini yang mengakibatkan DNA bermuatan negatif. Lalu gula pentose memiliki 5 atom C pada DNA dan atom C nomor 2 akan berikatan dengan atom H.(2)

Teknik isolasi DNA ini merupakan hal yang sangat penting dikarenakan zaman yang semakin berkembang dan semakin maju. Isolasi DNA disini digunakan sebagai pengenalan terhadap DNA dan untuk mempelajari DNA. Ada 2 prinsip dari isolasi DNA yaitu dengan cara sentifuge dan cara presipitasi . cara sentrifuge disini adalah dengan teknik yang digunakan untuk memisahkan campuran menurut berat molekulnya. Molekul yang memiliki berat molekul (BM) besar akan terdapat dibagian dasar tabung dan sebaliknya untuk molekul yang memiliki berat molekul rendah akan berada dibagian atas tabung. Teknik isolasi DNA sangat spesifik dan terdapat beragam macam metode yang dapat digunakan, begitu juga dengan sampelnya sangat bervariasi dan banyak metodenya.

TUJUAN

Tujuan dari penulisan ini adalah untuk :

Memenuhi syarat inhal praktikum biokimia blok Medikolegal.

Mahasiswa mengetahui macam-macam metode isolasi DNA.

Mahasiswa mengetahui perbedaan dari setiap metode isolasi DNA

PEMBAHASAN

Isolasi DNA yaitu suatu teknik yang digunakan untuk mendapatkan DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel ataupun dari jaringan manfaat dari dilakukannya isolasi DNA ini adalah untuk analisis genetic, skrining, diagnosis, monitoring obat dan forensik. Isolasi DNA mempunyai banyak metode dan teknologi, secara garis besarnya, semua metode isolasi DNA memiliki kesamaan dalam tahap awalnya, yaitu isolasi jaringan. Pemilihan metode solasi DNA bergantung dari beberapa faktor, antara lain jumlah dan berat molekul dari DNA tersebut. Waktu dan biaya yang dikeluarkan untuk isolasi DNA akan mempengaruhi hasil atau kemurnian dari DNA tersebut.(4)

Dari berbagai macam metode isolasi DNA memiliki tingkat kemurnian dan waktu yang berbeda-beda.

Secara umum tahapan isolasi DNA ada beberapa tahap, yaitu :

Isolasi jaringan

Dalam tahap ini yang dilakukan adalah dengan mengisolasi jaringan yang diinginkan. Specimen biologi molekuler tersebut dapat diekstrasi dari kultur sel, rambut, darah, jaringan hewan, tumbuhan dan lain-lain.(5)

Pelisisan dinding dan membrane sel

Tahap yang kedua adalah melisiskan dinding dan membrane sel dengan cara menambahkan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Dilakukan pelisisan dikarenakan DNA ada didalamanya.(6)

Tujuan dari dari penambahan larutan pelisis yaitu untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung kompenen DNA dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak dibutuhkan. Red Cell Lysis Buffer adalah larutan pelisis yang digunakan disini tujuannya melisiskan eritrosit, sedangkan untuk melisiskan membrane sel adalah dengan Guanidine isotiocyanate. (6)

Pengekstraksian dalam larutan

Pada tahap ini supernatant yang terbentuk dan tidak digunakan akan dibuang lalu dilakukan ekstaksi didalam larutan, itu dikarenakan agar dapat diekstrak. (6)

Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat kimia lainnya. Larutan yang digunakan pada tahap ini adalah kloroform. Protein presipitasi buffer dan NaCl yang berfungsi untuk mengendapkan DNA.(6)

Presipitasi

Dan tahap terakhir adalah proses presipitasi. Bertujuan untuk mengendapkan protein histon. Sehingga untaian DNA tidak tergulung dan tidak berikatan dengan protein histon yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap ini dilakukan dengan cara menambahkan larutan etanol, etanol disini fungsinya untuk mencuci DNA, kemudian larutan tersebut disentrifuge selama 5 menit. Sentrifuge bertujuan untuk memisahkan berdasarkan berat molekul. (6)

Macam-macam isolasi DNA

1. Metode Phenolcloroform

Pada metode ini digunakan phenolchloroformisoamyl alcohol. Merupakan metode standar dalam melakukan ekstraksi DNA. Tetapi sekarang sudah jarang digunakan dikarenakan bahan larutan tersebut bersifat toksik.(6)

2. Metode CTAB

Metode CTAB ini adalah cara untuk pemisahan DNA dari polisakarida dari pita DNA yang ukurannya tebal, hal ini dikarenakan adanya perbedaan karakteristik kelarutan. Pada metode ini dapat didapatkan RNA yang berukuran tipis.(5)

3. Metode Ekstraksi Organic

Metode disini adalah metode konvensional yang menggunakan pelarut organic untuk mengekstraksi kontaminan dari sel. Sel disini dilisiskan dengan menggunakan deterjen dan digabung menggunakan fenol, kloroform dan isoamyl alcohol. Ketepatan konsentrasi garam serta pH harus sesuai ketika ekstraksi untuk memperjelas bahwa kontaminan terpisah menjadi organic phase, sementara DNA terdapat dibagian yang cair.(6)

4. Metode Cessium Chloride

Metode disini DNA dipurifikasi dengan menggunakan cara sentrifuge melalui gradient densitas cesium chloride. Sel dilisiskan dengan menggunakan deterjen dan dipresipitasi oleh alcohol, DNA lalu dicampur dengan cesium chloride dan ethidium bromide lalu disentrifuge beberapa jam. Hasilnya diambil dan diekstrasi menggunakan isopropanol untuk menghilangkan ethidium bromide, dipresipitasi dengan menggunakan etanol. Metode ini dapat menghasilkan DNA yang baik tetapi membutuhkan waktu yang lama, mahal saat pembuatannya. (7)

5. Metode Salting Out

Dalam metode ini diperlukan garam konsentrasi tinggi yang fungsinya adalah untuk mendenaturasi protein menggunakan protein K.(6)

6. Metode Guanidine Isotiocyanate

Metode Guanidine isothiocyanate merupakan metode yang lebih cepat jika dibandingkan dengan metode salting out dan metode phenolchloroform. Dimana sifat dari thiocyanate adalah toksik, dan memiliki fungsi sebagai pelisis dari dinding sel. Dan diperlukan chloroform yang digunakan sebagai denaturasi protein. (5)

7. Metode Silica Gel

Metode silica gel digunakan untuk mengikat DNA dengan menggunakan perantara yaitu garam/buffer tertentu yaitu NaCl. Metode ini merupakan metode cepat.(5)

8. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Metode PCR merupakan suatu teknik amplikasi atau perbanyakan potongan DNA yang dilakukan secara in vitro. Pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonuklotida.(7)

KESIMPULAN

DNA merupakan bagian yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup, karena mengandung materi genetic dan memiliki peran vital yaitu mengatur perkembangan biologis seluruh kehidupan, DNA terdapat di nucleus, mitokondria dan kloroplas. Tujuan dibuatnya penulisan ini guna untuk memenuhi syarat inhal praktikum blok medikolegal serta ditujukan agar mahasiswa mengerti metode dan perbedaan tiap-tiap isolasi DNA yang ada. Kegunaan isolasi DNA itu sendiri adalah untuk memperoleh DNA murni tanpa komponen lain yang tidak dibutuhkan. Fungsi dari isolasi cukup banya yaitu untuk analisis genetic, skrining, diagnosis, monitoring obat dan keperluan forensic. Isolasi juga memiliki tahapan-tahapan dari mulai isolasi jaringan, pelisisian dinding dan membrane sel, pengekstraksian, purifikasi dan presipitasi. Metode isolasi terdapat banyak macamnya diantaranya, Metode Phenolcloroform, Metode CTAB, Metode Ekstraksi Organic, Metode Cessium Chloride, Metode Salting Out, Metode Guanidine Isotiocyanate, Metode Silica Gel dan PCR (Polymerase Chain Reaction).

DAFTAR PUSTAKA

1. Brookes, M., 1999. Genetics. The Ivy Press: United Kingdom.

2. Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga: Jakarta.

3. Wolfe, S. L. 1993. Molecular and cellular biology. Wodsworth Publishing Company: Belmont.

4. Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press: NJ, USA.

5. Surzycki, S., 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer Verlag Publisher: New York.

6. Wilson, K., and John, W., 2010.Principles and techniques of Biochemistry and Molecular Biology. Cambridge University Press: New York.

7. Wang, T. Y., Wang, L., Zhang, J. H., and Dong, WH., 2011. A Simplified Universal Genomic DNA Extraction Protocol Suitable for PCR.Genetics and Molecular Research. 10 ( 1 ), 519 525.