pengaruh ekstrak etanol daun kirinyu ( (l.)...

PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN KIRINYU (Chromolaena odorata

(L.) (Asteraceae)) DAN ANTIBIOTIK TETRASIKLIN TERHADAP

PERTUMBUHAN BAKTERI Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memenuhi Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Veronica Natasya

NIM : 158114060

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN KIRINYU (Chromolaena odorata

(L.) (Asteraceae)) DAN ANTIBIOTIK TETRASIKLIN TERHADAP

PERTUMBUHAN BAKTERI Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memenuhi Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Veronica Natasya

NIM : 158114060

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii

Persetujuan Pembimbing


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini kupersembahkan untuk:

Allah Bapa di Surga, Tuhan Yesus Kristus dan Roh Kudus

Papa, Mama dan seluruh keluarga besar yang kucintai

Sahabat dan teman-teman yang telah mendukung dan menyemangati

Serta Almamaterku Universitas Sanata Dharma Yogyakarta


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat, berkat dan

kasih-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak

Etanol Daun Kirinyu (Chromolaena odorata (L.) (Asteraceae)) Dan Antibiotik

Tetrasiklin Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus” sebagai

syarat untuk mendapatkan gelar sarjana farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma dengan baik dan lancar.

Keberhasilan dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini tidak terlepas

dari dukungan, arahan, serta bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada

kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta, serta selaku Dosen Penguji yang memberikan

kritik dan saran selama penyusunan skripsi

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

3. Ibu Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc., selaku Kepala Laboratorium

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah memberi

izin untuk penggunaan laboratorium, serta selaku Dosen Pembimbing Skripsi

yang selalu memberi saran, arahan, masukan serta bimbingan dari penyusunan

proposal, penelitian, sampai penyusunan skripsi

4. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt., selaku Dosen Penguji yang memberikan

kritik dan saran selama penyusunan skripsi

5. Ibu Dr. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing akademik yang

selalu memberikan motivasi, dukungan, dan semangat dalam menjalani

perkuliahan

6. Bapak Antonius Dwi Priyana dan Bapak Sarwanto selaku Sekretariat S1

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang memberi

informasi selama perkuliahan dan ujian


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN .......................................... vi

PRAKATA ................................................................................................. vii

DAFTAR ISI .............................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ...................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xii

ABSTRAK ................................................................................................. xiii

ABSTRACT ................................................................................................. xiv

PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ........................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 9

KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................. 19

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 21

LAMPIRAN ............................................................................................... 25

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................... 48


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Plot 96-Well Plate Penentuan MIC ............................................... 7

Tabel II. Persen Penghambatan Ekstrak Etanol Daun Kirinyu ................... 12

Tabel III. Persen Penghambatan Tetrasiklin ............................................... 12

Tabel IV. Log Jumlah Bakteri Time-Kill Test ............................................. 16

Tabel V. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-4 ................... 18

Tabel VI. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-8 .................. 18

Tabel VII. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-24............... 19


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Time-Kill Curve ......................................................................... 15


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman ................................................... 25

Lampiran 2. Simplisia Kering Daun Kirinyu .............................................. 26

Lampiran 3. Ekstrak Etanol Daun Kirinyu ................................................. 26

Lampiran 4. Penetapan Kadar Air dengan Metode Destilasi Toluena ........ 26

Lampiran 5. Penetapan Kadar Sari Larut Etanol ........................................ 27

Lampiran 6. Sertifikat Kualitas Staphylococcus aureus ............................. 28

Lampiran 7. Perlakuan pada 96-Well Plate................................................. 29

Lampiran 8. Selisih Optical Density Penentuan MIC ................................. 29

Lampiran 9. Data Log Jumlah Bakteri Time-Kill Test ................................ 30

Lampiran 10. Time-Kill Test Kontrol Pertumbuhan ................................... 31

Lampiran 11. Time-Kill Test Perlakuan EEDK........................................... 32

Lampiran 12. Time-Kill Test Perlakuan TET .............................................. 33

Lampiran 13. Time-Kill Test Perlakuan EEDK+TET ................................. 34

Lampiran 14. Kontrol Media, Kontrol NaCl dan Kontrol MHB Time-Kill

Test ....................................................................................... 35

Lampiran 15. Perhitungan Koloni dengan Scan Colony Counter

Kontrol Pertumbuhan ........................................................... 36


Perlakuan EEDK .................................................................. 36


Perlakuan TET ...................................................................... 37


Perlakuan EEDK+TET .......................................................... 37

Lampiran 19. Kontrol Media dan Kontrol NaCl pada Scan Colony

Counter ................................................................................. 38

Lampiran 20. Uji Statistika ......................................................................... 39

Lampiran 21. Surat Keterangan Analisis Data ............................................ 47


xiii

ABSTRAK

Meningkatnya kasus resistensi bakteri terhadap antibiotik mendorong

penemuan agen antimikroba baru atau cara baru untuk mengatasi resistensi

antibiotik. Salah satu cara adalah dengan penambahan ekstrak bahan alam pada

antibiotik sehingga dapat meningkatkan efikasi agen antimikroba. Salah satu bahan

alam yang dapat digunakan adalah kirinyu (Chromolaena odorata). Daun C.

odorata memiliki kandungan flavonoid yang memiliki efek antimikroba. Tujuan

penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun kirinyu dan

antibiotik tetrasiklin terhadap pertumbuhan S. aureus.

Metode yang digunakan adalah microbroth dilutions dan time-kill test.

Microbroth dilutions digunakan untuk menentukan nilai MIC ekstrak etanol daun

kirinyu dan tetrasiklin. MIC yang didapatkan adalah 1 mg/mL untuk ekstrak etanol

daun kirinyu dan 8 µg/mL untuk tetrasiklin. Time-kill test digunakan untuk

menentukan efek bakteriostatik atau bakterisidal serta menentukan jenis interaksi

berdasarkan time-kill curve dan log perubahan jumlah koloni bakteri yang

dihasilkan. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol daun kirinyu memiliki efek

bakteriostatik sedangkan tetrasiklin dan kombinasi memiliki efek bakterisidal pada

jam ke-8 dan 24 terhadap pertumbuhan S. aureus. Interaksi yang dihasilkan antara

ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin adalah additive/indifference.

Kata kunci : Chromolaena odorata, antibakteri, tetrasiklin, time-kill test


xiv

ABSTRACT

Increasing cases of bacterial resistance to antibiotics encourage the

discovery of new antimicrobial agents or new ways to reduce antibiotic resistance.

One of the solutions is adding natural products on antibiotics so it can increase the

antimicrobial agents’ efficacy. One of the natural products that can be used is

kirinyu (Chromolaena odorata). C. odorata leaf has flavonoid contents that have

antimicrobial effects. The aims of this study are to discover kirinyu leaf ethanol

extract and tetracycline antibiotic effects to S. aureus growth.

The methods are microbroth dilutions and time-kill test. Microbroth

dilutions is used to determine kirinyu leaf ethanol extract and tetracycline MIC

values. The MIC values are 1 mg/mL for kirinyu leaf ethanol extract and 8 µg/mL

for tetracycline. Time-kill test is used to determine the bacteriostatic and

bactericidal effects also to determine the interaction based on time-kill curve and

the log changes in number of bacterial colonies produced. The study result shows

kirinyu leaf ethanol extract has bacteriostatic effect while tetracycline and the

combination have bactericidal effect at 8 and 24 hours against S. aureus growth.

The interaction between kirinyu leaf ethanol extract and tetracycline is

additive/indifference.

Keywords : Chromolaena odorata, antibacterial, tetracycline, time-kill test


1

PENDAHULUAN

Infeksi merupakan salah satu penyakit yang paling sering terjadi di dunia.

Infeksi disebabkan oleh bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Dalam

mengobati infeksi, dapat digunakan agen antimikroba. Namun pada abad ke-17

muncul kasus resistensi antimikroba, yaitu resistensi pada mikroorganisme

terhadap agen antimikroba yang pada awalnya sensitif (Chudobova et al., 2014).

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram-positif yang berbentuk

coccus. S. aureus dapat tumbuh aerob atau anaerob (fakultatif) pada suhu 18-40˚C.

S. aureus merupakan salah satu penyebab infeksi umum pada manusia dan

merupakan agen penyebab komplikasi infeksi seperti bacteremia, infective

endocarditis, infeksi kulit dan jaringan lunak, infeksi pulmonal, gastroenteritis,

meningitis, toxic shock syndrome dan infeksi saluran kemih (Taylor et al., 2017).

Resistensi antimikroba merupakan resistensi mikroorganisme terhadap

obat antimikroba yang pada awalnya sensitif (Chudobova et al., 2014). Adanya

resistensi pada agen antimikroba menjadi ancaman kesehatan karena berkurangnya

agen antimikroba yang dapat mengatasi infeksi bakteri (Magiorakos et al., 2012).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Santosaningsih et al. (2016), terjadi resistensi

tetrasiklin pada bakteri S. aureus sebanyak 43% sampel yang didapat dari rumah

sakit di Indonesia (104 kasus dari 242 sampel) (Santosaningsih et al., 2016).

Resistensi tetrasiklin dapat berasal dari gen tet(K), tet(L) dan tet(M) melalui pompa

efluks aktif dan protein pelindung ribosom (Jensen et al., 2009).

Penemuan agen antimikroba baru atau cara baru dalam mengobati

penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri yang resisten menjadi sangat penting.

Ekstrak tanaman jarang digunakan sebagai antibiotik sistemik untuk saat ini,

mungkin dikarenakan aktivitasnya yang rendah. Namun beberapa penelitian telah

menemukan bahwa efikasi agen antimikroba terhadap bakteri patogen, termasuk S.

aureus, dapat ditingkatkan dengan mengkombinasikannya dengan ekstrak tanaman.

Interaksi antara antibiotik dan ekstrak tanaman dapat bermanfaat (sinergis atau

additive) atau merusak (antagonis atau toksik) (Adwan and Mhanna, 2008).

Pada penelitian Kurniawati (2017), dilakukan penelitian kombinasi antara

amoksisilin dan ekstrak methanol daun sirih (Piper betle L.) terhadap Pseudomonas


2

aeruginosa menggunakan metode Checkerboard, hasil penelitian menunjukkan

interaksi antagonis. Pada penelitian Santoso dan Hartini (2018), dilakukan

penelitian kombinasi antara ampisilin dan ekstrak etanol daun sirih (Piper betle L.)

terhadap Staphylococcus aureus menggunakan metode Checkerboard, hasil

penelitian menunjukkan interaksi indifferent.

Salah satu tanaman yang memiliki efek antibakteri adalah daun kirinyu

(Chromolaena odorata (L.) King and Robinson) (Eze et al., 2013). C. odorata,

umumnya diketahui sebagai gulma siam, merupakan gulma yang cepat tumbuh dan

dapat menghambat pertumbuhan tanaman kebun muda serta tanaman pertanian

sehingga menjadi hama. Di sisi lain, tanaman kirinyu memiliki aktivitas

antiprotozoal, astringen, hepatotropik, diuretik, antitrypanosomal, antibakteri dan

antihipertensi, analgesik, antiinflamasi dan antipiretik (Rao et al., 2010).

Pada penelitian Febrianasari (2018), dilakukan penelitian efek antibakteri

ekstrak metanol C. odorata terhadap bakteri S. aureus menggunakan metode disc

diffusion. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi ekstrak 30-100% memiliki

diameter zona hambat 0,42-7,47 mm. Pada penelitian Eze et al. (2013), dilakukan

penelitian kombinasi antara ekstrak C. odorata dengan antibiotik ciprofloxacin,

norfloxacin, kloramfenikol, tetrasiklin dan erythromycin terhadap bakteri S. aureus

menggunakan metode disc diffusion dan macrobroth dilution. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa terdapat sinergisme antara C. odorata dengan ciprofloxacin,

norfloxacin, tetrasiklin dan kloramfenikol pada disk diffusion, sedangkan pada

metode macrobroth dilution efek sinergisme ditemukan hanya pada kombinasi C.

odorata dengan tetrasiklin dan kloramfenikol.

Melihat banyaknya manfaat yang dimiliki, peneliti ingin mengetahui

pengaruh ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin terhadap pertumbuhan bakteri

S. aureus. Untuk mendapatkan senyawa yang memiliki efek antibakteri, dilakukan

proses ekstraksi pada bahan alam dengan metode maserasi menggunakan etanol

95%. Metode penelitan yang digunakan berbeda dengan penelitian Eze et al.

(2013), yaitu time-kill test. Time-kill test dapat mengukur penghambatan maupun

pembunuhan bakteri. Karena hal tersebut maka metode ini lebih relevan bagi

keadaan klinis di mana terapi bakterisidal lebih dipilih (Lorian, 2005). Time-kill


3

test juga dapat digunakan untuk menentukan interaksi dua agen antimikroba

(Levison and Levison, 2009).

Data hasil penelitian dibuat time-kill curve untuk menentukan efek

bakteriostatik atau bakterisidal dari ekstrak etanol daun kirinyu, tetrasiklin maupun

kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin terhadap kontrol

pertumbuhan. Selain itu, dari time-kill curve dapat ditentukan jenis interaksi antara

ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin, baik sinergis, additive/indifference atau

antagonis.

METODE PENELITIAN

Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni untuk melihat hubungan

antara variabel bebas yaitu konsentrasi ekstrak etanol daun kirinyu dan konsentrasi

tetrasiklin dengan variabel tergantung yaitu pertumbuhan bakteri S. aureus.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah platform shaker (Innova™

2100), waterbath (Memmert), mesh no. 40, rotary evaporator (Buchi Switzerland

Tipe R-210 dan R-300), labu destilator (Schott Duran), pemanas destilator (M.

Topo® Tipe MS-E103), pompa vakum (GAST Model DOA-P504-BN) neraca

analitik (Ohaus PA213), autoklaf (ALP Co., Ltd., Japan Model KT-40), BSC Class

II A2 (ESCO Model LA2-3A1-E/Class II A2 Serial: 2016-95067), inkubator

(Memmert dan Heraeus Tipe B.5050), oven (WTB Binder 7200 Tipe

33053099003100 dan Memmert 30-1060), microplate 96 Well Flat Bottom (Iwaki),

pipet pump, mikropipet (Gilson), blue tip, yellow tip, bunsen, vortex (Gallenkamp),

scan® 500 automatic colony counter (Interscience), nephelometer (BD Phoenix

Spec), jarum ose, microplate reader (Benchmark), alat-alat gelas (Pyrex) yaitu

tabung reaksi, labu takar, erlenmeyer, gelas beker, gelas ukur, pipet volume, cawan

petri, batang pengaduk, spreader, pipet tetes.

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kirinyu yang

diperoleh dari Lembaga Pendampingan Usaha Buruh Tani Nelayan (LPUBTN),

bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Thermo Scientific) dari PT Dipa


4

Puspa Labsains, tetrasiklin (Super tetra), etanol 95% (CV General Labora), tisu,

kertas saring Whatman’s No. 1, nutrient agar (Oxoid), nutrient broth (Oxoid),

Mueller-Hinton Agar (Oxoid), Mueller-Hinton Broth (Merck), normal saline (0,9%

NaCl), aquades, DMSO (Merck).

Preparasi Bahan Baku

Daun kirinyu yang akan digunakan dibeli dari Lembaga Pendampingan

Usaha Buruh Tani Nelayan (LPUBTN). Kriteria daun kirinyu yang digunakan

adalah daun utuh dengan panjang daun 5-14 cm dan lebar daun 2,5-8 cm dengan

usia tanaman 6 bulan. Daun bebas dari serangga, fragmen hewan atau kotoran

hewan; tidak mengandung lendir, jamur, atau tanda-tanda pengotor lain; tidak

mengandung bahan lain yang beracun atau berbahaya. Determinasi dilakukan di

Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Daun kirinyu yang sudah kering diserbuk menggunakan mesin penyerbuk. Serbuk

simplisia diayak menggunakan mesh no. 40 sehingga didapatkan serbuk simplisia.

Serbuk disimpan dalam wadah tertutup rapat.

Penetapan Kadar Air Dengan Metode Destilasi Toluena

Rangkaian alat destilasi disiapkan dengan menyiapkan labu 500 mL lalu

dihubungkan dengan pendingin air balik melalui alat penampung yang dilengkapi

tabung penerima 5 mL yang berskala 0,1 mL. Bagian atas alat penampung

sebaiknya dibungkus asbes. Tabung penerima dan pendingin pada alat destilasi

dibersihkan dengan asam pencuci lalu dibilas dengan air dan dikeringkan. Pereaksi

toluen disiapkan dengan mengocok toluene P dengan sedikit air kemudian

dipisahkan dengan corong pisah, lapisan air dibuang. Serbuk daun kirinyu

ditimbang sebanyak 10 gram lalu dimasukkan ke dalam labu. Sebanyak kurang

lebih 200 mL toluen dimasukkan ke dalam labu, rangkaian alat dipasang. Labu

dipanaskan selama 15 menit menggunakan pemanas listrik. Setelah toluen mulai

mendidih, kecepatan penyulingan diatur kurang lebih 2 tetes per detik, hingga

sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4

tetes per detik. Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit. Tabung penerima


5

didinginkan hingga suhu ruang. Volume air dibaca setelah air dan toluen memisah

sempurna. Kadar air dihitung dalam % v/b dengan rumus :

%kadar air = volume air (mL)

berat simplisia yang ditimbang (g) x 100% (1)

(Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2011).

Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Serbuk daun kirinyu ditimbang sebanyak kurang lebih 5 gram,

dimasukkan ke dalam labu bersumbat. Sebanyak 100 mL etanol 95% ditambahkan,

dikocok berkali-kali selama 6 jam pertama, lalu dibiarkan selama 18 jam. Larutan

disaring cepat untuk menghindarkan penguapan etanol. 20 mL filtrat diuapkan

hingga kering dalam cawan dangkal beralas datar yang telah dipanaskan 105° dan

ditara, sisa dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Kadar dihitung dalam

% b/b dengan rumus :

Kadar sari larut etanol = bobot ekstrak larutan

bobot simplisia x

100

20 x 100% (2)


Ekstraksi Tanaman

Serbuk simplisia daun kirinyu diekstraksi secara maserasi menggunakan

etanol 95% pada suhu ruangan dengan penggojokan konstan menggunakan shaker

selama 24 jam. Rasio serbuk simplisia dan pelarut adalah 1:10 (w/v). Kemudian

proses ekstraksi diulangi. Ekstrak cair disaring menggunakan kertas saring

Whatman No. 1. Ekstrak etanol kemudian diuapkan menggunakan rotary

evaporator pada suhu 78°C, diuapkan kembali menggunakan waterbath pada suhu

50-70°C lalu dimasukkan dalam oven hingga diperoleh ekstrak kering

(Hanphakphoom et al., 2016). Penetapan bobot tetap, penetapan rendemen dan uji

kadar air dengan metode gravimetri dilakukan sebagai standarisasi ekstrak kering.

Persen rendemen dihitung menggunakan rumus :

Rendemen = bobot ekstrak

bobot simplisia x 100 % (3)


6

Penetapan bobot tetap dilakukan dengan menimbang ekstrak yang akan

dikeringkan atau dipijarkan terlebih dahulu. Penimbangan dinyatakan mencapai

bobot tetap apabila perbedaan dua kali penimbangan berturut-turut setelah

dikeringkan atau dipijarkan selama 1 jam tidak lebih dari 0,25% atau perbedaan

penimbangan tidak melebihi 0,5 mg pada penimbangan dengan timbangan analitik


Penyiapan Bakteri Uji

Bakteri uji Staphylococcus aureus diinokulasikan pada media nutrient agar

(NA) secara streak plate, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Bakteri

tunggal pada media nutrient agar diinokulasikan ke dalam media cair nutrient broth

(NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C.

Penentuan Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Penentuan MIC ekstrak dan antibiotik terhadap S. aureus dilakukan

dengan menggunakan metode mikrodilusi pada 96-well plate. Kultur bakteri dalam

MHB disiapkan dan disetarakan dengan 0,5 McFarland. Seri konsentrasi ekstrak

disiapkan dengan rentang konsentrasi 0,125-4 mg/mL (Tamo et al., 2016). Seri

konsentrasi tetrasiklin disiapkan pada rentang konsentrasi 0,5-16 µg/mL

(Dougherty and Pucci, 2012). Ekstrak dilarutkan menggunakan DMSO dengan

konsentrasi DMSO pada well maksimal sebesar 10%, sedangkan tetrasiklin

dilarutkan menggunakan aquades steril. Kedua seri konsentrasi diencerkan dengan

dilusi seri dua kali lipat (serial two-fold dilution). 96-well plate disiapkan dengan

menambahkan 110 µL MHB yang telah berisi kultur bakteri. Sebanyak 90 µL seri

konsentrasi ekstrak atau tetrasiklin dimasukkan dalam 8 sumuran secara berurutan.

Volume akhir setiap sumuran adalah 200 µL. Kontrol media, kontrol pertumbuhan

bakteri, kontrol negatif aquades dan kontrol negatif DMSO dibuat pada pengujian.

Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali.


7

Tabel I. Plot 96-Well Plate Penentuan MIC

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 4 2 1 0,5 0,25 0,125 KP KD

B 4 2 1 0,5 0,25 0,125 KP KD

C 4 2 1 0,5 0,25 0,125 KP KD

D

E 16 8 4 2 1 0,5 KA KM

F 16 8 4 2 1 0,5 KA KM

G 16 8 4 2 1 0,5 KA KM

H

Keterangan :

• seri konsentrasi ekstrak C. odorata (dalam mg/mL).

• seri konsentrasi antibiotik tetrasiklin (dalam µg/mL).

• KM (kontrol sterilitas media)

• KP (kontrol pertumbuhan)

• KA (kontrol negatif aquades)

• KD (kontrol negatif DMSO)

Absorbansi sampel pada plate diukur menggunakan microplate reader

pada panjang gelombang 595 nm sebelum inkubasi dan setelah inkubasi, sehingga

diperoleh Optical Density (OD) sebelum (ODt0) dan setelah (ODt24). Perhitungan

persen penghambatan dihitung menggunakan rumus :

%penghambatan= (1- (ODt24-ODt0

ODgc24-ODgc0)) x 100% (4)

(Pratiwi, 2015).

Keterangan:

• ODt24 = OD sampel setelah inkubasi

• ODt0 = OD sampel sebelum inkubasi

• ODgc24 = OD kontrol pertumbuhan setelah inkubasi

• ODgc24 = OD kontrol pertumbuhan sebelum inkubasi

Berdasarkan nilai persen penghambatan yang didapat, dilakukan penentuan MIC.

MIC pada penelitian ini ditentukan berdasarkan konsentrasi terkecil yang

menghasilkan persen penghambatan > 90%, yang berarti menghambat > 90%

pertumbuhan bakteri uji (Barbosa et al., 2018).


8

Perlakuan Time-Kill Test

Kultur bakteri disiapkan lalu disetarakan 106 CFU/mL (pengenceran 1:150

dari 0,5 McFarland). Tiap tabung mengandung 9 mL MHB yang telah ditambah

ekstrak tunggal, antibiotik tunggal, maupun kombinasi ekstrak dan antibiotik (1/4

MIC : 1/4 MIC) diinokulasikan 1 mL bakteri S. aureus. Sampel diinkubasi pada

suhu 37˚C, Kontrol pertumbuhan, kontrol media dan kontrol sterilitas NaCl dibuat

pada percobaan. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali (Tamo et al., 2016).

Penghitungan Koloni Bakteri Menggunakan Automatic Colony Counter

Sampel diambil sebanyak 100 µL pada jam ke- 0, 4, 8 dan 24, lalu

diencerkan 10-fold (10 kali lipat) dengan normal saline (0,9% NaCl) pada

konsentrasi 10-1 – 10-5. 100 µL sampel diinokulasikan pada MHA secara spread

plate lalu diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Koloni bakteri pada setiap

petri pengujian ekstrak tunggal, antibiotik tunggal maupun kombinasi ekstrak dan

antibiotik dihitung. Jumlah bakteri yang masuk perhitungan berdasarkan penelitian

Basri and Khairon (2012) adalah antara 30-300 CFU/mL. Pengujian dilakukan

sebanyak 3 kali. Konsentrasi pengenceran yang dihitung pada setiap perlakuan

adalah konsentrasi yang memiliki jumlah bakteri antara 30-300 koloni pada

minimal 2 petri dari 3 petri yang diujikan. Jumlah koloni dihitung dengan rumus :

CFU/mL = jumlah koloni x 1

konsentrasi: volume yang diinokulasikan (5)

Pembuatan Kurva

Time-kill curve dibuat dengan memplotkan waktu (jam) sebagai x dan

log10 CFU/mL jumlah bakteri sebagai y. Kurva berisikan data kontrol pertumbuhan,

ekstrak tunggal, antibiotik tunggal dan kombinasi ekstrak dan antibiotik. Efek

bakteriostatik dan bakterisidal didefinisikan sebagai penurunan < 3 log10 CFU/mL

dan ≥ 3 log10 CFU/mL secara berturut-turut (Silva et al., 2011). Interaksi dikatakan

sinergis bila ada penurunan pada perhitungan koloni ≥ 2 log10 CFU/mL setelah 24

jam pada kombinasi dibandingkan senyawa paling aktif. Interaksi dikatakan

additive atau indifference bila perubahan <2 log10 CFU/mL pada jumlah koloni.


9

Interaksi dikatakan antagonis bila ada kenaikan ≥ 2 log10 CFU/mL (Basri and

Khairon, 2012).

Tatacara Analisis Data

Analisis hasil dilakukan dengan menghitung jumlah koloni bakteri

terhadap waktu. Data dianalisis secara statistik menggunakan uji Shapiro-Wilk

untuk mengetahui normalitas distribusi data dan Levene’s Test untuk mengetahui

varian data. Taraf kepercayaan yang digunakan pada Levene’s Test adalah 95%.

Analisis kemudian dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA dan Post hoc

Tamhane’s. Dari uji tersebut dapat diidentifikasi apakah terdapat perbedaan

signifikan (p ≤ 0,05) pada hasil time-kill test.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tanaman yang digunakan pada penelitian ini merupakan simplisia kering

daun kirinyu yang diperoleh dari Lembaga Pendampingan Usaha Buruh Tani

Nelayan (LPUBTN). Kebenaran spesies tanaman dibuktikan dengan surat

determinasi (Lampiran 1) yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman

Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, membuktikan bahwa tanaman

yang digunakan adalah tanaman Chromolaena odorata (L.) R. M. King & H. Rob.

Kadar air pada serbuk simplisia ditetapkan dengan menggunakan metode

destilasi toluen karena penelitian ini menggunakan bahan yang telah dikeringkan

dan mengandung minyak menguap (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia,

2011). Menurut Kementerian Kesehatan Republik Indonesia (2011), kadar air yang

diperbolehkan adalah tidak lebih dari 10%. Volume air yang diperoleh adalah 0,5

mL (Lampiran 4) dengan berat serbuk simplisia sebesar 10,0005 gram sehingga

kadar air serbuk simplisia daun kirinyu sebesar 4,99975 %. Kadar air tidak lebih

dari 10% sehingga telah memenuhi syarat yang ditetapkan.

Kadar sari larut etanol adalah pengujian penetapan jumlah kandungan

senyawa yang dapat terlarut dalam etanol, dengan tujuan memberikan gambaran

awal jumlah senyawa kandungan yang terlarut dalam etanol (Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 2000). Pengujian kadar sari larut etanol dilakukan

sebagai salah satu standarisasi simplisia. Kadar sari larut etanol yang diperoleh


10

adalah 18,07 % (Lampiran 5). Hasil menunjukkan jumlah senyawa yang

terkandung dalam daun kirinyu dapat terlarut dalam etanol, sehingga pemilihan

etanol sebagai pelarut ekstraksi sudah tepat. Hasil yang didapat berbeda dengan

penelitian Atikah (2016), hasil penetapan kadar sari larut etanol serbuk simplisia C.

odorata didapat sebesar 11,96%.

Ekstraksi serbuk simplisia daun kirinyu dilakukan dengan metode maserasi

menggunakan pelarut etanol 95%. Proses ekstraksi dilakukan selama 24 jam dengan

remaserasi (2x24 jam). Remaserasi merupakan modifikasi dari maserasi,

perbedaannya terletak pada penggunaan sebagian pelarut untuk ekstraksi, sebagian

pelarut lainnya akan digunakan pada komponen residu untuk kedua kalinya. Kedua

filtrat akan digabungkan pada tahap akhir ekstraksi (Fauzana, 2010). Pada

penelitian Mondal et al. (2012) ekstrak etanol daun kirinyu menggunakan pelarut

etanol 95% memiliki kandungan 4 jenis komponen aromatik dengan bobot molekul

rendah dan 12 jenis flavonoid berbeda dalam ekstrak etanol C. odorata dengan

komponen utama quercetin (Mondal et al., 2012). Quercetin memiliki efek

antibakteri dengan menghambat replikasi DNA atau dengan beraksi pada tingkat

membran sel (Figueiredo et al., 2008). Semakin banyak kandungan flavonoid

quercetin yang terkandung dalam ekstrak etanol daun kirinyu, diharapkan efek

antibakteri yang dihasilkan semakin tinggi.

Ekstrak diuapkan pada rotary evaporator pada suhu 78°C untuk

menguapkan pelarut etanol yang memiliki titik didih pada suhu 78°C (PubChem,

2019). Ekstrak diuapkan kembali hingga mencapai bobot tetap. Penimbangan

dinyatakan mencapai bobot tetap apabila perbedaan 2 kali penimbangan berturut-

turut tidak lebih dari 0,25% atau 0,5 mg (Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia, 2011). Bobot ekstrak etanol daun kirinyu didapat sebesar 45,6238 gram

dengan rendemen sebesar 18,249 %.

Bakteri yang digunakan pada penelitian adalah Staphylococcus aureus

ATCC 25923 yang diperoleh dari PT Dipa Puspa Labsains. Kebenaran spesies

bakteri dibuktikan dengan surat keterangan (Lampiran 6). Penentuan MIC

dilakukan dengan metode microbroth dilution. Microbroth dilution adalah metode

dilusi cair yang menggunakan media cair dengan volume akhir ≤ 500 µL dalam


11

well plate (Wiegand et al., 2008). Metode microbroth dilution merupakan metode

yang paling populer untuk pengujian antimikroba di Amerika Serikat. Beberapa

alasannya adalah karena metode ini akurat dibandingkan dengan gold standard

yaitu dilusi agar, dapat digunakan untuk menguji berapapun jumlah sampel yang

ada, plate tersedia di pasaran sehingga lebih praktis, plate sangat mudah

diinokulasikan dan hasilnya mudah dibaca (Engelkirk and Duben-Engelkirk, 2008).

Pengukuran OD pada 96-well plate dilakukan dengan menggunakan microplate

reader pada panjang gelombang 595 nm. Nilai OD selisih ekstrak maupun

tetrasiklin kemudian dibandingkan dengan nilai OD selisih kontrol pertumbuhan,

sehingga didapatkan nilai persen penghambatan (Lampiran 8). Perhitungan OD

selisih digunakan untuk mengatasi warna pada ekstrak yang dapat terdeteksi pada

microplate reader (Quave et al., 2008).

Pada penelitian ini dibuat 4 kontrol, yaitu kontrol pertumbuhan, kontrol

media, kontrol negatif aquades dan kontrol negatif DMSO. Kontrol pertumbuhan

digunakan untuk memastikan bahwa bakteri S. aureus dapat tumbuh dengan baik

pada media sekaligus menjadi pembanding dalam menentukan persen

penghambatan ekstrak maupun tetrasiklin. Kontrol media digunakan untuk

mengetahui sterilitas media dan memastikan keaseptisan pengerjaan. Kontrol

negatif aquades dan DMSO digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya

aktivitas antibakteri pada aquades maupun DMSO yang digunakan untuk

melarutkan tetrasiklin dan ekstrak. Konsentrasi DMSO yang digunakan adalah

10%, konsentrasi tersebut merupakan konsentrasi DMSO terbesar dalam well pada

seri konsentrasi ekstrak yang diujikan. Menurut Rukayadi et al. (2009), DMSO

10% tidak memiliki efek penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri.

MIC merupakan konsentrasi terendah dari suatu obat yang menghambat

pertumbuhan patogen tertentu (Willey et al., 2008). Penentuan nilai MIC ditentukan

berdasarkan persen penghambatan ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin, yaitu

konsentrasi yang memiliki persen penghambatan > 90%, yang berarti nilai MIC

yang dapat menghambat > 90% pertumbuhan bakteri uji (Barbosa et al., 2018).


12

Tabel II. Persen Penghambatan Ekstrak Etanol Daun Kirinyu

Perlakuan

(mg/mL) Penghambatan (%) ± SD

EEDK 4 108,22 ± 0,049

EEDK 2 98,66 ± 0,042

EEDK 1 92,00 ± 0,019

EEDK 0,5 79,18 ± 0,027

EEDK 0,25 41,60 ± 0,003

EEDK 0,12 20,73 ± 0,021

Keterangan : EEDK = ekstrak etanol daun kirinyu

Tabel III. Persen Penghambatan Tetrasiklin

Perlakuan

(µg/mL)

Penghambatan (%) ± SD

TET 16 99,46 ± 0,003

TET 8 92,72 ± 0,009

TET 4 83,24 ± 0,014

TET 2 77,21 ± 0,009

TET 1 71,36 ± 0,013

TET 0,5 66,62 ± 0,025

Keterangan : TET = tetrasiklin

Berdasarkan data persen penghambatan pada tabel II dan tabel III didapat

bahwa ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin memiliki aktivitas antibakteri

terhadap bakteri S. aureus dengan persen penghambatan yang berbeda-beda pada

tiap konsentrasi. Pada ekstrak etanol daun kirinyu, rentang persen penghambatan

yang didapat adalah 20,73-108,22 %, sedangkan pada tetrasiklin rentang persen

penghambatan yang didapat adalah 66,62-99,46 %. Dari data tersebut ditetapkan

nilai MIC yang akan digunakan pada pengujian time-kill test, yaitu konsentrasi 1

mg/mL pada ekstrak dan 8 µg/mL pada tetrasiklin. Kontrol media menunjukkan

hasil yang jernih dan tidak terdapat pertumbuhan bakteri, kontrol negatif aquades

dan kontrol negatif DMSO 10% menunjukkan baik aquades maupun DMSO 10%

tidak memiliki aktivitas penghambatan.

Menurut Clinical and Laboratory Standards Institute (2014), kriteria MIC

tetrasiklin yang diujikan pada bakteri Staphylococcus spp. dikatakan sensitif

apabila MIC ≤ 4 µg/mL, intermediate dengan nilai MIC = 8 µg/mL, resisten yang


13

ditunjukkan dengan MIC ≥ 16 µg/mL. MIC pada kriteria ini adalah konsentrasi

terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Dari kriteria tersebut

kepekaan bakteri S. aureus yang digunakan termasuk sensitif terhadap tetrasiklin,

karena konsentrasi terkecil tetrasiklin yang diujikan yaitu 0,5 µg/mL masih

menghambat pertumbuhan S. aureus.

Pada penelitian Eze et al. (2013), nilai MIC ekstrak C. odorata yang

diujikan menggunakan metode macrobroth dilution terhadap bakteri S. aureus

adalah 1,95 mg/mL. Penentuan nilai MIC dilakukan secara visual, yaitu melihat

konsentrasi terkecil yang terlihat tidak ditumbuhi bakteri. Sedangkan pada

penelitian yang dilakukan pengujian MIC menggunakan metode microbroth

dilution dengan pengukuran menggunakan microplate reader. Perbedaan nilai MIC

yang didapat mungkin diakibatkan perbedaan metode pengujian yang digunakan.

Menurut Balouiri et al. (2016), metode macrobroth dilution menggunakan reagen

dan tempat relatif besar dibandingkan microbroth dilution yang lebih reproducible,

hemat bahan dan hemat tempat. Penggunaan alat atau tidak pada penentuan MIC

juga mempengaruhi nilai MIC yang didapat. Menurut Fang et al. (2006), penentuan

MIC secara visual lebih subjektif dibandingkan menggunakan pembaca

spectrophotometric Pembaca spectrophotometric secara umum lebih presisi dan

reproducible dibanding metode visual.

Selain itu, perbedaan lokasi tumbuhnya tanaman dapat mempengaruhi

jumlah metabolit sekunder yang terkandung pada tanaman. Metabolit sekunder

dapat ditemukan pada berbagai bagian tanaman (daun, akar batang), pada berbagai

tahap pertumbuhan tanaman, pada berbagai keadaan lingkungan yang berbeda.

Metabolit sekunder berperan penting dalam ketahanan hidup suatu spesies yang

diproduksi melalui interaksi dengan lingkungannya (McCreath and Delgoda,

2017). Hal ini berarti lingkungan tumbuhnya tanaman berpengaruh terhadap

metabolit sekunder pada tanaman. Nilai MIC yang didapat pada penelitian Eze et

al. (2013) berbeda dengan penelitian ini mungkin disebabkan oleh hal ini.

Menurut Hanphakphoom et al. (2016), ekstrak etanol daun kirinyu

memiliki kandungan fenolik yaitu gallic acid dan trolox, kandungan flavonoid yaitu

quercetin dan rutin, dengan kandungan fitokimia terbanyak adalah rutin. Menurut


14

Cushnie and Lamb (2005), melalui tes enzim dan teknik yang dikenal dengan SOS

chromotest, rutin diketahui dapat meningkatkan pemecahan DNA topoisomerase

IV-dependent, menghambat decatenation dari topoisomerase IV-dependent.

Topoisomerase IV penting untuk kelangsungan hidup sel, sehingga pemecahan

DNA topoisomerase IV-dependent menghasilkan respon SOS bakteri dan

menghambat pertumbuhan bakteri.

Tetrasiklin merupakan antibiotik berspektrum luas. Tetrasiklin bekerja

sebagai antibiotik dengan mengikat ribosom bakteri dan menghambat sintesis

protein. Ribosom bakteri memiliki situs pengikatan berafinitas tinggi pada subunit

30S dan banyak situs dengan afinitas rendah pada subunit 30S dan 50S. Selain

berikatan dengan ribosom, tetrasiklin menghambat ikatan secara alosterik dengan

amino acyl-tRNA pada situs akseptor (A-site), sehingga sintesis protein terhenti

(Griffin et al., 2010).

Antibakteri yang berasal dari tanaman selalu menjadi sumber terapi baru.

Tanaman diketahui menghasilkan berbagai antibiotik bermolekul kecil (MW<500)

dengan berbagai macam struktur seperti terpenoid, glycosteroid, flavonoid, dan

polifenol. Molekul-molekul kecil ini memiliki aktivitas antibiotik lemah, namun

berhasil melawan infeksi pada tanaman. Tampaknya tanaman “bersinergi” untuk

menghadapi infeksi (Hemaiswarya et al., 2008). Beberapa penelitian membuktikan

bahwa efikasi agen antimikroba dapat ditingkatkan dengan mengombinasikan

antimikroba dan ekstrak tanaman terhadap berbagai bakteri patogen (Adwan and

Mhanna, 2008).

Efek bakteriostatik dan bakterisidal pada ekstrak etanol daun kirinyu dan

tetrasiklin maupun kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin, serta jenis

interaksi antara ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin terhadap bakteri S.

aureus ditentukan melalui pengujian menggunakan time-kill test. Konsentrasi yang

digunakan adalah masing-masing 1/4 : 1/4 MIC yaitu 0,25 mg/mL untuk ekstrak

etanol daun kirinyu dan 2 µg/mL untuk tetrasiklin. Pada time-kill test, diujikan

ekstrak etanol daun kirinyu, tetrasiklin dan kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu

dan tetrasiklin. Pengujian masing-masing sampel diulangi sebanyak 3 kali dengan

tujuan untuk meningkatkan akurasi data. Keuntungan dari time-kill test terhadap


15

metode checkerboard adalah metode ini dapat menyediakan gambaran dinamis aksi

antimikroba dan interaksi antara agen antimikroba dan bakteri dari waktu ke waktu,

berkebalikan dengan metode checkerboard yang biasanya hanya diukur satu kali.

Kinetika aktivitas antimikroba dapat dijadikan landasan untuk penentuan frekuensi

dosis. Time-kill test digunakan untuk mengevaluasi dan membandingkan obat baru

serta untuk mengamati perubahan sensitivitas antimikroba terhadap isolat bakteri

yang penting secara klinis. Time-kill test juga dapat menentukan efek bakterisidal,

penentuan bakterisidal merupakan hal yang penting karena dalam kasus klinis

bakteri yang diujikan berasal dari pasien dengan infeksi yang membutuhkan terapi

bakterisidal jika memungkinkan (contoh : endocarditis, meningitis atau

osteomyelitis) (Lorian, 2005).

Pada pengujian dibuat 4 kontrol yaitu kontrol pertumbuhan, kontrol media,

kontrol MHB dan kontrol NaCl. Kontrol pertumbuhan digunakan untuk

memastikan bakteri S. aureus dapat tumbuh dengan baik pada media sekaligus

menjadi pembanding pada penentuan efek pengujian. Kontrol MHB digunakan

untuk mengetahui sterilitas media dan memastikan keaseptisan kerja. Kontrol NaCl

digunakan untuk mengetahui sterilitas larutan NaCl 0,9% yang digunakan untuk

mengencerkan bakteri.

Gambar 1. Time-Kill Curve

Keterangan : EEDK = ekstrak etanol daun kirinyu; TET = tetrasiklin; KP = kontrol

pertumbuhan; EEDK+TET = kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin

0.000

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

0 4 8 24

log1

0 C

FU

/mL

Waktu (Jam)

Time-Kill Curve

KP EEDK TET EEDK+TET


16

Berdasarkan time-kill curve yang diperoleh pada gambar 1, seluruh

perlakuan memiliki jumlah bakteri yang hampir sama pada jam ke-0. Pada kontrol

pertumbuhan terjadi kenaikan jumlah bakteri mulai jam ke-4 hingga pada jam ke-

24 dengan jumlah koloni tertinggi. Pada perlakuan EEDK, terjadi kenaikan jumlah

bakteri pada jam ke-4, 8 dan 24 namun tidak sebanyak pada kontrol pertumbuhan.

Pada perlakuan TET, jumlah bakteri pada jam ke-4 dan jam ke-8 tidak

menunjukkan kenaikan namun menunjukkan sedikit penurunan jumlah bakteri. Hal

ini berarti tetrasiklin dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus. Pada jam

ke-24 tetrasiklin menunjukkan penurunan jumlah bakteri yang cukup tinggi. Pada

perlakuan EEDK+TET, jumlah bakteri pada jam ke-4, 8 dan 24 menunjukkan pola

penurunan yang tidak berbeda jauh dengan tetrasiklin. Perlakuan EEDK+TET

mengalami penurunan jumlah bakteri yang cukup tinggi dibandingkan kontrol

pertumbuhan yang terus mengalami kenaikan hingga jam ke-24.

Tabel IV. Log Jumlah Bakteri Time-Kill Test

Perlakuan

(jam)

Jumlah Bakteri (Log10

CFU/mL) ± SD

KP 0 4,278 ± 0,011

KP 4 6,471 ± 0,024

KP 8 7,286 ± 0,021

KP 24 8,202 ± 0,023

EEDK 0 4,241 ± 0,027

EEDK 4 5,402 ± 0,009

EEDK 8 5,653 ± 0,010

EEDK 24 7,403 ± 0,047

TET 0 4,233 ± 0,069

TET 4 4,221 ± 0,053

TET 8 4,191 ± 0,046

TET 24 3,006 ± 0,106

EEDK+TET 0 4.235 ± 0,066

EEDK+TET 4 3.829 ± 0,114

EEDK+TET 8 3.837 ± 0,051

EEDK+TET 24 2.593 ± 0,111

Keterangan : EEDK = ekstrak etanol daun kirinyu; TET = tetrasiklin; KP = kontrol

pertumbuhan; EEDK+TET = kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin


17

Berdasarkan data logaritma jumlah bakteri yang didapat dalam time-kill

test (Lampiran 9), dapat ditentukan efek bakteriostatik maupun bakterisidal pada

tiap perlakuan. Tetrasiklin pada jam ke-8 dan 24 menunjukkan efek bakterisidal

terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus, ditandai dengan penurunan ≥ 3 log10

CFU/mL dibandingkan kontrol pertumbuhan. Efek bakterisidal juga ditunjukkan

oleh kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin pada jam ke-8 dan 24

terhadap kontrol pertumbuhan, walaupun tidak berbeda jauh dengan tetrasiklin.

Efek bakterisidal menunjukkan pembunuhan > 99,9% koloni bakteri (Basri and

Khairon, 2012). Bakterisidal merupakan efek yang disebabkan oleh suatu agen

yang dapat membunuh bakteri (Willey et al., 2008). Ekstrak etanol daun kirinyu

menunjukkan efek bakteriostatik terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus, ditandai

dengan penurunan < 3 log10 CFU/mL dibandingkan kontrol pertumbuhan (Silva et

al., 2011). Bakteriostatik adalah efek penghambatan pertumbuhan bakteri yang

disebabkan oleh suatu agen, namun ketika agen tersebut dihilangkan maka

pertumbuhan akan berlanjut (Willey et al., 2008). Selain itu, dapat ditentukan juga

jenis interaksi antara ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin yang menunjukkan

interaksi additive atau indifference, ditandai dengan perubahan < 2 log10 CFU/mL

dibandingkan senyawa paling aktif yaitu tetrasiklin.

Pada pengujian statistik (Lampiran 12), dilakukan uji normalitas

menggunakan uji Shapiro-Wilk dan uji variasi atau homogenitas data menggunakan

Levene’s Test. Hasil uji Shapiro-Wilk menunjukkan seluruh data terdistribusi

normal, ditandai dengan nilai p > 0,05 pada seluruh perlakuan. Hasil Levene’s Test

menunjukkan data tidak terdistibusi homogen atau memiliki variasi yang berbeda,

ditandai dengan nilai p = 0,023 (p < 0,05). Oleh karena data terdistribusi normal

namun memiliki variasi berbeda, maka pengujian dilanjutkan menggunakan One

Way ANOVA dan Post hoc Tamhane’s.


18

Tabel V. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-4

KP 4 EEDK 4 TET 4 EEDK + TET 4

KP 4 - BB BB BB

EEDK 4 BB - BTB BTB

TET 4 BB BTB - BTB

EEDK + TET 4 BB BTB BTB -

Keterangan : EEDK = ekstrak etanol daun kirinyu (jam); TET = tetrasiklin (jam); KP

= kontrol pertumbuhan (jam); EEDK+TET = kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu

dan tetrasiklin (jam); BB = Berbeda Bermakna; BTB = Berbeda Tidak Bermakna

Hasil uji post hoc pada perlakuan pada jam ke-4 menunjukkan perlakuan

EEDK, TET dan EEDK+TET menunjukkan hasil berbeda bermakna terhadap

kontrol pertumbuhan yang berarti terdapat perbedaan jumlah bakteri yang

signifikan terhadap kontrol pertumbuhan. Sedangkan antara perlakuan EEDK dan

TET, EEDK dan EEDK+TET, TET dan EEDK+TET menunjukkan hasil berbeda

tidak bermakna yang berarti tidak terdapat perbedaan jumlah bakteri yang

signifikan.

Tabel VI. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-8


KP 8 - BB BB BB

EEDK 8 BB - BB BB

TET 8 BB BB - BTB

EEDK + TET 8 BB BB BTB -




Hasil uji post hoc pada perlakuan pada jam ke-8 menunjukkan antara TET

dan EEDK+TET menunjukkan hasil berbeda tidak bermakna yang berarti tidak

terdapat perbedaan jumlah bakteri yang signifikan. Sedangkan antara kontrol

pertumbuhan dan EEDK, kontrol pertumbuhan dan TET, kontrol pertumbuhan dan

EEDK+TET, EEDK dan TET, EEDK dan EEDK+TET menunjukkan hasil berbeda

bermakna yang berarti terdapat perbedaan jumlah bakteri yang signifikan.


19

Tabel VII. Hasil Uji Post Hoc Tamhane’s Perlakuan Jam Ke-24


KP 24 - BB BB BB

EEDK 24 BB - BB BB

TET 24 BB BB - BTB

EEDK + TET 24 BB BB BTB -




Hasil uji post hoc pada perlakuan pada jam ke-24 menunjukkan perlakuan

EEDK, TET dan EEDK+TET menunjukkan hasil berbeda bermakna terhadap

kontrol pertumbuhan yang berarti terdapat perbedaan jumlah bakteri yang

signifikan terhadap kontrol pertumbuhan. Hasil berbeda bermakna juga terdapat

antara perlakuan EEDK dan TET, EEDK dan EEDK+TET yang menunjukkan

terdapat perbedaan jumlah bakteri yang signifikan. Sedangkan antara perlakuan

TET dan EEDK+TET menunjukkan hasil tidak berbeda bermakna yang berarti

tidak terdapat perbedaan jumlah bakteri yang signifikan antara TET dan

EEDK+TET.

Pada penelitian yang dilakukan, hasil interaksi antara ekstrak tanaman dan

antibiotik mungkin dipengaruhi oleh perbandingan konsentrasi MIC yang

digunakan. Contohnya pada penelitian Aiyegoro et al. (2009), kombinasi antara

tetrasiklin dengan ekstrak daun Helichrysum pedunculatum pada konsentrasi 1/2

MIC yang diujikan pada bakteri Streptococcus faecalis menghasilkan interaksi

additive/indifference, namun pada konsentrasi 1 MIC menghasilkan interaksi

sinergis. Hal tersebut dapat ditemukan pada semua kombinasi ekstrak dan antibiotik

yang digunakan pada penelitian dan terlepas dari reaksi karakteristik Gram bakteri

yang digunakan. Apabila menggunakan konsentrasi yang berbeda, misalnya pada

konsentrasi MIC, diduga hasil pengujian interaksi dapat berubah. Namun hal ini

memerlukan penelitian lebih lanjut mengingat masih sedikit penelitian yang

membahas pengaruh konsentrasi terhadap interaksi kombinasi.


20

Selain dipengaruhi oleh konsentrasi, hasil interaksi diduga juga dapat

dipengaruhi oleh kesamaan target antara ekstrak tanaman dan antibiotik terhadap

bakteri. Pada penelitian Jayaraman et al. (2010), terjadi interaksi

additive/indifference antara senyawa fitokimia (protocatechuic acid, gallic acid,

quercetin dan myricetin) dengan trimethoprim yang diduga diakibatkan oleh

senyawa fitokimia tersebut berikatan pada dihydrofolate reductase (DFHR) yang

juga dihambat oleh trimethoprim. Kesamaan target menyebabkan penghambatan

kompetitif dan tidak terjadi penghambatan pada pertumbuhan bakteri. Kesamaan

target kemungkinan dapat menyebabkan terjadinya interaksi additive/indifference

pada kombinasi. Hal ini membutuhkan pengujian lebih lanjut untuk menjelaskan

mekanisme terjadinya interaksi additive/indifference antara ekstrak etanol daun

kirinyu dan tetrasiklin.

KESIMPULAN DAN SARAN

Hasil time-kill test menunjukkan ekstrak etanol daun kirinyu menunjukkan

efek bakteriostatik (penurunan < 3 log10 CFU/mL), sedangkan tetrasiklin dan

kombinasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin menunjukkan efek

bakterisidal (penurunan ≥ 3 log10 CFU/mL) pada jam ke-8 dan 24 terhadap

pertumbuhan bakteri S. aureus. Interaksi yang dihasilkan antara ekstrak etanol daun

kirinyu dan antibiotik tetrasiklin adalah additive/indifference yang ditandai dengan

perubahan < 2 log10 CFU/mL dibandingkan tetrasiklin.

Saran bagi penelitian selanjutnya adalah melakukan time-kill test dengan

konsentrasi ekstrak etanol daun kirinyu dan tetrasiklin yang berbeda, karena diduga

dengan menggunakan konsentrasi yang berbeda maka hasil interaksi yang

dihasilkan dapat berbeda. Konsentrasi yang dapat digunakan adalah 1 MIC.

Penelitian selanjutnya dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri S. aureus yang

resisten terhadap tetrasiklin sehingga dapat mengamati efek ekstrak etanol daun

kirinyu dan tetrasiklin apakah dapat mengatasi resistensi pada bakteri. Selain itu

dapat dilakukan pengujian fitokimia pada ekstrak etanol daun kirinyu sehingga

kandungan fitokimia dalam ekstrak dapat diketahui dan dapat memperkirakan

kandungan fitokimia yang memiliki peran dalam aktivitas antibakteri ekstrak.


21

DAFTAR PUSTAKA

Adwan, G., and Mhanna, M., 2008. Synergistic Effects of Plant Extracts and

Antibiotics on Staphylococcus aureus Strains Isolated from Clinical

Specimens. Middle-East Journal of Scientific Research., 3 (3), 134-139.

Aiyegoro, O.A., Afolayan, A.J., and Okoh, A.I., 2009. Synergistic Interaction of

Helichrysum pedunculatum Leaf Extracts with Antibiotics Against Wound

Infection Associated Bacteria. Biol Res. 42 (3), 327-337.

Atikah, D. 2016. Uji Efektivitas Gel Ekstrak Etanol Daun Gulma Siam

(Chromolaena odorata) Terhadap Penyembuhan Luka Sayat. Skripsi.

Universitas Sumatera Utara, 46.

Balouiri, M., Sadiki, M., and Ibnsouda, K., 2016. Methods for In Vitro Evaluating

Antimicrobial Activity : A Review. Journal of Pharmaceutical Analysis.,

6 (2), 75.

Barbosa, C., Beardmore, R., Schulenburg, H., and Jansen, G., 2018. Antibiotic

Combination Efficacy (ACE) Networks for A Pseudomonas aeruginosa

Model. PLoS Biol. 16 (4), 1-25.

Basri, D.F., and Khairon, R., 2012. Pharmacodynamic Interaction of Quercus

infectoria Galls Extract in Combination with Vancomycin against MRSA

Using Microdilution Checkerboard and Time-Kill Assay. Evid Based

Complement Alternat Med., 2012, 1-5.

Chudobova, D., Dostalova, S., Blazkova, I., Michalek, P., Ruttkay-Nedecky, B.,

Sklenar, M., Nejdl, L., Kudr, J., Gumulec, J., Timejova, K., Konecna, M.,

Vaculovicova, M., Hynek, D., Masarik, M., Kynicky, J., Kizek, R., and

Adam, V., 2014. Effect of Ampicillin, Streptomycin, Penicillin and

Tetracycline on Metal Resistant and Non-Resistant Staphylococcus

aureus. Int. J. Environ. Res. Public Health., 11 (3), 3233-3255.

Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014. M100-S24 – Performance

Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth

Informational Supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute,

74.

Cushnie, T.P.T., Lamb, A.J., 2005. Antimicrobial Activity of Flavonoids. Int. J.

Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356.

Departemen Kesehatan Repulik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum

Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta : Departemen Kesehatan RI, 31-32.

Dougherty, T.J., and Pucci, M.J., 2012. Antibiotic Discovery and Development.

London : Springer Science+Business Media, 156.

Engelkirk, P.G., and Duben-Engelkirk, J., 2008. Laboratory Diagnosis of Infectious

Diseases : Essentials of Diagnostic Microbiology. Philadelphia : Lipincott

Williams & Wilkins, 168.


22

Eze, E.A., Oruche, N.E., and Eze, C.N., 2013. Interaction of The Extracts of Three

Medicinal Plants with Antibiotics Against Some Antibiotic Resistant

Bacteria. Sci. Res. Essays., 8 (28), 1360-1367.

Fang, M., Chen, J.H., Xu, X.L., Yang, P.H., and Hildebrand, H.F., 2006.

Antibacterial Activities of Inorganic Agents on Six Bacteria Associated

with Oral Infections by Two Susceptibility Tests. International Journal of

Antimicrobial Agents. 27 (6), 513-517.

Fauzana, D.L., 2010. Perbandingan Metode Maserasi, Remaserasi, Perkolasi dan

Reperkolasi Terhadap Rendemen Ekstrak Temulawak (Curcuma

xanthorrhiza Roxb.). Institut Pertanian Bogor. 32.

Febrianasari, F., 2018. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Kirinyu

(Chromolaena odorata) Terhadap Staphylococcus aureus. Skripsi,

Universitas Sanata Dharma, 44-45.

Figueiredo, A.R., Campos, F., de Freitas, V., Hogg, T., and Couto, J.A., 2008.

Effect of Phenolic Aldehydes and Flavonoids on Growth and Inactivation

of Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii. Food Microbiology., 25

(1), 105-112.

Griffin, M.O., Fricovsky, E., Ceballos, G., and Villarreal, F., 2010. Tetracyclines:

A Pleitropic Family of Compounds with Promising Therapeutic

Properties. Review of The Literature. Am J Physiol Cell Physiol., 299 (3),

539-548.

Hanphakphoom, S., Thophon, S., Waranusantigul, P., Kangwanrangsan, N., and

Krajangsang, S., 2016. Antimicrobial Activity of Chromolaena odorata

Extracts against Bacterial Human Skin Infections. Modern Applied

Science 10 (2), 159-171.

Hemaiswarya, S., Kruthiventi, A.K., and Doble, M., 2008. Synergism Between

Natural Products and Antibiotics Against Infectious Diseases.

Phytomedicine., 15 (8), 639-648.

Jayaraman, P., Sakharkar, M.K., Lim, C.S., Tang, T.H., and Sakharkar, K.R., 2010.

Activity and Interactions of Antibiotic and Phytochemical Combinations

Against Pseudomonas aeruginosa In Vitro. Int. J. Biol. Sci. 6 (6), 556-566.

Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2011. Farmakope Herbal Indonesia.

Suplemen II. Edisi I. Jakarta : Kementerian Kesehatan Republik Indonesia,

169-171.

Kurniawati, V.N.D., 2017. Uji Kombinasi Antibiotik Amoksisilin dengan Ekstrak

Metanol Daun Sirih (Piper betle L.) Terhadap Pertumbuhan Pseudomonas

aeruginosa. Skripsi. Universitas Sanata Dharma, 16-18.

Levison, M.E., and Levison, J.H., 2009. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

of Antibacterial Agents. Infect Dis Clin North Am. 23 (4), 791-815.


23

Lorian, V., 2005. Antibiotics in Laboratory Medicine. 5th Ed. Philadelphia :

Lipincott Williams & Wilkins, 373.

Magiorakos, A.P., Srinivasan, A., Carey, R.B., Falagas, M.E., Giske, C.G.,

Harbarth, S., Hindler, J.F., Kahlmeter, G., Olsson-Liljequist, B., Paterson,

D.L., Rice, L.B., Steeling, J., Struelens, M.J., Vatopoulos, A., Weber, J.T.,

and Monnet, D.L., 2012. Multidrug-Resistant, Extensively Drug-Resistant

and Pandrug-Resistant Bacteria: An International Expert Proposal for

Interim Standard Definitions for Acquired Resistance. Clin Microbiol

Infect., 18 (3), 268-281.

McCreath, S.D., and Delgoda, R., 2017. Pharmacognosy: Fundamentals,

Applications and Strategy. London : Elsevier. 93, 98.

Mondal, K.C., Bhargava, D., and Shivapuri, J.N., and Kar, S., 2012. In Vitro

Antigonorrhoeal Activity and Extraction of Chemical Constituents from

The Leaves of Chromolaena odorata (Lin.) Locally Known as

‘BANMARA’. International Journal of Chemical and Analytical Science.

3 (7), 1487-1495.

Pratiwi, S.U.T., 2015. Anti-microbial and Anti-biofilm Compounds from

Indonesian Medicinal Plants. Thesis. Leiden University. 54.

PubChem, 2019. Ethanol. National Institutes of Health (NIH) (Online),

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ethanol. accessed 11 July

2019.

Quave, C.L., Plano, L.R.W., Pantuso, T., and Bennett, B.C., 2008. Effects of

Extracts from Italian Medicinal Plants on Planktonic Growth, Biofilm

Formation and Adherence of Methicillin-Resistant Staphylococcus

aureus. J. Ethnopharmacol. 118 (3), 418-428.

Rukayadi, Y., Lee, K., Han, S., Yong, D., and Hwang, J.K., 2009. In Vitro

Activities of Panduratin A against Clinical Staphylococcus Strains.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy., 53 (10), 4529-4532.

Santosaningsih, D., Santoso, S., Budayanti, N.S., Suata, K., Lestari, E.S., Wahjono,

H., Djamal, A., Kuntaman, K., Belkum, A., Laurens, M., Snijders, S.V.,

Willemse-Erix, D., Goessens, W.H., Verbrugh, H.A., and Severin, J.A.,

2016. Characterisation of Clinical Staphylococcus aureus Isolates

Harbouring mecA or Panton–Valentine Leukocidin Genes from Four

Tertiary Care Hospitals in Indonesia. Tropical Medicine and International

Health., 21 (5), 610-618.

Santoso, A.R., dan Hartini, Y.S., 2018. Aktivitas Antibakteri Kombinasi Ekstrak

Metanol Daun Sirih (Piper betle L.) dengan Ampisilin terhadap

Sthaphylococcus aureus. Kongres XX & Pertemuan Ilmiah Tahunan

Ikatan Apoteker Indonesia 2018, 1-5.


24

Silva, L.V., Araujo, M.T., Santos, K.R., and Nunes, A.P., 2011. Evaluation of The

Synergistic Potential of Vancomycin Combined With Other Antimicrobial

Agents Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and

Coagulase-Negative Staphylococcus spp strains. Mem Inst Oswaldo Cruz.

106 (1), 44-50.

Tamo, S.P.B., Essama, S.H.R., and Etoa, F.X., 2016. Plants Used in Bandjoun

Village (La'Djo) to Cure Infectious Diseases: An Ethnopharmacology

Survey and in-vitro Time-Kill Assessment of Some of Them against

Escherichia coli. The Journal of Phytopharmacology 5 (2), 56-70.

Taylor, T.A., and Unakal, C.G., 2017. Staphylococcus aureus. StatPearls (Online),

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK441868/. accessed 10 July 2019.

Wiegand, I., Hilpert, K., and Hancock, R.E.W., 2008. Agar and Broth Dilution

Methods to Determine The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of

Antimicrobial Substances. Nature Protocols., 3 (2), 163.

Willey, J.M., Sherwood, L.M., and Woolverton, C.J., 2008. Prescott, Harley, and

Klein’s Microbiology. 7th Ed. New York : McGraw-Hill Higher Education,

123-125, 151, 840-841.

Zusman, O., Avni, T., Leibovici, L., Adler, A., Friberg, L., Stergiopoulou, T.,

Carmeli, Y., and Paul, M., 2013. Systematic Review and Meta-Analysis of

In Vitro Synergy of Polymyxins and Carbapenems. Antimicrobial Agents

and Chemotherapy, 57 (10), 5104-5111.


25

LAMPIRAN

LAMPIRAN 1. Surat Determinasi Tanaman


26

Lampiran 2. Simplisia Kering Daun Kirinyu

Gambar 1. Simplisia Kering Daun Kirinyu

Lampiran 3. Ekstrak Etanol Daun Kirinyu

Gambar 2. Ekstrak Etanol Daun Kirinyu

Lampiran 4. Penetapan Kadar Air dengan Metode Destilasi Toluena

(a) (b)

Gambar 3. Penetapan Kadar Air (a) Volume Air Awal (b) Volume Air Akhir


27

Lampiran 5. Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Gambar 4. Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Perhitungan :

Kadar sari larut etanol= bobot ekstrak larutan

bobot simplisia x

100

20 x 100%

Replikasi 1

Kadar sari larut etanol= 0,1802 g

5 g x

100

20 x 100%

= 18,02%

Replikasi 2

Kadar sari larut etanol= 0,1813

5 g x

100

20 x 100%

= 18,13 %

Replikasi 3

Kadar sari larut etanol= 0,1805

5 g x

100

20 x 100%

= 18,05%

Rata-rata = (18,02 % + 18,13 % + 18,05 %) : 3

= 18,07 %


28

Lampiran 6. Sertifikat Kualitas Staphylococcus aureus


29

Lampiran 7. Perlakuan pada 96-Well Plate

(A) (B)

(C) (D) (E) (F)

Gambar 5. Perlakuan pada 96-Well Plate

Keterangan : (A) = ekstrak etanol daun kirinyu; (B) = tetrasiklin; (C) = kontrol

pertumbuhan; (D) = kontrol negatif aquades; (E) = kontrol negatif DMSO; (F) =

kontrol media

Lampiran 8. Selisih Optical Density Penentuan MIC

Perlakuan Selisih OD x SD

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

KP 0.754 0.697 0.787 0.746 0.046

KN A 0,891 1,113 0,991 0,998 0,111

KN D 0.799 0.776 0.742 0.772 0.029

EEDK 4 -0.075 -0.007 -0.102 -0.061 0.049

EEDK 2 0.056 -0.001 -0.025 0.01 0.042

EEDK 1 0.081 0.048 0.05 0.060 0.019

EEDK 0,5 0.177 0.164 0.125 0.155 0.027

EEDK 0,25 0.432 0.438 0.437 0.436 0.003

EEDK 0,12 0.58 0.579 0.615 0.591 0.021

TET 16 0.002 0.007 0.003 0.004 0.003

TET 8 0.064 0.048 0.051 0.054 0.009


30

TET 4 0.141 0.117 0.117 0.125 0.014

TET 2 0.16 0.178 0.172 0.17 0.009

TET 1 0.228 0.204 0.209 0.214 0.013

TET 0,5 0.258 0.268 0.221 0.249 0.025

Lampiran 9. Data Log Jumlah Bakteri Time-Kill Test

Perlakuan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 x SD

KP 0 4.290 4.267 4.276 4.278 0.011

KP 4 6.488 6.481 6.444 6.471 0.024

KP 8 7.294 7.301 7.262 7.286 0.021

KP 24 8.210 8.176 8.220 8.202 0.023

EEDK 0 4.255 4.210 4.258 4.241 0.027

EEDK 4 5.394 5.412 5.401 5.402 0.009

EEDK 8 5.653 5.663 5.643 5.653 0.010

EEDK 24 7.420 7.350 7.439 7.403 0.047

TET 0 4.238 4.161 4.299 4.233 0.069

TET 4 4.161 4.236 4.265 4.221 0.053

TET 8 4.173 4.155 4.243 4.191 0.046

TET 24 3.114 3.000 2.903 3.006 0.106

EEDK+TET 0 4.158 4.270 4.276 4.235 0.066

EEDK+TET 4 3.799 3.732 3.954 3.829 0.114

EEDK+TET 8 3.792 3.826 3.892 3.837 0.051

EEDK+TET 24 2.699 2.602 2.477 2.593 0.111


31

Lampiran 10. Time-Kill Test Kontrol Pertumbuhan

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 6. Hasil Time-Kill Test Kontrol Pertumbuhan

Keterangan: (a) = kontrol pertumbuhan jam ke-0 konsentrasi 10-1; (b) = kontrol

pertumbuhan jam ke-4 konsentrasi 10-3; (c) = kontrol pertumbuhan jam ke-8

konsentrasi 10-4; (d) = kontrol pertumbuhan jam ke-24 konsentrasi 10-5


32

Lampiran 11. Time-Kill Test Perlakuan EEDK

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 7. Hasil Time-Kill Test Perlakuan EEDK

Keterangan: (a) = EEDK jam ke-0 konsentrasi 10-1; (b) = EEDK jam ke-4

konsentrasi 10-2; (c) = EEDK jam ke-8 konsentrasi 10-3; (d) = EEDK jam ke-24

konsentrasi 10-4


33

Lampiran 12. Time-Kill Test Perlakuan TET

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 8. Hasil Time-Kill Test Perlakuan TET

Keterangan: (a) = TET jam ke-0 konsentrasi 10-1; (b) = TET jam ke-4 konsentrasi

10-1; (c) = TET jam ke-8 konsentrasi 10-1; (d) = TET jam ke-24 konsentrasi 10-1


34

Lampiran 13. Time-Kill Test Perlakun EEDK+TET

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 9. Hasil Time-Kill Test Perlakuan EEDK+TET

Keterangan: (a) = EEDK+TET jam ke-0 konsentrasi 10-1; (b) = EEDK+TET jam

ke-4 konsentrasi 10-1; (c) = EEDK+TET jam ke-8 konsentrasi 10-1; (d) =

EEDK+TET jam ke-24 konsentrasi 10-1


35

Lampiran 14. Kontrol Media, Kontrol NaCl dan Kontrol MHB Time-Kill

Test

(a) (b)

(c)

Gambar 10. Kontrol Media, Kontrol NaCl dan Kontrol MHB pada Time-Kill

Test

Keterangan : (a) = kontrol media; (b) = kontrol NaCl; (c) = kontol MHB


36

Lampiran 15. Perhitungan Koloni dengan Scan Colony Counter Kontrol

Pertumbuhan

Gambar 11. Hasil Scan Colony Counter Kontrol Pertumbuhan

Lampiran 16. Perhitungan Koloni dengan Scan Colony Counter Perlakuan

EEDK

Gambar 12. Hasil Scan Colony Counter Perlakuan EEDK


37


TET

Gambar 13. Hasil Scan Colony Counter Perlakuan TET


EEDK+TET

Gambar 14. Hasil Scan Colony Counter Perlakuan EEDK+TET


38

Lampiran 19. Kontrol Media, Kontrol NaCl pada Scan Colony Counter

Gambar 15. Hasil Scan Colony Counter Kontrol Media

Gambar 16. Hasil Scan Colony Counter Kontrol NaCl


39

Lampiran 20. Uji Statistika

Tests of Normality

Perlakuan

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Log KP 0 .224 3 . .984 3 .762

KP 4 .331 3 . .866 3 .284

KP 8 .322 3 . .880 3 .323

KP 24 .302 3 . .910 3 .417

EEDK 0 .365 3 . .797 3 .107

EEDK 4 .225 3 . .984 3 .756

EEDK 8 .175 3 . 1.000 3 1.000

EEDK 24 .308 3 . .901 3 .390

TET 0 .197 3 . .996 3 .872

TET 4 .279 3 . .939 3 .522

TET 8 .312 3 . .896 3 .372

TET 24 .188 3 . .998 3 .911

EEDK+TET 0 .369 3 . .788 3 .086

EEDK+TET 4 .268 3 . .950 3 .570

EEDK+TET 8 .250 3 . .967 3 .651

EEDK+TET 24 .200 3 . .995 3 .861

a. Lilliefors Significance Correction

Test of Homogeneity of Variances

Levene Statistic df1 df2 Sig.

Log Based on Mean 2.307 15 32 .023

Based on Median 1.009 15 32 .470

Based on Median and with

adjusted df

1.009 15 14.883 .493

Based on trimmed mean 2.207 15 32 .030

ANOVA

Log

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 119.953 15 7.997 2202.483 .000

Within Groups .116 32 .004

Total 120.070 47


40

Multiple Comparisons

Dependent Variable: Log

Tamhane

(I) Perlakuan (J) Perlakuan

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

KP 0 KP 4 -2.193333* .015202 .000 -2.47165 -1.91502

KP 8 -3.008000* .013744 .000 -3.22570 -2.79030

KP 24 -3.924333* .014903 .000 -4.18962 -3.65905

EEDK 0 .036667 .016905 1.000 -.32076 .39409

EEDK 4 -1.124667* .008498 .000 -1.22335 -1.02598

EEDK 8 -1.375333* .008838 .000 -1.47299 -1.27767

EEDK 24 -3.125333* .027877 .004 -4.07851 -2.17216

TET 0 .045000 .040483 1.000 -1.60554 1.69554

TET 4 .057000 .031700 1.000 -1.11033 1.22433

TET 8 .087333 .027663 1.000 -.85382 1.02848

TET 24 1.272000 .061342 .220 -1.47803 4.02203

EEDK+TET 0 .043000 .038952 1.000 -1.52428 1.61028

EEDK+TET 4 .449333 .066082 .910 -2.54400 3.44267

EEDK+TET 8 .441000 .030109 .307 -.63741 1.51941

EEDK+TET 24 1.685000 .064603 .146 -1.23259 4.60259

KP 4 KP 0 2.193333* .015202 .000 1.91502 2.47165

KP 8 -.814667* .018178 .000 -1.01413 -.61521

KP 24 -1.731000* .019070 .000 -1.93582 -1.52618

EEDK 0 2.230000* .020672 .000 2.00316 2.45684

EEDK 4 1.068667* .014621 .003 .71910 1.41823

EEDK 8 .818000* .014821 .004 .49810 1.13790

EEDK 24 -.932000* .030310 .010 -1.46919 -.39481

TET 0 2.238333* .042195 .009 1.11020 3.36647

TET 4 2.250333* .033859 .002 1.55139 2.94927

TET 8 2.280667* .030113 .001 1.75190 2.80944

TET 24 3.465333* .062486 .020 1.20583 5.72483

EEDK+TET 0 2.236333* .040728 .008 1.18705 3.28562

EEDK+TET 4 2.642667* .067145 .045 .12333 5.16200

EEDK+TET 8 2.634333* .032375 .001 2.00515 3.26352

EEDK+TET 24 3.878333* .065690 .018 1.43999 6.31668

KP 8 KP 0 3.008000* .013744 .000 2.79030 3.22570

KP 4 .814667* .018178 .000 .61521 1.01413

KP 24 -.916333* .017929 .000 -1.11155 -.72111


41

EEDK 0 3.044667* .019624 .000 2.81499 3.27434

EEDK 4 1.883333* .013098 .000 1.61012 2.15654

EEDK 8 1.632667* .013321 .000 1.38346 1.88188

EEDK 24 -.117333 .029605 .983 -.72378 .48911

TET 0 3.053000* .041692 .006 1.80910 4.29690

TET 4 3.065000* .033230 .002 2.27817 3.85183

TET 8 3.095333* .029403 .001 2.49846 3.69221

TET 24 4.280000* .062147 .014 1.89271 6.66729

EEDK+TET 0 3.051000* .040206 .005 1.88941 4.21259

EEDK+TET 4 3.457333* .066830 .029 .81226 6.10241

EEDK+TET 8 3.449000* .031716 .001 2.73920 4.15880

EEDK+TET 24 4.693000* .065367 .014 2.12819 7.25781

KP 24 KP 0 3.924333* .014903 .000 3.65905 4.18962

KP 4 1.731000* .019070 .000 1.52618 1.93582

KP 8 .916333* .017929 .000 .72111 1.11155

EEDK 0 3.961000* .020453 .000 3.73447 4.18753

EEDK 4 2.799667* .014310 .000 2.46612 3.13321

EEDK 8 2.549000* .014514 .000 2.24407 2.85393

EEDK 24 .799000* .030161 .017 .24921 1.34879

TET 0 3.969333* .042089 .003 2.81860 5.12007

TET 4 3.981333* .033726 .000 3.26594 4.69673

TET 8 4.011667* .029963 .000 3.47054 4.55280

TET 24 5.196333* .062413 .008 2.91073 7.48194

EEDK+TET 0 3.967333* .040617 .002 2.89625 5.03842

EEDK+TET 4 4.373667* .067078 .016 1.82851 6.91882

EEDK+TET 8 4.365333* .032235 .000 3.72122 5.00945

EEDK+TET 24 5.609333* .065621 .009 3.14506 8.07361

EEDK 0 KP 0 -.036667 .016905 1.000 -.39409 .32076

KP 4 -2.230000* .020672 .000 -2.45684 -2.00316

KP 8 -3.044667* .019624 .000 -3.27434 -2.81499

KP 24 -3.961000* .020453 .000 -4.18753 -3.73447

EEDK 4 -1.161333* .016384 .005 -1.60461 -.71805

EEDK 8 -1.412000* .016563 .002 -1.82068 -1.00332

EEDK 24 -3.162000* .031198 .000 -3.64084 -2.68316

TET 0 .008333 .042838 1.000 -1.00228 1.01895

TET 4 .020333 .034657 1.000 -.59865 .63932

TET 8 .050667 .031007 1.000 -.42103 .52236


42

TET 24 1.235333 .062921 .158 -.87760 3.34827

EEDK+TET 0 .006333 .041394 1.000 -.93065 .94332

EEDK+TET 4 .412667 .067551 .910 -1.96025 2.78558

EEDK+TET 8 .404333 .033208 .126 -.15358 .96224

EEDK+TET 24 1.648333 .066104 .101 -.64340 3.94007

EEDK 4 KP 0 1.124667* .008498 .000 1.02598 1.22335

KP 4 -1.068667* .014621 .003 -1.41823 -.71910

KP 8 -1.883333* .013098 .000 -2.15654 -1.61012

KP 24 -2.799667* .014310 .000 -3.13321 -2.46612

EEDK 0 1.161333* .016384 .005 .71805 1.60461

EEDK 8 -.250667* .007796 .001 -.33540 -.16593

EEDK 24 -2.000667* .027564 .013 -3.06697 -.93437

TET 0 1.169667 .040269 .111 -.57993 2.91926

TET 4 1.181667 .031425 .059 -.09597 2.45930

TET 8 1.212000* .027348 .037 .15765 2.26635

TET 24 2.396667 .061201 .069 -.42731 5.22064

EEDK+TET 0 1.167667 .038728 .102 -.50078 2.83611

EEDK+TET 4 1.574000 .065951 .179 -1.48889 4.63689

EEDK+TET 8 1.565667* .029820 .028 .37548 2.75585

EEDK+TET 24 2.809667 .064469 .056 -.17880 5.79814

EEDK 8 KP 0 1.375333* .008838 .000 1.27767 1.47299

KP 4 -.818000* .014821 .004 -1.13790 -.49810

KP 8 -1.632667* .013321 .000 -1.88188 -1.38346

KP 24 -2.549000* .014514 .000 -2.85393 -2.24407

EEDK 0 1.412000* .016563 .002 1.00332 1.82068

EEDK 4 .250667* .007796 .001 .16593 .33540

EEDK 24 -1.750000* .027671 .016 -2.77501 -.72499

TET 0 1.420333 .040342 .073 -.29439 3.13506

TET 4 1.432333* .031519 .037 .19435 2.67031

TET 8 1.462667* .027455 .023 .44967 2.47566

TET 24 2.647333 .061249 .056 -.15112 5.44579

EEDK+TET 0 1.418333 .038804 .067 -.21440 3.05107

EEDK+TET 4 1.824667 .065996 .134 -1.21427 4.86360

EEDK+TET 8 1.816333* .029918 .019 .66656 2.96611

EEDK+TET 24 3.060333* .064514 .047 .09629 6.02437

EEDK 24 KP 0 3.125333* .027877 .004 2.17216 4.07851

KP 4 .932000* .030310 .010 .39481 1.46919


43

KP 8 .117333 .029605 .983 -.48911 .72378

KP 24 -.799000* .030161 .017 -1.34879 -.24921

EEDK 0 3.162000* .031198 .000 2.68316 3.64084

EEDK 4 2.000667* .027564 .013 .93437 3.06697

EEDK 8 1.750000* .027671 .016 .72499 2.77501

TET 0 3.170333* .048233 .000 2.54449 3.79618

TET 4 3.182333* .041139 .000 2.72983 3.63484

TET 8 3.212667* .038115 .000 2.80360 3.62174

TET 24 4.397333* .066712 .002 3.03145 5.76321

EEDK+TET 0 3.168333* .046955 .000 2.57970 3.75696

EEDK+TET 4 3.574667* .071095 .006 1.99468 5.15466

EEDK+TET 8 3.566333* .039926 .000 3.13401 3.99866

EEDK+TET 24 4.810333* .069722 .002 3.29849 6.32218

TET 0 KP 0 -.045000 .040483 1.000 -1.69554 1.60554

KP 4 -2.238333* .042195 .009 -3.36647 -1.11020

KP 8 -3.053000* .041692 .006 -4.29690 -1.80910

KP 24 -3.969333* .042089 .003 -5.12007 -2.81860

EEDK 0 -.008333 .042838 1.000 -1.01895 1.00228

EEDK 4 -1.169667 .040269 .111 -2.91926 .57993

EEDK 8 -1.420333 .040342 .073 -3.13506 .29439

EEDK 24 -3.170333* .048233 .000 -3.79618 -2.54449

TET 4 .012000 .050539 1.000 -.57812 .60212

TET 8 .042333 .048110 1.000 -.58656 .67123

TET 24 1.227000* .072885 .023 .25055 2.20345

EEDK+TET 0 -.002000 .055376 1.000 -.59754 .59354

EEDK+TET 4 .404333 .076917 .719 -.70659 1.51525

EEDK+TET 8 .396000 .049557 .203 -.20498 .99698

EEDK+TET 24 1.640000* .075650 .012 .57281 2.70719

TET 4 KP 0 -.057000 .031700 1.000 -1.22433 1.11033

KP 4 -2.250333* .033859 .002 -2.94927 -1.55139

KP 8 -3.065000* .033230 .002 -3.85183 -2.27817

KP 24 -3.981333* .033726 .000 -4.69673 -3.26594

EEDK 0 -.020333 .034657 1.000 -.63932 .59865

EEDK 4 -1.181667 .031425 .059 -2.45930 .09597

EEDK 8 -1.432333* .031519 .037 -2.67031 -.19435

EEDK 24 -3.182333* .041139 .000 -3.63484 -2.72983

TET 0 -.012000 .050539 1.000 -.60212 .57812


44

TET 8 .030333 .040995 1.000 -.42195 .48262

TET 24 1.215000* .068398 .048 .01288 2.41712

EEDK+TET 0 -.014000 .049321 1.000 -.57636 .54836

EEDK+TET 4 .392333 .072679 .821 -.99881 1.78347

EEDK+TET 8 .384000 .042684 .098 -.07587 .84387

EEDK+TET 24 1.628000* .071336 .028 .29744 2.95856

TET 8 KP 0 -.087333 .027663 1.000 -1.02848 .85382

KP 4 -2.280667* .030113 .001 -2.80944 -1.75190

KP 8 -3.095333* .029403 .001 -3.69221 -2.49846

KP 24 -4.011667* .029963 .000 -4.55280 -3.47054

EEDK 0 -.050667 .031007 1.000 -.52236 .42103

EEDK 4 -1.212000* .027348 .037 -2.26635 -.15765

EEDK 8 -1.462667* .027455 .023 -2.47566 -.44967

EEDK 24 -3.212667* .038115 .000 -3.62174 -2.80360

TET 0 -.042333 .048110 1.000 -.67123 .58656

TET 4 -.030333 .040995 1.000 -.48262 .42195

TET 24 1.184667 .066622 .074 -.19180 2.56113

EEDK+TET 0 -.044333 .046828 1.000 -.63543 .54676

EEDK+TET 4 .362000 .071011 .907 -1.22994 1.95394

EEDK+TET 8 .353667 .039777 .104 -.07786 .78519

EEDK+TET 24 1.597667* .069636 .044 .07428 3.12106

TET 24 KP 0 -1.272000 .061342 .220 -4.02203 1.47803

KP 4 -3.465333* .062486 .020 -5.72483 -1.20583

KP 8 -4.280000* .062147 .014 -6.66729 -1.89271

KP 24 -5.196333* .062413 .008 -7.48194 -2.91073

EEDK 0 -1.235333 .062921 .158 -3.34827 .87760

EEDK 4 -2.396667 .061201 .069 -5.22064 .42731

EEDK 8 -2.647333 .061249 .056 -5.44579 .15112

EEDK 24 -4.397333* .066712 .002 -5.76321 -3.03145

TET 0 -1.227000* .072885 .023 -2.20345 -.25055

TET 4 -1.215000* .068398 .048 -2.41712 -.01288

TET 8 -1.184667 .066622 .074 -2.56113 .19180

EEDK+TET 0 -1.229000* .072046 .026 -2.23240 -.22560

EEDK+TET 4 -.822667 .089667 .092 -1.79234 .14700

EEDK+TET 8 -.831000 .067675 .156 -2.09561 .43361

EEDK+TET 24 .413000 .088583 .687 -.54116 1.36716

EEDK+TET 0 KP 0 -.043000 .038952 1.000 -1.61028 1.52428


45

KP 4 -2.236333* .040728 .008 -3.28562 -1.18705

KP 8 -3.051000* .040206 .005 -4.21259 -1.88941

KP 24 -3.967333* .040617 .002 -5.03842 -2.89625

EEDK 0 -.006333 .041394 1.000 -.94332 .93065

EEDK 4 -1.167667 .038728 .102 -2.83611 .50078

EEDK 8 -1.418333 .038804 .067 -3.05107 .21440

EEDK 24 -3.168333* .046955 .000 -3.75696 -2.57970

TET 0 .002000 .055376 1.000 -.59354 .59754

TET 4 .014000 .049321 1.000 -.54836 .57636

TET 8 .044333 .046828 1.000 -.54676 .63543

TET 24 1.229000* .072046 .026 .22560 2.23240

EEDK+TET 4 .406333 .076122 .725 -.74032 1.55299

EEDK+TET 8 .398000 .048314 .172 -.17149 .96749

EEDK+TET 24 1.642000* .074841 .014 .54182 2.74218

EEDK+TET 4 KP 0 -.449333 .066082 .910 -3.44267 2.54400

KP 4 -2.642667* .067145 .045 -5.16200 -.12333

KP 8 -3.457333* .066830 .029 -6.10241 -.81226

KP 24 -4.373667* .067078 .016 -6.91882 -1.82851

EEDK 0 -.412667 .067551 .910 -2.78558 1.96025

EEDK 4 -1.574000 .065951 .179 -4.63689 1.48889

EEDK 8 -1.824667 .065996 .134 -4.86360 1.21427

EEDK 24 -3.574667* .071095 .006 -5.15466 -1.99468

TET 0 -.404333 .076917 .719 -1.51525 .70659

TET 4 -.392333 .072679 .821 -1.78347 .99881

TET 8 -.362000 .071011 .907 -1.95394 1.22994

TET 24 .822667 .089667 .092 -.14700 1.79234

EEDK+TET 0 -.406333 .076122 .725 -1.55299 .74032

EEDK+TET 8 -.008333 .071999 1.000 -1.47250 1.45583

EEDK+TET 24 1.235667* .091929 .021 .24844 2.22290

EEDK+TET 8 KP 0 -.441000 .030109 .307 -1.51941 .63741

KP 4 -2.634333* .032375 .001 -3.26352 -2.00515

KP 8 -3.449000* .031716 .001 -4.15880 -2.73920

KP 24 -4.365333* .032235 .000 -5.00945 -3.72122

EEDK 0 -.404333 .033208 .126 -.96224 .15358

EEDK 4 -1.565667* .029820 .028 -2.75585 -.37548

EEDK 8 -1.816333* .029918 .019 -2.96611 -.66656

EEDK 24 -3.566333* .039926 .000 -3.99866 -3.13401


46

TET 0 -.396000 .049557 .203 -.99698 .20498

TET 4 -.384000 .042684 .098 -.84387 .07587

TET 8 -.353667 .039777 .104 -.78519 .07786

TET 24 .831000 .067675 .156 -.43361 2.09561

EEDK+TET 0 -.398000 .048314 .172 -.96749 .17149

EEDK+TET 4 .008333 .071999 1.000 -1.45583 1.47250

EEDK+TET 24 1.244000 .070644 .069 -.15639 2.64439

EEDK+TET 24 KP 0 -1.685000 .064603 .146 -4.60259 1.23259

KP 4 -3.878333* .065690 .018 -6.31668 -1.43999

KP 8 -4.693000* .065367 .014 -7.25781 -2.12819

KP 24 -5.609333* .065621 .009 -8.07361 -3.14506

EEDK 0 -1.648333 .066104 .101 -3.94007 .64340

EEDK 4 -2.809667 .064469 .056 -5.79814 .17880

EEDK 8 -3.060333* .064514 .047 -6.02437 -.09629

EEDK 24 -4.810333* .069722 .002 -6.32218 -3.29849

TET 0 -1.640000* .075650 .012 -2.70719 -.57281

TET 4 -1.628000* .071336 .028 -2.95856 -.29744

TET 8 -1.597667* .069636 .044 -3.12106 -.07428

TET 24 -.413000 .088583 .687 -1.36716 .54116

EEDK+TET 0 -1.642000* .074841 .014 -2.74218 -.54182

EEDK+TET 4 -1.235667* .091929 .021 -2.22290 -.24844

EEDK+TET 8 -1.244000 .070644 .069 -2.64439 .15639

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.


47

Lampiran 21. Surat Keterangan Analisis Data


48

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanol

Daun Kirinyu (Chromolaena odorata (L.) (Asteraceae))

dan Antibiotik Tetrasiklin Terhadap Pertumbuhan

Bakteri Staphylococcus aureus” bernama Veronica

Natasya, lahir di Bandung, Jawa Barat pada tanggal 24

Januari 1997. Penulis akrab dipanggil Vero yang

merupakan anak tunggal dari pasangan Herman Rusli dan

Anna Ursula. Penulis mengawali masa Pendidikan di TK

Dian Emas Bandung (2001-2003), SD Maria Bintang

Laut Bandung (2003-2009), SMP Waringin Bandung (2009-2012) dan SMA

Trinitas Bandung (2012-2015). Penulis melanjutkan Pendidikan sarjana di Program

Studi S1 Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama

menempuh pendidikan sarjana, penulis aktif dalam kegiatan antara lain tergabung

dalam kepanitiaan di kampus sebagai anggota divisi Table dan Operator kegiatan

Farmasi 3 On 3 (2015), anggota divisi Table dan Operator kegiatan PEPTIDA

(2016), anggota divisi Dana dan Usaha kegiatan World No Tobacco Day (2016),

koordinator divisi Dana dan Usaha FACTION (2016), koordinator divisi Publikasi

dan Dokumentasi kegiatan Pharmacy Performance (2017). Penulis juga menjadi

asisten dosen mata kuliah Mikrobiologi Farmasi (2017-2018) dan asisten dosen

mata kuliah Biologi Sel dan Molekuler (2017-2018).


pengaruh ekstrak etanol daun kirinyu ( (l.)...

Documents