pemeriksaan narkotika, psikotropika dan alkohol … · residu kemungkingan mengandung obat golongan...

60

PEMERIKSAAN NARKOTIKA, PSIKOTROPIKA DAN ALKOHOL SECARA KUALITATIF

A. Persiapan Sampel

1. Sampel berbentuk serbuk atau tablet

Satu tablet sampel (50 mg serbuk) larutkan dalam 10 mL metanol, bila perlu saring.

2. Sampel Ganja

Tanaman ganja (Cannabis plant, Cannabis herba) ± 400 mg cuplikan yang telah diserbuk haluskan, masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, tambah 10 ml petroleum eter atau toluen, dan kocok selama 1 jam, kemudian saring. Bila perlu tambahkan lagi pelarut hingga diperoleh volume 10 ml Damar ganja (Cannabis resin) ± 100 mg damar ganja dalam mortir, gerus dengan ± 2 ml toluen sampai terbentuk pasta. Dengan bantuan 8 ml toluen masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, kocok selama 1 jam dan saring. Hasis (Hasis oil, Cannabis oil) ± 50 mg hasis larutkan dalam 10 ml toluen.

3. Sampel cuplikan berbentuk cairan Ambil minimal 10 mL cairan, tanpa penambahan zat lain.

4. Spesimen darah/serum/plasma Persiapan spesimen dengan cara ekstraksi adalah sebagai berikut :

a. Prinsip

Pemisahan/isolasi spesimen dengan pelarut organik pada pH tertentu dari zat-zat yang mengganggu berdasarkan dengan kelarutannya. Hasil ekstraksi disaring dan dikeringkan sehingga didapat residu yang dapat dianalisis.

b. Peralatan

1) Vortex mixer 2) Shaker 3) Sentrifus 4) Tapered tube 5) Corong pisah 6) Corong 7) Batang pengaduk 8) Penangas air 9) Sonikator

61

c. Reagen

1) Pelarut organik (CHCl3) 2) Natrium sulfat anhidrat 3) Natrium hidroksida 4) Asam sulfat pekat 5) Buffer fosfat 6) Amonia 7) Natrium bikarbonat (NaHCO3)

d. Cara kerja 1) Ke dalam 4 mL spesimen tambahkan 2 mL buffer fosfat (pH 7,4)

dan 40 mL kloroform (CHCl3) kocok, kemudian tambahkan 2g Na2SO4 anhidrat kocok kembali untuk menghasilkan masa yang padat.

2) Tuangkan CHCl3 melalui saringan. 3) Ekstraksi kembali masa padat tersebut dalam 20 mL CHCl3

campur kedua hasil ekstraksi fraksi CHCl3. 4) Simpan masa padat yang ada. 5) Apabila terdapat salisilat, fraksi CHCl3 (fraksi A) ekstraksi dengan

NaHCO3 untuk menghilangkan salisilat yang dapat menghambat penentuan selanjutnya.

6) Pada fraksi CHCl3 tambahkan 8 mL NaOH 0,45 M (setara dengan 2 kali volume spesimen yang diambil).

7) Kocok selama 2 menit kemudian sentrifus. Larutan NaOH kemungkinan mengandung barbiturat dan senyawa asam lemah lainnya (fraksi B).

8) Cuci fraksi CHCl3 dengan sedikit air, buang air cucian, keringkan fraksi CHCl3 dengan Na2SO4 anhidrat, uapkan sampai kering. Residu kemungkingan mengandung obat-obat netral dan beberapa obat yang bersifat basa (fraksi C) seperti klordiazepoksid, diazepam dan nitrazepam.

9) Apabila spesimen masih ada, basakan dengan larutan ammonia, lalu ekstraksi 2 kali, masing-masing dengan 10 mL CHCl3 kemudian keringkan dengan Na2SO4 anhidrat. Uapkan larutan sampai kering. Residu kemungkingan mengandung obat golongan basa (fraksi D).

10) Jika tidak tersedia sisa spesimen awal maka fraksi C yang telah diperiksa larutkan dengan CHCl3 dan ekstraksi dengan H2SO4 0,5 M. Tambahkan ekstrak ke masa padat H2SO4 pada butir 3 di atas. Basakan dengan larutan ammonia, ekstraksi 2 kali dengan 10 mL CHCl3. Keringkan dengan Na2SO4 anhidrat, kemudian uapkan sampai kering.

62

Residu kemungkinan mengandung obat golongan basa (fraksi D).

Ekstraksi tersebut di atas dapat dilihat pada skema IV.I di bawah ini :

Skema IV.1 Ekstraksi Darah/Serum/Plasma

Ekstraksi dengan NaOH Ekstraksi Dengan

H2SO4 0,5 M

Masa padat Sulfat

Basakan dengan ammonia Ekstraksi dengan CHCl3

CHCl3 (bila ada salisilat Ekstraksi dengan NaHCO3

(Fraksi A)

Ekstraksi dengan CHCl3

Spesimen (pH 7,4)

Spesimen

Fraksi NaOH Asam lemah (Fraksi B)

Fraksi CHCl3 Obat netral (Fraksi C)

Fraksi CHCl3 Obat Gol Basa

(fraksi D)

63

5. Ekstraksi urin/cairan lambung

b. Prinsip Pemisahan/isolasi spesimen dengan pelarut organik pada pH tertentu dari zat-zat yang mengganggu berdasarkan kelarutannya. Hasil ekstraksi disaring dan dikeringkan sehingga didapat residu yang dapat dianalisis.

c. Peralatan

1) Vortex mixer 2) Shaker 3) Sentrifus 4) Tapered tube 5) Corong pisah 6) Corong 7) Batang Pengaduk 8) Penangas air 9) Sonikator

d. Reagen

1) Pelarut organik (Eter) 2) Natrium sulfat anhidrat 3) Natrium hidroksida 4) Asam sulfat pekat 5) Asam tartrat atau asam fosfat 6) Amonium sulfat 7) Kloroforom (CHCl3)

e. Cara Kerja 1) Tambah 10 mL urin dengan asam fosfat atau asam tartrat untuk

membuat pH = 3 2) Ekstraksi 2 kali, masing-masing dengan 30 mL eter, campur hasil

ekstraksi. 3) Cuci dengan 5 mL air dan tambahkan air cucian ke dalam

spesimen 4) Simpan fraksi air untuk ekstraksi selanjutnya 5) Fraksi eter di atas ekstraksikan dengan 5 mL larutan natrium

bikarbonat jenuh 6) Fraksi eter ekstraksi kembali dengan 5 mL NaOH 0,45 N dan

simpan sebagian hasil ekstraksi untuk pemeriksaan barbiturat dan beberapa substansi asam lemah lainnya, misalnya klordiazepoksid (Fraksi B) Sebagian lain dari fraksi eter di atas dicuci kembali dengan air, saring hasil cucian dan tambahkan dengan Na2SO4 anhidrat, uapkan sampai kering.

64

Residu kemungkinan mengandung obat-obat netral (Fraksi C) 7) Fraksi air pada butir 3) tambah dengan amonia untuk membuat

pH = 8 8) Ekstraksi sebanyak 2 kali masing-masing dengan 10 mL CHCl3 9) Cuci campuran ekstrak fraksi CHCl3 dengan air, kemudian saring

dan tambahkan dengan sedikit asam tartrat untuk menghindari hilangnya zat-zat yang mudah menguap.

10) Uapkan sampai kering, residu kemungkinan mengandung antara lain golongan benzodiazepin : klordiazepoksid, diazepam, nitrazepam (Fraksi D). Untuk ekstraksi cairan lambung dilakukan seperti ekstraksi pada urin dengan tambahan cara kerja spesimen yang akan diekstraksikan sebagai berikut : Tambahkan ke dalam spesimen ammonium sulfat (padat berlebihan) bersama-sama dengan beberapa tetes asam fosfat 10 %, panaskan, kocok dan saring. Fitrat dilakukan seperti cara kerja di atas

Ekstraksi di atas dapat dilihat pada skema IV.2 di bawah ini :

Skema IV.2 Ekstraksi Cairan Lambung

Bikarbonat As. Kuat

(Fraksi A)

Ekstraksi dengan Na. Bikarbonat

Ekstraksi dengan CHCl3

Fraksi eter Fraksi air (pH 8)

Ekstraksi dengan eter

Spesimen (pH 3)

Fraksi eter diekstraksi Dengan NaOH

Fraksi CHcl3

Fraksi NaOH (Fraksi D)

NaOH Asam lemah (Fraksi B)

Eter netral (Fraksi C)

65

Isi dari Fraksi A, B, C dan D dapat dilihat pada table IV.1 di bawah ini :

Tabel IV.1 Isi dari Fraksi A, B, C dan D

Fraksi A Fraksi B Fraksi C Fraksi D

Salisilat Barbiturat Kabromal Amitriptilin Kloropropamid Klodiazepoksid Amfetamin Glutimid Etklorvynol Parasetamol Etinamet Klordiazepoksid Fenil Butazon Glutetimid Klorpromazin Fenitoin Meprobamat Kodein Metakualon Desipramin Nitrazepam Dekstroproposifen Parasetamol Diazepam Penazon Ergot Alkaloid Flurazepam Imipramin Isokarboksazid Metakualon Metilamfetamin Morfin Nitrazepam Notrifilin Orfenadrine Fenezlin Fenmetrazin Fentemin Kuinin Bromazepam

Keterangan. : Nama obat yang hurufnya dicetak tebal yang dibahas dalam buku ini.

B. Pemeriksaan Skrining

Pemeriksaan pendahuluan (Screening Test) adalah pemeriksaan laboratorium sebagai upaya penyaring untuk mengetahui ada/tidaknya dan jenis obat yang menimbulkan efek toksis atau efek gangguan kesehatan. Pemeriksaan pendahuluan (ScreeningTest) dapat dilakukan dengan Card/Strip Test (untuk spesimen urin) dan Reaksi Warna (untuk sampel sediaan farmasi).

66

Penafsiran hasil Analisis kualitatif dari sampel biologik akan memberikan informasi apakah subyek yang bersangkutan menggunakan obat terlarang atau tidak. Adanya metabolit menunjukkan bahwa zat/obat tersebut telah dikonsumsi dan termetabolisme dalam badan. Pemeriksaan skrining positif berarti suatu obat/metabolitnya terdapat dalam urin sebanyak/lebih banyak dari batas deteksi alat. Pengeluaran dari badan dan konsentrasinya dalam urin bergantung pada faktor-faktor sebagai berikut : cara pemakaian, lama dan seringnya penggunaan, fungsi organ, kecepatan metabolisme obat, kondisi fisik dari subyek, umur, jenis kelamin, waktu pengambilan sampel, pengenceran dll.

1. Tes Immunoassay (Card/Strip Test)

a. Prinsip Adanya zat tertentu dalam urin ditentukan secara Rapid Immunoassay (antigen-antibodi)

b. Alat Pipet

c. Reagen Card/Strip Test

d. Cara kerja Siapkan Card/Strip Test untuk pemeriksaan masing-masing obat 1) Card Test

a) Teteskan 3 tetes spesimen urin pada lubang spesimen yang terdapat dalam masing-masing card test

b) Tunggu beberapa saat sesuai dengan petunjuk manual 2) Strip Test

a) Celupkan strip test ke dalam urin sampai batas yang ditentukan b) Tunggu beberapa saat sesuai dengan petunjuk manual

e. Pembacaan hasil

1) Card Test a) Hasil - (negatif) bila tampak 2 garis pada huruf C dan T b) Hasil + (positif) bila tampak 1 garis pada huruf C c) Atau sesuai petunjuk manualnya

2) Strip Test a) Hasil - (negatif) bila tampak 2 garis pada huruf C dan T b) Hasil + (positif) bila tampak 1 garis pada huruf C c) Atau sesuai petunjuk manualnya

67

Pemilihan metode, peralatan serta reagen untuk skrining haruslah yang mempunyai batas deteksi sama atau lebih rendah dari batas deteksi/ cut off yang direkomendasikan pada Tabel IV.2 di bawah ini :

Tabel IV.2

Batas Deteksi Pemeriksaan Skrining

Jenis / golongan zat Batas deteksi (ng/mL)

Kanabis 50

Kokain 300

Opiat 300

Metadon 300

Amfetamin 1000

Benzodiazepin 200

Methaqualone 300

Propoksifen 300

Barbiturat 200

Fensiklidin 25

Menurut UK Laboratory Guidelines for Legally Defensible Workplace Drug Testing dan SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration) dari Amerika Serikat.

• Pemeriksaan skrining yang memberikan hasil negatif tidak dilanjutkan dengan pemeriksaan konfirmasi.

• Bila hasil pemeriksaan Card/Strip Test Positif belum menjamin

+ (positif) untuk spesimen yang diperiksa, pemeriksaan harus dilanjutkan dengan pemeriksaan Konfirmasi.

• Untuk pemeriksaan penyidikan/penegakan hukum, pemeriksaan

konfirmasi yang diakui adalah yang menggunakan metoda GCMS/HPLC.

• Untuk menjaga mutu pemeriksaan setiap 10 kali pemeriksaan

spesimen urin lakukan pemeriksaan minimal terdapat 1 kontrol urin positif dari jenis zat yang diperiksa dan kontrol negatif (blanko urin).

68

2. Reaksi warna

Pemeriksaan pendahuluan (Screening Test) dengan Reaksi Warna dapat dilakukan dengan beberapa metode sebagai berikut : Untuk Golongan Narkotika dan Psikotropika a. Metode Marquis b. Metode Mecke c. Metode Frohde d. Metode Simon e. Metode Bratton Marshall f. Metoda Liebermann g. Metode Fast Blue B h. Tes Duquenois Untuk pemeriksaan alkohol a. Kalium bikromat b. Mikrodifusi c. Metanol d. Aseton Pemeriksaan hanya untuk mengarahkan kemungkinan jenis zat yang terdapat dalam sampel, sehingga hasilnya harus dilanjutkan dengan tes konfirmasi karena zat selain Narkoba juga mempunyai kemungkinan memberikan hasil yang sama (false positif). Untuk golongan benzodiazepin reaksi warna tidak dianjurkan untuk dipakai karena jenis zat dalam golongan ini yang sangat beragam, pemeriksaan skrining yang dianjurkan adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Zat yang digunakan untuk pereaksi harus dijaga mutunya untuk menjamin bahwa zat yang digunakan tidak mengalami dekomposisi, yang dapat merubah warnanya dan mengacaukan hasil pemeriksaan. a. Metode Marquis

1) Prinsip

Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan formaldehid dalam suasana asam sulfat pekat

2) Alat

a) Pipet tetes b) Pipet c) Vortex mixer d) Sentrifus

69

3) Reagen a) Pereaksi Marquis

8-10 tetes formaldehid 40 % diteteskan ke dalam 10 mL asam sulfat pekat

b) Eter c) Natrium hidroksida (NaOH) 4 N d) Etanol 95 %

4) Cara Kerja

Untuk pemeriksaan urin a) Masukkan 3 mL urin ke dalam tabung sentrifus b) Tambahkan NaOH 4 N sampai pH 9-10 c) Ekstraksi dengan 5 mL eter, masukkan dalam vortex mixer dan

sentrifus d) Ekstrak eter pisahkan dan uapkan sampai kering e) Residu larutkan dalam 1 mL etanol 95 % (secukupnya),

keringkan lagi f) Tambahkan 1 tetes larutan pereaksi Untuk pemeriksaan sampel obat/makanan Letakkan 1-2 mg sampel bubuk/1-2 tetes bila berbentuk cairan ke dalam lekukan plat tetes, tambahkan pereaksi, tak lebih dari 3 tetes.

5) Pembacaan Hasil

Tabel IV.3 Hasil Tes Warna Metode Marquis

Zat kimia Marquis Mecke Frohde Heroin

ungu (purple violet)

hijau tua

ungu abu-abu/ungu

Morphine ungu (purple violet) hijau tua ungu abu-abu/ungu Codeine ungu (purple violet) hijau/biru Biru/hijau 6 acetylmorphine ungu (purple violet) hijau tua Kuning/hijau Acetylcodeine ungu (purple violet) hijau tua Ungu, warna memucat Papaverine tidak berwarna biru tua Hijau muda Noscapine kuning terang hijau/biru Merah cherry Diazepam jingga Nitrazepam, Bromazepam, Lorazepam dan Klordiazepoksid

kuning (setelah didiamkan semalam

Amphetamin dan metamfetamin

oranye coklat untuk membedakan amfetamin dan metamfetamin gunakan pereaksi Simon.

70

b. Metode Mecke

1) Prinsip Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan asam selenius dalam suasana asam sulfat pekat

2) Alat

a) Pipet tetes b) Pipet c) Vortex mixer (untuk urin) d) Sentrifus(untuk urin)

3) Reagen

a) Pereaksi Mecke : 0,25 gram asam selenius larutkan dalam 25 mL asam sulfat pekat panas

b) Eter (untuk urin) c) Natrium hidroksida (NaOH) 4 N (untuk urin) d) Etanol 95 % (untuk urin).

4) Cara kerja Lihat Metode Marquis

5) Pembacaan Hasil

Lihat Metode Marquis

c. Metode Frohde 1) Prinsip

Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan asam molibdat/natrium molibdat dalam suasana asam sulfat pekat

2) Alat

a) Pipet tetes b) Pipet c) Vortex mixer (untuk urin) d) Sentrifus(untuk urin)

71

3) Reagen

a) Pereaksi Frohde : 1,0 gram asam molibdat/natrium molibdat larutkan dalam 100 mL asam sulfat pekat panas, larutan akhir haruslah tak berwarna


4) Cara Kerja

Lihat Metode Marquis

5) Pembacaan Hasil Lihat Metode Marquis

Tabel IV.4 Hasil Tes Warna Reagen Frohde

Warna Senyawa Kuning Hidrokodon, petidin Biru kekuningan Oksikodon HCL Oranye Difenhidramin, flurazepam, promazin Hijau Trifluoperazine, triflupromazine,

klorfentermin, kodein, meskalin, oksikodon, feniltoloxamin

Hijau kekuningan LSD Biru Pentazocin Merah Amfetamin, klorpromazin HCl Meah keabuan Propoksifen HCl Merah keunguan Alimemazine, diasetilmorfin,

promethazin, propilhexadrin, asam salisilat, tetrasiklin, thioridazine

Coklat Efedrin, meskalin Coklat kemerahan Doxepin HCl Hitam kecoklatan Opium Hitam kehijauan MDMA HCl

d) Metode Simon

1) Prinsip Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan Reagen Simon dalam suasana basa

72

2) Alat

a) Pipet tetes b) Pipet c) Vortex mixer (untuk urin) d) Sentrifus (untuk urin)

3) Reagen

a) Pelarut I = 20 % larutan sodium karbonat akuos Pelarut II = 50 % larutan asetaldehida etanolik Pelarut III = 1 % larutan sodium nitroprusida akuos


4) Cara Kerja

1) Untuk pemeriksaan urin lakukan dulu seperti pada metode Marquis, langkah a-e

2) Letakkan sejumlah kecil sampel pada lekukan plat tetes dan campurkan dengan larutan I satu tetes, lalu tambahkan 2 tetes larutan II, kemudian tambahkan beberapa tetes larutan III memberikan warna biru untuk metamfetamin dan amin sekunder lain. Amfetamin dan amin primer lain memberikan warna merah muda perlahan sampai merah cherry. Tes ini dapat membedakan amfetamin dan metamfetamin.

5) Pembacaan Hasil

Hasil akhir memberikan warna biru untuk metamfetamin dan amin sekunder lain. Amfetamin dan amin primer lain memberikan warna merah muda perlahan sampai merah cherry. Tes ini dapat membedakan amfetamin dan metamfetamin. Namun beberapa zat tambahan dapat memberikan negatif palsu.

73

Tabel IV. 5 Reaksi Warna Untuk Derivat Amfetamin

Senyawa Marquis Simon

Amfetamin Oranye cerah coklat Coklat/NR PMA NR hijau terang Merah muda terang* DMA Hijau hijau tua Merah muda suram* DOB Hijau kekuningan hijau Merah muda terang*

DOET Coklat kekuningan Merah muda terang*

STP Kuning Merah muda terang*

MDA Hitam Merah muda terang*

TMA Merah oranye Merah muda terang*

MMDA Ungu Merah muda terang*

MDMA Hitam Biru tua Metamfetamin Oranye/coklat merah Biru tua

NR = no reaction/tidak bereaksi * = warna reagen, dianggap negatif

e. Metode Bratton Marshall

1) Prinsip

Pembentukan senyawa berwarna violet dengan natrium nitrit dan asam sulfamat dalam suasana asam

2) Alat. a) Tabung reaksi b) Pipet tetes

3) Reagen

a) Asam sulfat (H2SO4) 10 % b) Natrium nitrit (NaNO2) 0,1 % harus dibuat baru c) Asam sulfamat 0,5 % d) N-1 naftilendiamin dihidroklorid 0,1 %

74

4) Cara Kerja a) Ke dalam tabung reaksi masukkan 4 mL urin b) Tambahkan 1 tetes H2SO4 10 % dan 1 tetes natrium nitrit 0,1 % c) Biarkan selama 0,5 menit d) Tambahkan 1 tetes larutan asam sulfamat 0,5 % dan biarkan

0,5 menit e) Teteskan larutan N-1 naftilendiamin dihidroklorid 0,1 %

5) Pembacaan Hasil

f. Metode Liebermann

1) Prinsip Sampel yang diperiksa setelah diekstraksi dengan eter pada pH 3-4 (HCl 2 N), bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana H2SO4 pekat membentuk senyawa berwarna. Tes dilakukan untuk memberi warna jelas pada fenol.

2) Alat

a) Tabung reaksi b) Sentrifus c) Waterbath d) Pipet tetes e) Pipet ukur

3) Reagen

a) HCl 2 N b) Eter c) Pereaksi Liebermann d) 1g NaNO2 atau KNO2 dalam 10 mL H2SO4 pekat

4) Cara Kerja

a) Ke dalam tabung reaksi masukkan 2 mL urin kemudian tambahkan HCl 2 N sampai pH 3-4

b) Ekstraksi dengan 5 mL eter selama 15 menit c) Kemudian sentrifus selama 5 menit d) Keringkan ekstrak di waterbath e) Residu yang didapat tambahkan 2-3 tetes pereaksi Liebermann

Apabila terbentuk warna violet secara perlahan-lahan diduga spesimen mengandung Nitrazepam, sehingga perlu dilakukan pemeriksaan lebih lanjut (Konfirmasi Test).

75

5) Pembacaan Hasil Contoh pada tabel berikut (lengkapnya baca Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons)

Warna Senyawa

Merah oranye Phenylmethylbarbituric acid Coklat Haloperidol Hitam Diamorfin/heroin

g. Metode Garam Fast Blue B (1)

1) Prinsip Sampel diekstraksi dengan petroleum eter, kemudian direaksikan dengan Garam Fast Blue B membentuk senyawa berwarna

2) Alat a) Kertas saring b) Spatel c) Pipet tetes

3) Reagen

a) Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-anisidinetetrazolium klorida) encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium sulfat anhidrous (1 :100)

b) Larutan I : Petroleum eter Larutan II : Larutan cair dari natrium bikarbonat 10 % (w/w)

4) Cara Kerja

a) Lipat 2 kertas saring menjadi seperempat, buka sebagian untuk membentuk corong

b) Letakkan sejumlah kecil bubuk tanaman kanabis atau resin atau setetes kecil kanabis cair pada bagian tengah kertas sebelah atas

c) Tambahkan 2 tetes larutan 1 d) Biarkan cairan sampai menembus kertas sebelah bawah e) Pisahkan kedua kertas saring f) Buang kertas bagian atas dan biarkan kertas bagian bawah

mengering g) Tambahkan sejumlah kecil reagen padat pada kertas saring

bawah dan tambahkan 2 tetes larutan 2

76

5) Pembacaan Hasil Warna noda merah keunguan pada bagian tengah kertas saring menunjukkan adanya kanabis, warna ini adalah kombinasi bermacam warna dari berbagai kanabinoid yang berbeda yang adalah komponen mayor dari kanabis; THC=merah, CBN = ungu, CBD = oranye.

Catatan : 1. Reagen padat berwarna putih/putih kekuningan saat baru

dibuat. Simpan reagen dalam kantong plastik pada tempat kering dingin, dianjurkan di dalam freezer. Jika reagen terdekomposisi, ia akan berubah warna menjadi keabuan dan harus dibuang.

2. Fast Blue B bersifat potensial karsinogenik, dianjurkan menggantinya dengan dye Fast blue B.

3. Untuk meningkatkan spesifisitas tes, sangatlah penting untuk menggunakan materi yang diperiksa sesedikit mungkin, tak lebih dari ujung korek api dan menggunakan 2 kertas saring. Kertas saring sebelah atas yang dibuang sebelum terjadinya warna, mencegah ekstraksi kembali dyes yang ada pada materi tanaman sebelum mencapai kertas saring bawah dan menghasilkan reaksi positif palsu.

4. Larutan 2 menghasilkan kondisi basa yang akan meningkatkan intensitas reaksi warna antara kanabinoid dan garam Fast Blue B.

g. Metode Garam Fast Blue B (2)

1) Prinsip Sampel diekstraksi dengan kloroform, kemudian direaksikan dengan Garam Fast Blue B membentuk senyawa berwarna

2) Alat a) Tabung reaksi b) Spatel c) Pipet tetes d) Pipet ukur

3) Reagen a) Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-anisidinetetrazolium

klorida) Encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium sulfat anhidrous (2,5 :100)

b) Larutan I : Kloroform Larutan II : Larutan natrium hidroksida cair 0,1 N

77

4) Cara Kerja

a) Letakkan sejumlah kecil zat yang akan diperiksa dalam tabung reaksi

b) Tambahkan sedikit sekali reagen padat dan 1 mL larutan I c) Kocok tabung selama 1 menit d) Tambahkan 1 mL larutan II e) Kocok tabung reaksi selama 2 menit f) Tegakkan tabung rekasi selama 2 menit

5) Pembacaan Hasil Warna, seperti pada metode I, pada lapisan cairan kloroform bagian bawah menunjukkan hasil positif. Warna dari lapisan atas diabaikan. Catatan : Perhatikan catatan di atas.

i. Tes Duquenois

1) Prinsip Cuplikan bereaksi dengan asetaldehid/vanilin dalam suasana asam sehingga terjadi perubahan warna yang larut dalam kloroform.

2) Alat

a) Tabung reaksi b) Pipet tetes c) Vorteks Mixer

3) Reagen

a) Larutan I: Lima tetes asetaldehida dan 0,4 g vanilin dilarutkan dalam 20 mL etanol 95 %

b) Larutan II : Asam Hidroklorida pekat c) Larutan III : Kloroform Catatan Larutan I harus disimpan dalam tempat gelap dan dingin, buang bila ada perubahan warna menjadi kuning tua

4) Cara kerja a) Masukkan sedikit zat yang akan diperiksa ke dalam tabung

reaksi b) kocok dengan 2 mL larutan I selama 1 menit c) tambahkan 2 mL larutan II, kocok campuran

78

d) Biarkan selama 10 menit, jika muncul warna, tambahkan 2 mL larutan III.

5) Pembacaan Hasil

Jika lapisan bagian bawah (kloroform) menjadi berwarna ungu violet, menunjukkan adanya produk kanabis.

j. Kalium Bikromat

1) Prinsip Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi antara etanol dalam spesimen urin dengan kalium bikromat dalam suasana asam.

2) Alat

a) Kertas saring Whatman (Glass-Fibre filter paper) b) Tabung reaksi c) Penangas air

3) Reagen

a) Larutan kalium bikromat (K2Cr2O7) 2,5 % b) Asam sulfat (H2SO4) 50 %

4) Cara Kerja

a) Masukkan 5 mL spesimen urin dalam tabung reaksi, lalu tutup b) Pada kertas saring teteskan K2Cr2O7 tambahkan H2SO4 c) Masukkan kertas saring tersebut dibagian atas leher tabung d) Sumbat mulut tabung dengan gabus dan panaskan pada

penangas air suhu 100° C selama 2 menit 5) Interpretasi Hasil

a) Perubahan warna dari kuning menjadi hijau menandakan alkohol positif.

b) Etanol memberikan reaksi positif bila kadarnya lebih dari 40 mg %.

k. Mikrodifusi

1) Prinsip

Di dalam tempat yang kedap, alkohol dalam spesimen urin akan menguap dan bereaksi dengan kalium bikromat dalam suasana asam sehingga terjadi perubahan warna.

79

2) Alat a) Cawan Conway b) Pipet ukur

3) Reagen

Kalium bikromat 0,5 g Kalium bikromat dalam 100 ml asam sulfat 60 %

4) Cara Kerja

a) Tempatkan spesimen di bagian tepi cawan sampai tertutup dasarnya

b) Tambahkan beberapa ml kalium bikromat di sekitar tempat spesimen tersebut.

c) Tutup rapat cawan tersebut dan inkubasi pada suhu 37° C selama 1 jam

5) Interpretasi Hasil

Warna kalium bikromat akan berubah dari kuning menjadi hijau selanjutnya menjadi biru.

l. Metanol 1) Prinsip

Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi antara etanol dengan kalium bikromat dalam suasana asam.

3) Alat a) Tabung reaksi b) Pipet tetes

4) Reagen

a) Larutan kalium bikromat (K2Cr2O7) 2,5 % dalam asam sulfat (H2SO4) 50 %

b) Asam kromotropat c) Etanol

4) Cara Kerja

1) Ke dalam 1 ml urin, tambahkan 1 tetes K2Cr2O7 2,5 % dalam (H2SO4) 50 %

2) Biarkan pada suhu kamar selama 5 menit 3) Tambahkan 1 tetes etanol dan beberapa mg asam kromotropat 4) Tambah H2SO4 sehingga timbul suatu lapisan pada dasar

tabung,

80

5) Interpretasi hasil

Warna ungu pada lapisan pemisah menunjukkan adanya metanol. Catatan : formaldehid akan memberikan reaksi positif pada uji ini.

m. Aseton (spesimen darah, urin dan cairan tubuh lain)

1) Prinsip Terbentuknya warna violet

2) Alat

Tabung reaksi 3) Reagen

Tablet acetest (ames Co) atau produk lain yang sejenis 4) Cara Kerja

Teteskan beberapa tetes darah dan urin pada tablet acetest biarkan selama 1-10 menit

5) Interpretasi Hasil

Warna violet menandakan aseton positif, dengan sensitivitas reaksi = 100 ppm

3. Uji kelarutan /Anion tes

Prinsip : Menggunakan kelarutan dikombinasi dengan beberapa reaksi tertentu di mana hasilnya ditentukan dengan adanya presipitat/endapan. Tes anion dapat dilakukan untuk sampel opiat dengan pengecualian opium mentah. Morfin biasa didapat dalam bentuk garam hidroklorida, garam sulfat, basa bebas, terkadang garam tartrat. Heroin biasa terdapat dalam bentuk basa bebas atau garam hidroklorida. Basa Basa Heroin larut dalam CCl4, tetapi garam heroin jenis lain tidak larut sama sekali. Basa morfin tidak larut dalam air dan larut sedikit dalam benzene dan kloroform. Garam hidroklorida Heroin hidroklorida larut dalam kloroform dan metilen klorida. Heroin tartrat, heroin sitrat dan klorida anorganik tidak larut dengan pelarut tersebut. Garam morfin pada dasarnya tidak larut dalam kloroform dan

81

benzene, basanya larut sebagian dalam kedua pelarut. Jika klorida larut air di reaksikan dengan pelarut perak nitrat dan setelah endapan dicuci dengan air, menjadi larut dalam larutan ammonia encer yang lalu dapat diendapkan kembali dengan penambahan asam nitrit. Garam Sulfat Morfin sulfat larut dalam air. Ketika garam sulfar yang telah dicampur air direaksikan dengan larutan barium klorida terbentuk endapan putih yang tidak larut dalam HCl. Garam Tartrat Heroin tartrat tidak larut dalam metilen klorida atau kloroform tetapi larut dalam metanol. Morfin tartrat larut dalam air sedangkan asam morfin tartrat hanya sedikit larut dalam air. Perak nitrat akan membentuk endapan putih ketika dicampur dengan larutan air bercampur asam tartarik bebas atau garam tartrat. Endapan larut dalam asam nitrit. Merah kongo akan memberikan hasil negatif dengan garam tartrat tetapi membentuk warna biru bila terdapat asam bebas (merah kongo akan memberikan hasil positif juga bila terdapat asam salisilat.) Garam sitrat Heroin sitrat tidak larut dalam metilen klotida atau kloroform tetapi larut dalam metanol. Perak nitrat akan Perak nitrat akan membentuk endapan putih ketika dicampur dengan larutan air bercampur asam sitrat bebas atau garam sitrat. Endapan larut dalam asam nitrit. Asetik anhidrida dapat digunakan untuk pemeriksaan sitrat dan asam sitrat bebas. Pemeriksaan melibatkan penambahan 0,5 mL asetik anhidrida pada sedikit sampel dalam tabung tes dan memanaskan tabung pada 80O C selama 10 menit. Warna ungu akan terjadi bila terdapat garam sitrat dan asam sitrat bebas bersama amin tertier, misalnya heroin.

4. Analysis Melting Point/titik lebur

Analisis ini digunakan untuk raw material dalam bentuk serbuk, tablet maupun kristal yang telah dihomogenisasikan terlebih dahulu. Tes ini dapat membantu mengarahkan jenis sampel tersebut. Berikut merupakan data hasil melting poin beberapa senyawa yang tergolong narkotika dan psikotropika.

82

Tabel IV.6

Titik Lebur (Melting Point) Senyawa Yang Tergolong Narkotika Dan Psikotropika

No Nama Senyawa Rumus molekul Jenis Melting Point

(OC) Narkotika 1. Heroin C21H23NO5 Basa 170 Hidroklorida 229-233

2. Morfin C17H19NO3 Basa 254 Hidroklorida 200 Sulfat 250

3. Codein C18H21NO3 Basa 154-158 Hidroklorida 280 Sulfat 278

4. Cocain C17H21NO4 Hidroklorida 195 Psikotropika 1. Amfetamin C9H13N Basa 203-204 (d),

200-203 (d,l) Sulfat Sulfat 300 (d), 280-

281 (d,l) Fosfat 300 (d), 300

(d,l) 2. Metamfetamin C10H15N Basa 208-210 (d),

210 (l), 209-210 (d,l)

Hidroklorida 170-175 (d), 170-171 (l), 131-135 (d,l)

3. MDMA (3,4-metilendioksi metamfetamin)

C11H15NO2 Hidroklorida 147-148

4. MDA (3,4-metilendioksi amfetamin)

C10H13NO2 Hidroklorida 183-185

5. MMDA (3-metoksi-4,5-metilendioksi amfetamin

Hidroklorida 190-191

6. Diazepam C16H13C1N2O Basa 131-135 7. Alprazolam C17H13C1N4 Basa 228-228,5 8. Bromazepam C14H109BrN3O Basa 237-238,5 9. Flunitrazepam C16H12FN3O3 Basa 166-167 10. Flurazepam C21H23C1FN3O Basa 77-82

Dihidroklorida 212 11. Nimetazepam C16H13N3O3 Basa 156,5-157,5 12 Nitrazepam C15H11N3O3 Basa 224-226 13. Oksazepam C15H11C1N2O2 Basa 204-206 14. Allobarbital C10H12N2O3 Basa 171-173 15. Pentobarbital C11H18N2O3 Basa 127-133 16. Fenobarbital C12H12N2O3 Basa 174-178 17. Sekobarbital C12H18N2O3 Basa 100

83

*sumber: Recommended Methods for Testing Manual for Use By National Narcotics Laboratories, United Nations 1989

5. Pemeriksaan fraksi-fraksi dengan metode pemeriksaan KLT

a. Prinsip

Residu hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu sehingga terbentuk noda (spot) dengan warna khas yang akan dibandingkan Rfnya berdasarkan perbandingan Rf spesimen terhadap Rf Standar.

b. Peralatan

1) Alat KLT a) Plat KLT (20 x 20 cm, 10 x 10 cm, 10 x 5 cm) b) Bejana Kromatografi c) Pipa Kapiler, pipet mikro d) Botol semprot sprayer

2) Oven 3) Lampu UV 4) pH meter 5) Sentrifus

c. Reagen

1) Eluen : dipilih salah satu dari berbagai campuran sistem eluen. 2) Larutan penampak noda : dipilih sesuai dengan hasil ekstrak dari

spesimennya. Hasil ekstrak basa (spesimen darah/serum plasma) menggunakan salah satu reagen di bawah ini : a) Mandelin’s Reagen

Larutan 0,59 g amonium vanadat dalam 1,5 mL akuades dan encerkan sampai 100 mL dengan H2SO4. Saring larutan dengan glass wool

b) Larutan asam iodoplatinat Larutkan 0,25 g reagen platina klorida dan 5 g kalium iodida dalam 100 mL akuades, tambahkan 2 mL asam klorida. Campur baik-baik.

Hasil ekstrak asam dan netral (spesimen urin/cairan lambung) menggunakan salah satu reagen di bawah ini: a) Merkuro nitrat

Ke dalam larutan merkuro nitrat tambah natrium bikarbonat sampai busa berhenti dan endapan berwarna kuning. Endapan akan berubah warna menjadi warna biscuitvii). Reagen disiapkan harus dalam keadaan segar, kocok sebelum digunakan dan simpan tidak boleh lebih dari 1 jam.

b) Merkuri klorida-diphenilkarbason 3) Larutan standar : pilih sesuai dengan obat yang akan dideteksi.

84

d. Cara kerja

1) Ekstrak basa a) Ekstrak dari fraksi B, C, D larutkan masing-masing pada 100 µL

CHCl3. Buat larutan standar dari zat yang diduga. Kemudian ambil 10 µL larutan standar dan 25 µL larutan spesimen, totolkan dengan jarak 2 cm pada plat dengan menggunakan pipet kapiler (dalam satu plat dapat ditotolkan beberapa spesimen dan beberapa standar).

b) Plat setelah ditotolkan elusi dalam bejana menggunakan elusi sistem A, B atau C. - Sistem A : - Metanol

- Amonia pekat 100 1,5

- Sistem B : - Sikloheksan - Toluen - Dietilamin

75 15 10

- Sistem C : - kloroform - Metanol

90 10

c) Keluarkan plat dari bejana elusi, kemudian plat dikeringkan sebelum disemprot dengan larutan penampak noda

d) Plat dapat dikeringkan pada suhu kamar atau pada oven dengan suhu 120° C selama 10 menit atau menggunakan udara panas dari blower.

e) Plat disemprot dengan penampak noda yang sesuai dengan table IV.7

f) Plat dikeringkan pada udara terbuka 2) Ekstrak asam dan netral

a) Ekstrak dari fraksi A, B, C larutkan masing-masing pada 100 µL CHCl3. Buat larutan standar dari zat yang diduga. Kemudian ambil 10 µL larutan standar dan 25 µL larutan spesimen, totolkan dengan jarak 2 cm pada plat dengan menggunakan pipet kapiler (dalam satu plat dapat ditotolkan beberapa spesimen dan beberapa standar)

b) Plate setelah ditotolkan dielusi dalam bejana elusi menggunakan elusi sistem D, E atau F. - Sistem D : - Chloroform

- Aseton 4 1

- Sistem E : - Etil Asetat - Metanol - Amonia pekat

85 10 5

- Sistem F : Etil Asetat c) Keluarkan plat dari bejana elusi, kemudian plat keringkan

semprot dengan larutan penampak noda. d) Plat dapat dikeringkan pada suhu kamar/atau pada oven

dengan suhu 120° C selama 10 menit atau menggunakan udara panas dari blower

85

e) Plat disemprot dengan penampak noda yang sesuai dengan Tabel IV.8 .

f) Plat dikeringkan pada udara terbuka

Tabel IV.7 Data Hasil KLT Untuk Hasil Ekstrak Dalam Suasana Basa

Nilai Rf dengan

eluen Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa

A B C Larutan Iodaplatinates

Reagen Mandelin

Visible UV (350 nm)

Marprotiline 15 17 05 hijau Protriptyline 19 17 07 Violet Pink Desipramine 26 20 11 Violet Biru Dihydrocodoine 26 08 13 Biru putih Codeine 33 06 18 Biru

Nilai Rf dengan eluen Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa A B C Larutan

Iodaplatinates

Reagen Mandelin

Visible UV (350 nm)

Ortyptyline 34 27 16 Violet violet Kuning (tengah berwarna violet)

Morphine 37 00 09 Biru - - Promazine 44 41 30 Hijau - - Chlorpheniramine 45 33 18 Violet - - Imipramine 48 49 23 Violet biru kekuning-

kuningan Methadone 48 61 20 pink (dikelilingi

warna abu-abu

Procyclidine 48 63 31 Violet Thioridazine 48 43 30 Coklat (dikelilingi

warna biru) biru (dikelilingi warna violet)

quenches biru (redup)

Chlorpromazine 49 49 35 violet (dikelilingi warna biru)

pink

Promethazine 50 37 35 violet (dikelilingi warna biru)

pink

Quinine 50 02 11 Violet biru (kuat) Amitryptiline 51 55 32 Violet violet kuning (ditengah

berwarna violet) Clomipramine 51 54 34 Violet biru quenches Dothiepin 51 50 42 merah (dikelilingi

warna biru) putih biru (redup)

Doxepin 51 52 37 Violet abu-abu (dikelilingi warna orange)

biru

Pethidine 52 37 34 Violet Dibenzepin 54 20 35 Violet biru quenches Nicotine 54 39 35 Coklat

86

Opipramol 54 06 22 Biru kuning Hijau Diphenhydramine 55 45 33 Violet Orphenadrine 55 48 33 Violet kuning biru Chlorprothixene 56 51 51 Violet pink orange Cycclizine 57 49 41 violet (dikelilingi

warna biru)

Mianserin 58 39 58 Biru violet quenches Butriptyline 59 61 48 Pink abu-abu hijau Trimipramine 59 62 54 Violet biru quenches Carbamazepine 60 04 56 kuning

(dikelilingi warna biru)

hijau (teang)

Pentazocine 61 15 12 Violet abu-abu putih Dextropropoxyphene

68 59 55 Violet abu-abu

Lignozaine* 70 35 73 Biru Buclizine 75 61 93 Merah

* Lignocaine digunakan sebagai anastesi local pada kateter, spesimen urin bias terkontaminasi.

Tabel IV.8 Data Hasil KLT Untuk Hasil Ekstrak Dalam Suasana Asam dan Netral

Nilai Rf dengan eluen Sistem

Larutan Penampak Noda Senyawa

D E F Merkuri klorid

diphenil carbazone

Merkuri nitrat spray

Primadone 08 39 26 + + Meprobamate* 09 60 34 - - Parasetamol 15 45 34 Phenytoin 33 36 53 + + Salicylamide 38 46 55 Barbitone 41 31 61 + + Phenobarbitone 47 28 65 + + Cyclobarbitone 50 35 64 + + Butobarbiton 50 38 65 + + Heptabarbitone 50 30 65 + + Amylobarbitone 52 36 65 + + Pentabarbitone 55 45 66 + + Quinalbarbitone 56 44 68 + + Glutethimide+ 63 78 62 + + Methaqualone++ 63 - - - - Phenylbutazone 78 66 68

87

6) Pembacaan hasil

• Bandingkan warna, bentuk noda (spot) dan nilai Rf hasil ekstrak dengan Standar.

• Apabila dengan pemeriksaan fraksi metode KLT tersebut diatas, ternyata belum dapat dipastikan adanya jenis obat yang dicurigai maka dilanjutkan dengan pemeriksaan konfirmasi.

88

C. Pemeriksaan Konfirmasi

Pemeriksaan konfirmasi adalah suatu pemeriksaan lanjutan yang lebih akurat karena hasil yang dikeluarkan sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika psikotropika yang terkandung di dalam sampel tersebut. Pemeriksaan dilakukan apabila hasil pemeriksaan pendahuluan (screening test) memberi hasil positif.

Batas Deteksi Pemeriksaan Konfirmasi

Jenis / golongan zat Jenis zat Batas deteksi (ng/mL) Kanabis Delta-9- Asam THC 15 Kokain Benzoylecgonine 150 Opiat Kodein 300 Morfin 300 6-MAM (Heroin) 10 Dihydrokodein 300 Metadon Metadon 250 EDDP 250 Amfetamin Amfetamin 500 Metil Amfetamin 500 MDA,MDMA,MDEA 200 Benzodiazepin Oxazepam 100 7-Amino Nitrazepam 100 Temazepam 100 Nordiazepam 100 Methaqualone Methaqualone 300 Propoksifen Propoksifen 300 Nor propoksifen 300 Barbiturat Barbiturat 150 Fensiklidin Fensiklidin 25

Menurut UK Laboratory Guidelines for Legally Defensible Workplace Drug Testing dan SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration) dari Amerika Serikat.

89

1. Pemeriksaan ganja dalam cuplikan

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 1) Prinsip

Sampel diekstraksi dengan metanol, elusi menggunakan eluen tertentu, sehingga terbentuk noda dengan Rf tertentu. Noda discanning dengan spektrodensitometer, sehingga terbentuk spektrum serapan sinar ultraviolet sebelum akhirnya noda pada pelat disemprot menggunakan penyemprot tertentu. Rf spektrum serapan sinar ultraviolet dan warna noda hasil penyemprotan dari sampel dibandingkan terhadap baku pembanding.

2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : - Pipet kapiler - Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm

dengan ketebalan 0,25 mm - Tabung elusi (developing tank) - Lampu UV λ 254 nm

b) Spektrofotodensitometer

3) Reagen a) Pelarut organik : toluen, petroleum eter, dietil eter, sikloheksan,

diisopropil eter, dietilamin. b) Larutan Sampel

Tanaman ganja (Cannabis plant, Cannabis herba) ± 400 mg cuplikan yang telah diserbuk haluskan, masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, tambah 10 mLpetroleum eter atau toluen, dan kocok selama 1 jam, kemudian saring. Bila perlu tambahkan lagi pelarut hingga diperoleh volume 10 mL (A1) Damar ganja (Cannabis resin) ± 100 mg damar ganja dalam mortir, gerus dengan ± 2 mL toluen sampai terbentuk pasta. Dengan bantuan 8 mL toluen masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, kocok selama 1 jam dan saring (A2). Hasis (Hasis oil, Cannabis oil) ± 50 mg hasis larutkan dalam 10 mL toluen (A3).

c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - ∆9 tetrahidrokanabinol 0,5 mg/mL (B1) - Kanabinol 0,5 mg/mL (B2) - Kanabidiol 0,5 mg/mL (B3)

90

Alternatif lain : buat ekstrak dari tanaman ganja pembanding, damar ganja pembanding atau hasis pembanding yang disiapkan seperti larutan sampel.

d) Penampak noda Fast Blue B Penampak noda Fast Blue B 50 mg garam Fast Blue B kocok dalam 1 mL air, tambah 20 mL metanol, kocok kembali sehingga semua garam larut.

4) Cara Kerja

Larutan A, B1, B2 dan B3 masing-masing ditotolkan pada pelat secara terpisah dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Toluen

2. Petroleum eter – dietil eter (80 : 20) 3. Sikloheksan–diisopropileter–dietilamin (52 : 40 : 8)

Volume penotolan : 1. Larutan A dilakukan 2 kali penotolan masing-masing 20 µl dan 50 µL

2. Larutan B1, B2 dan B3 masing-masing 10 µL 3. Apabila digunakan tanaman ganja pembanding, damar ganja pembanding atau hasis pembanding, masing-masing totokan 20 µL

Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda

berwarna ungu 2. Larutan garam Fast Blue B, noda

berwarna ungu kemerahan Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung ganja bila larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan harga Rf dan warna noda larutan B1, B2 dan atau B3. Catatan : Gunakan salah satu fasa gerak yang tercantum dalam metode, fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi.

b. Kromatografi Gas (KG) 1) Prinsip

Pemisahan sampel dari zat lain menggunakan kromatografi gas, kemudian deteksi dengan detektor menghasilkan spektrum dengan

91

waktu retensi tertentu yang dapat dibandingkan dengan waktu retensi baku pembanding

2) Alat Kromatografi gas

3) Reagen

a) Pelarut toluen b) Larutan sampel

Tanaman ganja (Cannabis plant, Cannabis herba) ± 400 mg cuplikan yang telah diserbukhaluskan, masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, tambah 10 mL petroleum eter atau toluen, dan kocok selama 1 jam, kemudian saring. Bila perlu tambahkan lagi pelarut hingga diperoleh volume 10 mL (A1) Damar ganja (Cannabis resin) ± 100 mg damar ganja dalam mortir, gerus dengan ± 2 mL toluen sampai terbentuk pasta. Dengan bantuan 8 mL toluen masukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup, kocok selama 1 jam dan saring (A2). Hasis (Hasis oil, Cannabis oil) ± 50 mg hasis larutkan dalam 10 mL toluen (A3)

c) Larutan baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - ∧9 tetrahidrokanabinol 0,5 mg/mL (B1) - Kanabinol 0,5 mg/mL (B2) - Kanabidiol 0,5 mg/mL (B3) Alternatif lain : buat ekstrak dari tanaman ganja pembanding, damar ganja pembanding atau hasis pembanding yang disiapkan seperti larutan sample

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A1, A2, A3, B1, B2 dan B3 secara terpisah ke dalam kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : Kaca, panjang 2 m, diameter dalam 2 mm, isi kolom 3 % OV-17 atau yang sesuai, ukuran isi kolom 80/100, kolom penyangga kromosorb.

Detektor : Ionisasi nyala (FID) Suhu : Detektor 2800 C, injektor 2800 C, kolom

2400 C Gas pembawa : Nitrogen Laju aliran fase gerak : 40 - 60 mL/menit Volume penyuntikkan : Larutan A, B1, B2 atau B3 masing-masing

92

1- 3 µL Interpretasi hasil Cuplikan mengandung ganja jika pada larutan A terdapat spektrum dengan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku (B1, B2 atau B3). Jika larutan A dicampur dengan larutan B1 atau B2 atau B3 dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

2. Pemeriksaan Heroin dalam cuplikan

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

1) Prinsip :


2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254

nm dengan ketebalan 0,25 mm (3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm


3) Reagen a) Pelarut organik : metanol, amoniak, benzen, dioksan, asam

asetat. b) Larutan Sampel

Satu dosis sampel (± 50 mg cuplikan) larutkan dalam 10 mL metanol, bila perlu saring (A)

c) Larutan Baku Buat larutan baku pembanding heroin dalam metanol dengan konsentrasi 1 mg/mL (B)

d) Penampak noda iodoplatinat asam 0,25 g platina klorida dan 5 g kalium iodida larutkan dalam 100 mL air, kemudian tambah 5 mL asam klorida.

e) Penampak noda Dragendorff

93

(1) 2 g bismuth subnitrat campur dengan 25 mL asam asetat dan 100 mL air.

(2) 40 g kalium iodida larutkan dalam 100 mL air. 10 mL larutan (1) dan 10 mL larutan (2) campur dengan 20 mL asam asetat glasial dan 100 mL air.

4) Cara Kerja

Larutan A dan B masing-masing ditotolkan secara terpisah pada pelat dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Metanol : amoniak (100 : 1,5)

2. Amoniak – benzen – dioksan (50 : 40 : 5) 3. Asam asetat – metanol – air (30 : 60 : 10)

Volume penotolan : Larutan A dan B masing-masing 20 µL Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda berwarna

ungu 2. Larutan iodoplatinat asam, noda

berwarna ungu 3. Larutan Dragendorff, noda berwarna

jingga. Konfirmasi : Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, lakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung heroin bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku heroin (B). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel sesuai dengan

spektrum serapan ultraviolet noda baku heroin serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Catatan : - Gunakan salah satu fasa gerak yang tercantum dalam metode,

fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi. - Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet λ 254 nm

dan salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh.

94


Pemisahan sampel dari zat lain menggunakan kromatografi gas, kemudian deteksi dengan detektor menghasilkan spektrum dengan waktu retensi tertentu yang dapat dibandingkan dengan waktu retensi baku pembanding

2) Alat

Kromatografi gas

3) Reagen a) Metanol b) Larutan sampel


c) Larutan Baku Larutan Baku Baku pembanding heroin larutkan dalam metanol hingga diperoleh kadar 1 mg/mL (B)

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A dan B secara terpisah ke dalam kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut : Kolom : Kaca, panjang 2 m, diameter dalam

2 mm, isi kolom 5 % OV-1 atau yang sesuai, ukuran isi kolom 80/100, kolom penyangga kromosorb.


2100 C Gas pembawa : Nitrogen Laju aliran fase gerak : 40 - 60 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A dan B masing-masing 1 µL

Interpretasi hasil Cuplikan mengandung heroin bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku heroinin (B). Jika larutan A dan B dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

95

c. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT))

1) Prinsip

Pemisahan sampel dari zat lain menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi, kemudian dideteksi dengan detektor menghasilkan spektrum dengan waktu retensi tertentu yang dapat dibandingkan dengan waktu retensi baku pembanding.

2) Alat

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

3) Reagen a) Metanol b) Ammonium asetat 0,045 M c) Larutan sampel


d) Larutan Baku Larutan Baku Baku pembanding heroin larutkan dalam metanol hingga diperoleh kadar 1 mg/mL (B)

4) Cara Kerja

Suntikkan masing-masing larutan A dan B secara terpisah ke dalam HPLC dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : C-18 Fasa gerak : Asetonitril – air – trietilamin

(60 : 40 : 0,1) Detektor : Ultra violet λ 254 nm Laju aliran fase gerak : 1,0 mL/menit Volume penyuntikkan : Larutan A dan B masing-masing 20 µL Interpretasi Hasil Cuplikan mengandung heroin bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku heroin (B). Jika larutan A dan B dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama

96

3. Pemeriksaan Kokain dalam cuplikan

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 1) Prinsip


2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254

nm dengan ketebalan 0,25 mm (3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm


3) Reagen a) Pelarut organik : metanol, kloroform, aseton, sikoloheksan,

toluen, dietiamin. b) Larutan Sampel

Satu dosis sampel (atau lebih kurang 50 mg cuplikan) larutkan dalam 10 mL metanol, bila perlu saring (A)

c) Larutan Baku Buat larutan baku pembanding kokain hidroklorida dalam metanol dengan konsentrasi 1 mg/mL (B).

d) Penampak noda iodoplatinat asam 0,25 g platina klorida dan 5 g kalium iodida larutkan dalam 100 mL air, kemudian tambah 5 mL asam klorida.

e) Penampak noda Dragendorff (1) 2 g bismuth subnitrat campur dengan 25 mL asam asetat

dan 100 mL air. (2) 40 g kalium iodida larutkan dalam 100 mL air. 10 mL larutan (1) dan 10 mL larutan (2) campur dengan 20 mL asam asetat glasial dan 100 mL air.

4) Cara Kerja

Larutan A dan B masing-masing ditotolkan pada pelat secara terpisah dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

97

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Metanol - amoniak (100 : 1,5)

2. Etil asetat - metanol – amoniak (85 : 10 : 5) 3. Kloroform - metanol (9 : 1)

Volume penotolan : Larutan A dan B masing-masing 20 uL. Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda

berwarna ungu. 2. Larutan iodoplatinat asam, noda

berwarna ungu 3. Larutan Dragendorff, noda berwarna

jingga. Konfirmasi : Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung kokain bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku kokain (B1). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel sesuai dengan

spektrum serapan ultraviolet noda baku kokain serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.


fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi. - Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet λ 254 nm dan

salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh. Kokain Hidroklorida dalam cuplikan

b. Kromatografi Gas

1) Prinsip


2) Alat

Kromatografi gas

98



c) Larutan Baku Baku pembanding kokain larutkan dalam metanol hingga diperoleh kadar ± 1 mg/mL (B)

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A dan B secara terpisah ke dalam kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : Kaca, panjang 2 m, diameter dalam 2 mm, isi kolom 5 % OV-1 atau yang sesuai, ukuran isi kolom 80/100, kolom penyangga kromosorb.


2100 C Gas pembawa : Nitrogen Laju aliran fase gerak : 40 - 60 mL/menit Volume penyuntikkan : Larutan A dan B masing-masing 1 µL Interpretasi hasil Cuplikan mengandung kokain bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku kokain (B). Jika larutan A dan B dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama

c. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1) Prinsip


2) Alat

Kromatografi cair kinerja tinggi

3) Reagen a) Metanol b) Ammonium Asetat 0,045 M c) Larutan sampel


99

d) Larutan Baku Larutan Baku Baku pembanding kokain larutkan dalam metanol hingga diperoleh kadar ± 1 mg/mL (B)

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A dan B secara terpisah ke dalam kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut : Kolom : C-18 Fasa gerak : Ammonium Asetat 0,045 M –

metanol - asetonitril (80 : 10 : 10) Detektor : Ultra violet λ 254 nm Laju aliran fase gerak : 1,0 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A dan B masing-masing 20 µL

Interpretasi Hasil Cuplikan mengandung kokain bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku kokain (B). Jika larutan A dan B dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama

100

4. Amfetamin, Metamfetamin dan MDMA dalam cuplikan


1) Prinsip Sampel diekstraksi dengan metanol, elusi menggunakan eluen tertentu, sehingga terbentuk noda dengan Rf tertentu. Noda discanning dengan spektrodensitometer, sehingga terbentuk spektrum serapan sinar ultraviolet sebelum akhirnya noda pada pelat disemprot menggunakan penyemprot tertentu. Rf spektrum serapan sinar ultraviolet dan warna noda hasil penyemprotan dari sampel dibandingkan terhadap baku pembanding

2) Alat a) . Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari

- Pipet kapiler - Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm

dengan ketebalan 0,25 mm - Tabung elusi (developing tank) - Lampu UV λ 254 nm


3) Reagen a) Pelarut organik : metanol, etil asetat, amoniak b) Penampak noda ninhidrin

0,5 g ninhidrin ditambahkan pada 10 mL asam klorida dan diencerkan hingga 100 mL dengan aseton0,5 g ninhidrin ditambahkan pada 10 mL asam klorida dan diencerkan hingga 100 mL dengan aseton

c) Penampak noda Fast Black K - Larutan Fast Black K

1 g garam Fast Black K larutkan dalam 100 mL - Larutan Natrium hidroksida 1 N

4 g NaOH larutkan dalam 100 mL air d) Larutan sampel Larutan sampel

Satu dosis sampel (atau 50 mg cuplikan) larutkan dalam 10 mL metanol, bila perlu saring (A).

e) Larutan baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Amfetamin 5 mg/mL (B1) - Metamfetamin 5 mg/mL (B2) - 3,4-Metilendioksimetamfetamin (MDMA) 5 mg/mL (B3)

101

4) Cara Kerja Larutan A, B1, B2 dan B3 masing-masing ditotolkan pada pelat secara terpisah dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Metanol - amoniak (100 : 1,5)

2. Etil asetat - metanol - amoniak (85 :10 : 5)

Volume penotolan : Larutan A dan B masing-masing 20 µL. Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda

berwarna ungu, 2. Penampak noda ninhidrin

- Angkat lempeng, diamkan sampai kering

- Semprot dengan larutan penampak noda

- Panaskan lempeng pada suhu 1200 C selama 15 menit

Noda berwarna ungu 3. Penampak noda Fast Black K

- Angkat lempeng, diamkan sampai kering

- Semprot dengan larutan Fast Black K - Semprot dengan larutan Natrium

hidroksida 1 N - Semprot dengan larutan Fast Black K

Noda berwarna ungu (amfetamin, metamfetamin) Noda berwarna jingga (MDMA)

Konfirmasi : Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung amfetamin bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku amfetamin (B1). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku amfetamin serta

102

panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung metamfetamin bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku metamfetamin (B2). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku metamfetamin serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung MDMA bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku MDMA (B3). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku MDMA serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Catatan : 1) Gunakan salah satu fasa gerak yang tercantum dalam metode,

fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi. 2) Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet λ 254 nm

dan salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh

b. Kromatografi Gas

1) Prinsip


2) Alat

Kromatografi gas



c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Amfetamin 1 mg/mL (B1) - Metamfetamin 1 mg/mL (B2) - MDMA 1 mg/mL (B3)

103

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A, B1, B2 dan B3 secara terpisah ke dalam kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : Kaca, panjang 2 m, diameter dalam 2 mm, isi kolom 5 % OV-1, ukuran isi kolom 80-100, kolom penyangga kromosorb.


1800 C Gas pembawa : Nitrogen Laju aliran fase gerak : 40-60 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A, B1, B2 dan B3 masing-masing 2 µL

Interpretasi Hasil : - Cuplikan mengandung amfetamin bila larutan A memberikan

waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku amfetamin (B1). Jika larutan A dan B1 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung metamfetamin bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutam baku metamfetamin (B2). Jika larutan A dan B2 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung MDMA bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutam baku MDMA (B3). Jika larutan A dan B3 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

104


1) Prinsip Pemisahan sampel dari zat lain menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi, kemudian dideteksi dengan detektor menghasilkan spektrum dengan waktu retensi tertentu yang dapat dibandingkan dengan waktu retensi baku pembanding.

2) Alat


3) Reagen a) Pelarut metanol b) Larutan Sampel


c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Amfetamin 1 mg/mL (B1) - Metamfetamin 1 mg/mL (B2) - MDMA 1 mg/mL (B3)

4) Cara Kerja

Suntikkan masing-masing larutan A, B1, B2 dan B3 secara terpisah ke dalam kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : C-18 Fasa gerak : Asetonitril - amonium asetat 1 % -

dietilamin 2,5 % (40 : 45 : 15) Detektor : Ultra violet λ 254 nm Laju aliran fase gerak : 1,0 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A, B1, B2 dan B3 masing-masing 20 µL

Interpretasi Hasil - Cuplikan mengandung amfetamin bila larutan A memberikan

waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku amfetamin (B1). Jika larutan A dan B1 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung metamfetamin bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutam baku metamfetamin (B2). Jika larutan A dan B2 dicampur dan

105

diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung MDMA bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutam baku MDMA (B3). Jika larutan A dan B3 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

5. Barbital dan Fenobarbital dalam cuplikan


1) Prinsip


2) Alat a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari :

(1) Pipet kapiler a. Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254

nm dengan ketebalan 0,25 mm b. Tabung elusi (developing tank)

(4) Lampu UV λ 254 nm b) Spektrofotodensitometer

3) Reagen a) Pelarut organik : metanol, etil asetat, amoniak, kloroform, aseton,

isopropanol, uap amoniak. b) Larutan Sampel


c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : (1) Barbital 1 mg/mL (B1) (2) Fenobarbital 1 mg/mL (B2)

106

4) Cara Kerja

Totolkan masing-masing larutan A, B1, dan B2 pada pelat secara terpisah dan lakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Etil asetat - metanol - amoniak

(85 : 10 : 5) 2. Kloroform - aseton (80 : 20) 3. Kloroform - isopropanol - amonium

hidroklorida (50 : 50 : 10) Volume penotolan : Larutan A, B1 dan B2 masing-masing

20 µL. Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda berwarna

ungu, kemudian lempeng diuapi dengan uap amonia dan diamati lagi dibawah Sinar ultraviolet λ 254 nm.

Konfirmasi : Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung barbital bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku barbital (B1). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku barbital serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung fenobarbital bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku fenobarbital (B2). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku fenobarbital serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Catatan : b) Gunakan salah satu fasa gerak yang tercantum dalam metode,

fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi.

107

c) Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet 254 nm dan salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh

b. Kromatografi Gas

1) Prinsip


2) Alat

Kromatografi gas



c) Larutan Baku Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : (1) Barbital 1 mg/mL (B1) (2) Fenobarbital 1 mg/mL (B2)

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A, B1 dan B2 secara terpisah ke dalam kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : Kaca, panjang 2 m, diameter dalam 2 mm, isi kolom 3 % OV-17, ukuran isi kolom 80/100, kolom penyangga kromosorb.


2000 C Gas pembawa : Nitrogen Laju aliran fase gerak : 40-60 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A, B1 dan B2 masing-masing 2 -3 µL

Interpretasi hasil - Cuplikan mengandung barbital bila larutan A memberikan waktu

retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku barbital (B1). Jika larutan A dan B1 dicampur dan diinjeksikan ke sistem

108

kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung fenobarbital bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku fenobarbital (B2). Jika larutan A dan B2 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.


1) Prinsip


2) Alat


3) Reagen a) Pelarut metanol b) Larutan NaH2PO4 0,1 M

11,998 g natrium dihidrogen fosfat larutkan dalam 1 liter air c) Larutan Sampel


d) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Barbital 1 mg/mL (B1) - Fenobarbital 1 mg/mL (B2)

4) Cara Kerja Suntikkan masing-masing larutan A, B1 dan B2 secara terpisah ke dalam kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut :

Kolom : C-18 Fasa gerak : Larutan NaH2PO4 0,1 M - metanol

(60 : 40) Detektor : Ultra violet λ 254 nm Laju aliran fase gerak : 1,0 mL/menit Volume penyuntikkan

: Larutan A, B1 dan B2 masing-masing 20 µL

109

Interpretasi Hasil - Cuplikan mengandung barbital bila larutan A memberikan waktu

retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku barbital (B1). Jika larutan A dan B1 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

- Cuplikan mengandung barbital bila larutan A memberikan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku fenobarbital (B2). Jika larutan A dan B2 dicampur dan diinjeksikan ke sistem kromatografi maka akan terbentuk satu spektrum utama yang sama.

6. Turunan Benzodiazepin dalam Cuplikan


1) Prinsip Sampel diekstraksi dengan metanol, elusi menggunakan eluen tertentu, sehingga terbentuk noda dengan Rf tertentu. Noda discanning dengan spektrodensitometer, sehingga terbentuk spektrum serapan sinar ultraviolet sebelum akhirnya noda pada pelat disemprot menggunakan penyemprot tertentu. Rf spektrum serapan sinar ultraviolet dan warna noda hasil penyemprotan dari sampel dibandingkan terhadap baku pembanding.


(1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm

dengan ketebalan 0,25 mm (3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm


3) Reagen a) Pelarut organik : metanol, kloroform, aseton, sikoloheksan,

toluen, dietiamin. b) Larutan Sampel


c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Diazepam 1 mg/mL (B1) - Flunitrazepam 1 mg/mL (B2)

110

- Nitrazepam 1 mg/mL (B3) - Bromazepam 1 mg/mL (B4)

d) Larutan asam sulfat 2 N 5,5 mL asam sulfat pekat encerkan dengan air hingga 100 mL

e) Penampak noda Dragendorff (0) 2 g bismuth subnitrat campur dengan 25 mL asam asetat


4) Cara Kerja Larutan A, B1, B2, B3 dan B4 masing-masing ditotolkan pada pelat secara terpisah dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Kloroform-metanol (90 : 10)

2. Kloroform-aseton (80 : 20) 3. Sikloheksan-toluen-dietilamin

(75 : 15 : 10) Volume penotolan : Larutan A, B1, B2, B3 dan B4 masing-

masing 20 µl. Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda

berwarna ungu. 2. Larutan asam sulfat 2 N, panaskan

lempeng pada suhu 800 C salama 5 menit, kemudian amati di bawah sinar ultraviolet λ 366 nm, noda berfluoresensi biru.

3. Larutan Dragendorff, noda berwarna jingga.

Konfirmasi : Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil : Cuplikan mengandung diazepam bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku diazepam (B1). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel sesuai dengan

spektrum serapan ultraviolet noda baku diazepam serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

111

Cuplikan mengandung flunitrazepam bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku flunitrazepam (B2). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku flunitrazepam serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung nitrazepam bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku nitrazepam (B3). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku nitrazepam serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung bromazepam bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku bromazepam (B4). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku bromazepam serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Catatan : 1. Gunakan salah satu fasa gerak yang tercantum dalam metode,

fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi. 2. Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet λ 254 nm

dan salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh

7. Narkotika yang digunakan dalam pengobatan


1) Prinsip


2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1) Pipet kapiler

112

(2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm dengan ketebalan 0,25 mm

(3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm

b) Spektrofotodensitometer 3) Reagen

a) Pelarut organik : metanol, amoniak, etil asetat, kloroform, dietiamin, sikloheksan.

b) Larutan Sampel Satu dosis sampel (atau lebih kurang 50 mg cuplikan) larutkan dalam 10 mL metanol, bila perlu saring (A)

c) Larutan Baku Buat masing-masing larutan baku pembanding dalam metanol sebagai berikut : - Morfin 1 mg/mL (B1) - Kodein 1 mg/mL (B2) - Petidin 1 mg/mL (B3)

d) Larutan kalium iodoplatinat asam 0,25 g platina klorida dan 5 g kalium iodida larutkan dalam 100 mL air, kemudian tambah 5 mL asam klorida

f) Penampak noda Dragendorff (1) 2 g bismuth subnitrat campur dengan 25 mL asam asetat


4) Cara Kerja

Larutan A, B1, B2 dan B3 masing-masing ditotolkan pada pelat secara terpisah dan dilakukan kromatografi lapis tipis dengan kondisi sebagai berikut :

Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : 1. Etilasetat : Metanol : Amoniak

(85 : 10 : 5) 2. Kloroform : Metanol (90 : 10) 3. Sikloheksan : Kloroform : Dietilamin

(50 : 40 : 10) 4. Dua dimensi:

a. Etilasetat - Metanol – Amoniak (85 : 10 : 5)

b. Sikloheksan : Kloroform : Dietilamin (50 : 40 : 10)

Volume penotolan : Larutan A, B1, B2, dan B3 masing-masing 20 µL

113

Jarak rambat : 15 cm Penampak noda : 1. Sinar ultraviolet λ 254 nm, noda

berwarna ungu 2. Larutan iodoplatinat asam, noda

berwarna ungu (morfin, kodein), coklat tua (petidin)

3. Larutan Dragendorff, noda berwarna jingga.

Konfirmasi Sebelum pelat disemprot dengan penampak noda, dilakukan pengukuran spektrum serapan ultra violet terhadap noda sampel yang mempunyai harga Rf atau tinggi noda yang sama dengan salah satu noda baku menggunakan alat spektrodensitometer. Interpretasi Hasil Cuplikan mengandung morfin bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku morfin (B1). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel sesuai dengan

spektrum serapan ultraviolet noda baku morfin serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung kodein bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku kodein (B2). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku kodein serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.

Cuplikan mengandung petidin bila : - Larutan A memberi harga Rf dan warna noda yang sama dengan

harga Rf dan warna noda larutan baku petidin (B3). - Profil spektrum serapan ultraviolet noda sampel bersesuaian

dengan spektrum serapan ultraviolet noda baku petidin serta panjang gelombang serapan maksimum noda sampel dan baku berimpit.


fasa gerak yang lain gunakan sebagai konfirmasi. - Sebagai penampak noda gunakan sinar ultra violet λ 254 nm dan

salah satu penyemprot, penyemprot yang lain dapat gunakan untuk mempertegas hasil yang diperoleh.

114

8. Morfin dan derivatnya dalam spesimen manusia a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi yang dielusi dengan eluen tertentu kemudian ditetapkan secara KLT sehingga terbentuk noda yang berwarna khas.


(1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm



3) Reagen a) Lapisan Tipis Silika gel G b) Eluen, pilih salah satu :

A : - Toluen 45 - Aseton 45 - Etanol 7 - Amonia pekat 3B : - Etil Asetat 85 - Metanol 10 - Amonia pekat 5

c) Larutan penampak noda, pilih salah satu : (1) Reagen Dragendorf

Larutan A : Campur 2 g Bismuth subnitrat (bismuth oksinitrat), 25 mL asam asetat glasial atau pekat dan 100 mL akuades.

Larutan B : Larutkan 40 g Kl dalam 100 mL akuades. Campur 10 mL larutan A dan 10 mL larutan B. Tambahkan 20 mL asam asetat glasial dan 100 mL akuades.

(2) Reagen Kalium Iodoplatinat yang diasamkan Larutan 0,25 g Platinat Klorida dan 5 g Kl dalam akuades sampai 100 mL, tambahkan 2 mL HCl pekat.

(3) Reagen Fluoresensi (a) Buffer AMP

Tambahkan 105 mg 2–amino 2–metil 1,3 propandiol ke dalam 18,8 HCl pekat dan encerkan dengan air sampai 1000 mL (pH = 9,3 ± 0,2)

(b) Larutan Kalium Ferri Sianida

115

Larutkan 58 mg Kalium Ferri Sianida dalam 100 mL akuades. Simpan dalam lemari es, siapkan larutan baru setiap 1 minggu.

d) Larutan Standar Morfin, Kodein 1 mg/mL dalam methanol dalam bentuk garam atau basanya.

4) Cara Kerja

a) Hidrolisa

Hidrolisa dapat dilakukan dengan salah satu cara di bawah ini : - Hidrolisa dengan asam

Dalam tabung bertutup volume 50 mL, masukkan 10 mL urin tambahkan 1 mL HCl pekat campur hingga homogen. Buka tutupnya, inkubasi didalam penangas air pada suhu 100° C selama 60 menit. Dinginkan, kemudian dilanjutkan dengan ekstraksi.

- Hidrolisa enzimatik Spesimen urin (5-10 mL) atur pH sampai 7 dengan penambahan asam asetat apabila bereaksi basa. Kemudian tambahkan 0,1 mL buffer asetat (pH 5,5) dan 0,02 mL enzim b glukoronidase (75 unit/mL) per mL urin. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37° C atau selama 1 jam pada suhu 55° C. Suhu tidak boleh lebih dari 55° C untuk mencegah denaturasi enzim. Kemudian dilanjutkan dengan ekstraksi

Hidrolisa asam dan hidrolisa enzimatik merubah MAM menjadi morfin melalui proses deasetilisasi.

b) Ekstraksi

Prinsip ekstraksi Spesimen sebelum diekstraksi dihidrolisa terlebih dahulu, kemudian diekstraksi dengan pelarut organik pada pH 8,5 – 9, hasil ekstraksi disaring dan dikeringkan sehingga didapat residu yang dapat dianalisa secara kualitatif dengan alat KLT dan kuantitatif dengan alat KG.

c) Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis - pH urin diatur pada 8,5 – 9 dengan penambahan ammonia

campur dalam vortex mixer. Ekstraksi dengan salah satu pelarut organik yaitu, kloroform-isopropanol (9:1 v/v), diklorometan-isopropanol (9:1 v/v), etil asetat, yang volumenya 2 kali volume urin. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut organik 2 kali, tiap kali dengan 10 mL.

116

- Biarkan lapisan air memisah sempurna dari lapisan pelarut organik kumpulkan lapisan organik.

- Apabila terjadi emulsi, saring dengan kertas saring silikon untuk menyaring ekstrak. Pecahkan emulsi dengan sonikator.

- Supaya ekstrak dalam keadaan bening/bersih, ekstraksi kembali larutan organik dengan 6 mL HCl 0,5 M.

- Tampung lapisan organik, pH lapisan air diatur pada 8,5-9, kemudian diekstraksi kembali dengan salah satu pelarut di atas.

- Pisahkan lapisan organik, jadikan satu dengan lapisan organik sebelumnya, saring larutan melalui sedikit Na2SO4 kering, cuci saringan dengan 5 mL fase organik.

- Pekatkan larutan sampai 1-2 mL dan uapkan pelarut di bawah gas nitrogen atau dengan penangas air pada suhu tidak lebih dari 55 °C sampai kering. Pemekatan dengan rotary evaporator atau Kuderna Danish Konsentrator. Untuk pemeriksaan dengan Kromatografi gas pemekatan disarankan dengan KD Konsentrator.

- Untuk pemeriksaan KLT atau analisa KG larutkan kembali residu dalam 0,1 mL atau methanol-kloroform (9 : 1), apabila spesimen cepat kering, larutkan kembali dengan methanol atau methanol-kloroform 1-2 mL.

- 5) Pembacaan Hasil

Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.

Rf x 100 (Values) Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa UV Iodoplatinat Dragendorf

Morfin Fluoresensi Biru-Purple Orange dengan latar belakang kuning

117

b. Metode Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga diketahui waktu retensi (R), luas area dan puncak kromatogram yang dihasilkan.

2) Peralatan a) Derivatisasi

(1) Tapered tube (tabung runcing berskala) 10 mL (2) Labu ukur 10 mL

b) Kromatografi Gas

3) Reagen a) Larutan standar kalibrasi

Buat larutan induk morfin, Nalorfin dengan kadar 1 mg/mL dalam methanol. Dari larutan induk tersebut buat larutan standar kalibrasi dalam akuades dengan konsentrasi antara 0-10 mg/mL morfin dan 5 mg/mL Nalorfin. Nalorfin digunakan sebagai standar internal.

b) Derivatisasi (1) BSA (N, O-bistrimetil silil asetamin) (2) MSTFA (N, metil N-trimetilsilil trifluro asetamid) (3) HMDS (Heksan metil disilasan) (4) TMCS (Trimetil Klorosilan) (5) Piridin (6) PFTA (Penta Fluoro Propionat Anhidrat) (7) Etil asetat

c) Kromatografi Gas (1) Gas nitrogen (2) Kolom

4) Cara Kerja

a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi pada Metoda KLT)

Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut : Derivatisasi spesimen ada 2 pilihan (1) Sililasi

(a) Ekstrak urin diuapkan sampai kering dengan uap nitrogen.

118

(b) Residu yang terbentuk diderivatisasi dengan 20 mL N,O-bistrimetil sililasetamid (BSA) dalam vial tertutup dengan pemanasan 85° C selama 15 menit (BSA dapat diganti dengan campuran reagen silisasi dan piridin = 1:1 v/v 0. Campuran tersebut disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Jika dipakai detector NPD, reagen sililasi seperti N-metil-N-trimetilsilil trifluoroasetamid (MSTFA) atau campuran heksa metildisilasan (HMDS), trimetil klorosilan (TMCS) dan piridin. Hasil derivatisasi diuapkan sampai kering dan dilarutkan kembali ke dalam 50 µL toluen

(c) Derivatisasi harus dipersiapkan segera sebelum dianalisa, karena reagen derivatisasi silil tidak stabil, 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi diinjeksi ke dalam injector.

(2) Asilasi (a) Tambahkan 50 mL Penta Fluoropropionik Anhidrat

(PFPA) ke dalam hasil ekstraksi urin, panaskan campuran tersebut selama 30 menit pada 65°C didalam tabung tertutup.

(b) Uapkan kelebihan reagen PFPA dengan uang nitrogen. (c) Larutkan residu dengan 50 µL Etil Asetat. (d) Derivatisasi stabil dalam reagen selama beberapa bulan

dan setelah penguapan reagen, stabil dalam waktu 24 jam, 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi diinjeksikan ke dalam injector.

b) Pemeriksaan Kromatografi Gas Kondisinya sebagai berikut : - Detektor : FID atau NPD - Kolom : Packed column *) 2 m x 2-4 mm ID

- Dimetil silikon (SE 30, OV-1) - Fenil metil silikon, 50 % Fenil (OV-17)

- Suhu : Oven 230° C Injektor 275° C Detektor 275° C

- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 70 mL/mnt *) Capillary Column yang sesuai (Lihat lampiran 5)

5) Pembacaan Hasil Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

119

c. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1). Prinsip : Metabolit senyawa opiat dalam bentuk glukoronida di pecah/ hidrolisis dengan enzim β-glukuronida (H. Pomatia) dengan cara inkubasi 55º C selama 2 jam menjadi senyawa opiat bebas yang kemudian dilanjutkan ditarik dengan cara ekstrkasi padat-cair dengan teknik SPE (solid phase extraction) dan mengubahnya menjadi senyawa yang mudah menguap (diderivatisasi) agar segera menjadi fasa gas pada waktu diinjeksikan ke GC-MS dan untuk menaikkan sesitivitas atau memperbaiki resolusi (KNNAP, 1979).

2). Alat :

a) Tabung Reaksi dengan tutup ulir 15 ml b) Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml c) Inkubator/penangas air d) Vortex/minishaker e) Kolom SPE C18 f) Pipet pasteur

g) Pipet pasteur h) Tabung tutup asah i) Turbo Vap LV j) Gas Nitrogen k) Sentifuse l) Bath incubator m) pH meter n) Vial GC m) GC/MSD

3). Reagen

Semua bahan kimia harus pro-analisa a). Larutan stok Morfin, Kodein, 6-Monoasetilmorfin (6-MAM) masing-masing 1000 ppm dari Cerilliant, larutan Morfin, Kodein, 6-MAM masing-masing 100 ppm dan 10 ppm

b). Larutan standar internal (ISTD) Nalorfin 1000 ppm,100 ppm dan 10 ppm c). Larutan bufer asetat 2 M pH 5

d). Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) e). Larutan KOH 1 M f). Resin C-18 (Sep-Pak) dari Waters g). Larutan bufer asetat 0.1 M h). Metanol i). Aquabides j). Etil asetat

120

k). Larutan penderivat BSTFA-TMCS [bis(trimetilsilil)trifluoro asetamida-trimetilklorosilan (99 :1)]

4). Cara Kerja a) Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 ml blanko akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar campuran dalam urine, dan 2 ml sampel urin b) Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan berturut- turut 100 µl larutan ISTD Nalorfin 10 ppm, 100 µl bufer asetat 2 M pH 5, 25 µl enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) c) Vortex sebentar, lalu inkubasi selama 2 jam pada suhu 55º C. d).

Dinginkan sebentar lalu tambahkan 80 µl KOH 1 M. e) Siapkan kolom resin C18 , cuci dengan 2 ml Metanol dan 2 ml aquabides f) Lewatkan sampel ke dalam kolom dengan menggunakan pipet pasteur. g) Cuci kolom dengan 2 ml aquabides dan 1 ml bufer asetat 0.1 M.

h) Elusi kolom dengan etil asetat (4 x 1 ml) dan tampung cairan dalam tabung reaksi tutup asah.

i) Uapkan sampai kering cairan etil asetat dengan aliran gas nitrogen dalam alat turbo vap pada suhu 35º C. j) Tambahkan 50 µl larutan BSTFA-TMCS (99:1) h) Inkubasi kering dengan alat thermoline pada suhu 60ºC selama 20 menit. i) Masukkan hasil ke dalam vial lalu tutup j) Siap diinjeksikan ke GC-MS

5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa

Metode : Scan Kolom :

Kolom kapiler, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm

Suhu injektor : 280º C Suhu Detektor : 300º C Suhu Oven :

T0 : 140º C, dengan kenaikan 15º C /menit T1 : 260º C, dengan kenaikan 20º C /menit T2 : 310º C, hold time 1 menit

Gas Pembawa : Helium Laju Gas : 1.0 mL/menit, laju konstan Volume Injeksi : 2 µl Waktu Retensi :

6-MAM: 9.30 menit Morfin: 8.98 menit Kodein: 8.67 menit ISTD Nalorfin: 9.63 menit

Run Time : 16 menit

121

Tabel IV.12

Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Untuk 6MAM, Morphine, Codeine Dan ISTD Setelah Diderivatisasi BSTFA-TMCS

Senyawa Ion base peak Ion 2 Ion 3

6-MAM-TMS 399 340 287 Morfin-TMS 429 236 178 Kodein-TMS 371 234 196 Nalorfin-TMS 455 414 -

Penafsiran hasil Kadar opiat dalam tubuh seseorang dan dalam urin ditentukan oleh metabolisme obat, kondisi fisik subyek, asupan cairan dan cara masuknya obat ke dalam tubuh. Biasanya opiat dapat dideteksi dalam urin sampai 3 hari. Karena jalur metabolik yang sama, heroin, opium, kodein dan morfin sendiri dapat merupakan sumber adanya morfin dan M-3-G dalam urin. Sumber lain dapat berasal dari Etil morfin, folkodin, dan nikomorfin. Sehingga keberadaan morfin dalam urin tidak bisa mengindikasikan jenis opiate yang dikonsumsi. Dalam hal analisis tidak dapat mengidentikasi sumber morfin, maka perlu dilakukan analisis komponen induk (parent compound) atau pola metabolit utama yang diekskresikan dalam urin misal MAM dapat mengarahkan pada heroin. Dalam hal kodein, telah disepakati bahwa jika rasio kadar total kodein dibandingkan dengan total morfin kurang dari 0,5 dan kadar total morfin dalam urin lebih besar dari 200 ng/mL, kodein dapat disingkirkan sebagai sumber morfin yang ada dalam urin.

122

9. Kokain dalam spesimen manusia

a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) 1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu, kemudian ditetapkan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sehingga terbentuk noda yang berwarna khas.

2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm



3) Reagen a) Lapisan tipis Silica Gel G b) Eluen, dipilih salah satu :

A : - Metanol 100 mL - Ammonia pekat 1,5 mLB : - Kloroform 50 mL - Metanol 50 mL

c) Larutan Penampak Noda, dipilih salah satu : (1) Reagen Dragendorf

Larutan A : Campur 2 g Bismut subnitrat (Bismut Oksinitrat), 25 ml asam asetat glacial atau pekat 100 mL air. Larutan B : Larutan 40 g Kl dalam 100 mL air. Campur 10 mL larutan A dan 10 mL larutan B + 20 mL asam asetat glacial + 100 mL akuades

(2) Reagen Kalium Iodoplatinat yang diasamkan. Larutan 0,25 g platinat klorida dan 5 g Kl dalam akuades sampai 100 mL tambahkan 2 mL HCl pekat.

(3) Asam sulfat pekat 1 mL ditambahkan perlahan-lahan pada 10 mL larutan ferri klorida (5 % w/v) dan campurkan.

d) Larutan Standar. Larutan standar 1 mg/mL BE (Benzoylecgonin), kokain base dan Ecgonin metil ester dalam methanol.

123

4) Cara Kerja

Ekstraksi

Prinsip Kokain diekstraksi dengan pelarut organik dalam suasana basa pada pH 8-9,5. Spesimen diatur pH sampai 9 (8-9,5) dengan buffer yang tepat. Hasil ekstraksi diuapkan, residu siap untuk pemeriksaan dengan alat KLT dan alat KG. a) Membuat larutan buffer

Buffer borax (pH 9-9,6) 19,07 natrium tetraborat (Na2B4Or10H2O) dalam 1 liter air. Buffer Ammonia (pH 9,5) 10,7 g ammonium klorida dilarutkan dalam 40 mL larutan ammonia 5 M tambahkan akuades sampai 1 L.

b) Spesimen urin sebanyak 20 mL diatur pH-nya sampai 9 (8-9,5) dengan buffer.

c) Dengan pelarut ekstraksi diklorometan - isopropanol (85 : 5 v/v) sebanyak 40 mL atau kloroform isopropanol (50 : 50 v/v) dua kali, tiap kali dengan larutan ekstrasi 20 mL Diamkan lapisan memisah, lapisan air (atas) dan lapisan ekstrak orgnik (bawah). Apabila terjadi emulsi gunakan kertas saring silikon.

d) Tampung ekstarak organik saring melalui kertas saring yang berisi sedikit natrium sulfat kering

e) Saringan cuci dengan pelarut ekstraksi 5 mL, hasil ekstraksi diuapkan sampai kering dengan pompa vakum atau uap nitrogen. Ekstrak siap dipakai untuk penetapan secara Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) dan Kromatografi Gas (KG)

Kromatografi Lapisan Tipis - Ekstrak urin yang sudah dikeringkan dilarutkan dalam 50 µL

methanol. - Totolkan 5-10 µL larutan satdar dan hasil ekstraksi pada plate

dengan jarak 2 cm, kemudian elusi dalam Tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

- Keluarkan plate dari Tabung elusi kemudian keringkan. - Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven

pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

- Plate yang telah kering disemprotkan dengan larutan penampak noda, kemudian diamati dengan lampu UV.

124

Pembacaan Hasil Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.

Rf x 100 Noda yang timbul dengan penampak noda Senyawa UV Iodoplatinat Dragendorff

Kokain Hitam Ungu Orange Benzoylecgonine Hitam Negatif Orange Eme Negatif Biru Orange

Penafsiran hasil pemeriksaan : a) Waktu deteksi

Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai 24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester sampai 48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama sampai 5 hari atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak dapat ditentukan jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak konsumsi terakhir.

b) Perhatian Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin pada konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester dapat terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).

c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan benzoylecgonine 0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam darah 1-20 µg/mL dan benzoylecgonine 1-10 µg/mL. Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang mengandung sodium fluorida dan pH dibuat pH 5 dengan asam asetik (10 %, v/v), setelah itu dapat disimpan di kulkas pada 4º C atau dibekukan untuk beberapa bulan. Sampel rambut dan air liur dari pengguna kokain ditemukan mengandung kokain, untuk kadar dalam rambut belum ada ketentuan sedangkan untuk kadar dalam air liur ditemukan berkorelasi dengan kadar dalam plasma.

125


Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform, methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga dapat diketahui waktu retensi (Rt), luas area dan puncak kromatografi yang dihasilkan.

2) Alat a) Vortex mixer b) Heating block c) Pipet kapiler d) Kromatografi gas

3) Reagen

a) Pentafluoropropionik anhidrida (PFPA) b) Pentafluoro-propanol (PFPOL) c) Etil asetat d) Larutan Standar Kalibrasi

Pembuatan larutan kalibrasi : Buat larutan induk 1 mg/mL dari kokain, BE dan ecgonine metil ester dari internal standar dalam methanol. Siapkan larutan standar urin dari larutan induk yang mengandung kokain 0-5 µg/mL, BE dan ecgonine metil ester 0-25 µg/mL internal standar = 25 µg/mL Larutan standar kalibrasi dilaksanakan cara kerjasama dengan spesimen.

e) Gas Nitrogen 4) Cara Kerja

Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT) Derivatisasi a) Tambahkan 50 µL PFPA dan 25 µL PFPOL ke dalam ekstrak

kering hasil ekstraksi. Kocok di atas vortex mixer dan panaskan diatas heating block pada suhu 90º C selama 15 menit.

b) Biarkan tabung sampai dingin dan uapkan ekstrak spesimen sampai kering pada suhu 48º C dengan aliran gas nitrogen, kemudian larutkan residu dalam 25 µL etil asetat Injeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi ke dalam injektor.

c) Derivat PFPA stabil dalam reagen 1 bulan dan 24 jam setelah reagen diuapkan

d) Kromatografi Gas (KG)

126

Kondisinya sebagai berikut : - Detektor : NPD atau FID - Kolom : Packed coloum*)

- dimetil silikon (SE-30, OV-1) - fenil metil silikon 50 % fenil (OV-17)

- Suhu : Oven Injektor Detektor

: 220º C : 220º C : 300º C

- Gas : Notrogen dengan kecepatan alir 30 mL/menit Hidrogen dengan kecepatan alir 30 mL/menit

*) Cappilary Column yang sesuai (lihat lampiran 5)

Pembacaan Hasil Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

c. Metoda Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

Hasil derivatisasi untuk pemeriksaan secara kromatografi gas dapat dilanjutkan dengan menginjeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi ke dalam injektor Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM).

Penafsiran hasil pemeriksaan : a) Waktu deteksi

Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai 24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester sampai 48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama sampai 5 hari atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak dapat ditentukan jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak konsumsi terakhir.

b) Perhatian Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin pada konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester dapat terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).

c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan benzoylecgonine 0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam darah 1-20 µg/mL dan benzoylecgonine 1-10 µg/mL. Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang mengandung sodium fluorida dan pH dibuat

127

pH 5 dengan asam asetik (10 %, v/v), setelah itu dapat disimpan di kulkas pada 4º C atau dibekukan untuk beberapa bulan. Sampel rambut dan air liur dari pengguna kokain ditemukan mengandung kokain, untuk kadar dalam rambut belum ada ketentuan sedangkan untuk kadar dalam air liur ditemukan berkorelasi dengan kadar dalam plasma.

10. Kanabis dalam spesimen manusia a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip Residu hasil hidrolisa yang dilanjutkan dengan ekstraksi yang dielusi dengan pelarut tertentu akan membentuk noda yang berwarna khas.

2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1)Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm


b) Spektrofotodensitometer 3) Reagen

a) Lapisan tipis silica gel G b) Eluen, dipilih salah satu :

A : - Etil asetat 12 - Metanol 5 - Amonia pekat 1 - Akuades 0,5B : - Kloroform 70 - Metanol 30 - Amonia pekat 2

c) Larutan penampak noda harus dibuat baru 0,1% larutan Fast Blue B Salt dalam air, apabila dalam air tidak timbul warna dapat ditambahkan NaOH encer.

d) Larutan standar Larutan 9-carboxy-THC 1 mg/mL dalam methanol

e) Gas Nitrogen

128

4) Cara Kerja Persiapan spesimen (1) Hidrolisa

Hidrolisa alkali. Pipet 10 mL urin ke dalam tabung gelas bertutup, untuk pemeriksaan dengan KG ditambah standar internal. Tambahkan 2 mL kalium hidroksida 10 N, tutup tabung dan inkubasi pada 50º C selama 20 menit dengan sekali-kali diaduk. Lanjutkan dengan ekstraksi.

(2) Ekstraksi Prinsip 9 karboxy THC dari urin yang telah dihidrolisa diekstraksi dalam suasana asam. Hasil ekstraksi diuapkan pada suhu 35º-40º C. Residu siap untuk pemeriksaan dengan KLT dan KG. Cara ekstraksi ada 2 : (1). Gair–cair

- Spesimen hasil hidrolisa setelah didinginkan, pindahkan ke dalam corong pisah, pH diatur sampai 2 HCl 2 N atau H2SO4 2 N

- Tambahkan 15 mL Sikloheksan-etil asetat (7 : 1, v/v) - Ekstraksi dengan mengocok selama 10 menit - Pindahkan lapisan organik, saring melalui natrium sulfat

kering ke dalam tapered tube, cuci saringan dengan 5 mL pelarut (sikloheksan-etil asetat)

- Uapkan sampai kering pada temperatur kamar dengan aliran udara atau gas nitrogen, larutkan kembali residu dalam 0,2 mL methanol atau asetonitril-methanol (3:1, v/v) dengan pengocokan atau sonikator.

(2) Solid-phase (SPE) (a) Kolom SPE yang sesuai dicuci dengan mengalirkan

pelan-pelan masing-masing 3 mL methanol, akuades, methanol dan air.

(b) Plastic syring body 10 mL dipasangkan pada kolong digunakan sebagai reservoir Gunakan vakum dengan kecepatan rendah untuk menaikkan kecepatan aliran. Urin yang sudah dihidrolisa (2 mL) masukkan ke dalam kolom, cuci dengan 10 mL HCl 0,1 N dan 25 mL larutan asam fosfat 0,5 M dalam asetonitril 10 %.

(c) Elusi 9-carboxy-THC dengan 1 mL aseton (d) Uapkan larutan dibawah aliran gas nitrogen, larutkan

kembali dengan 0,1 mL methanol.

(3) Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

129

(a) Totolkan 5-10 µL larutan standar dan hasil ekstraksi pada plate dengan jarak 2 em, kemudian elusi dalam Tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

(b) Keluarkan plate dari Tabung elusi, kemudian plate dikeringkan sebelum disemprotkan dengan penampak noda.

(c) Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

(d) Plate yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda kemudian amati dibawah lampu UV.

Pembacaan Hasil Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.

Rf x 100

b. Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga dapat diketahui waktu retensi (Rt) luas area dan puncak kromatografi yang dihasilkan.

2) Alat

(1) Derivatisasi - Tabung runcing berskala 10 mL - Vortex mixer

(2) Kromatografi gas

3) Reagen a) Larutan standar internal

Siapkan larutan induk kanabinol 1 mg/mL dalam etanol absolut 1 mL larutan induk masukkan dalam labu takar 200 mL dan tambahkan etanol absolut sampai tanda. (1 mL larutan standar internal = 5 µ kanabinol)

b) Derivatisasi, dipilih salah satu : (1) N,O - bis - trimethylsilyl - trifluoroacetamide (BSTFA) dan

trimethyl clorosilane (TMCS) (2) Campuran tetra metil ammonium hidroksi (TMAH)

(a) dimetril sulfoxid (DMS) (b) metil iodida (c) HCl

c) Gas nitrogen

130

4) Cara Kerja

a) Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT) Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut : (1) Ekstrak urin dalam tabung diuapkan sampai kering dibawah

aliran gas nitrogen, ditambah 50 µL BSTFA dan TMCS, campur dengan menggunakan vortex mixer dan dipanaskan pada suhu 60º C selama 10 menit.

(2) Residu yang didapat dilarutkan dengan 50µL dengan pelarut organik

(3) Residu kering ditambah 70 µL 10 % TMAH-dimetil-sulfoksida (1 ; 20 v/v), setalah 2 menit tambah 5 µL metil iodida.

(4) Setalah 10 menit tambah 200 µL 0,1 N HCl ekstraksi dengan 2 mL iso oktan. (a) Lapisan iso oktan yang terpisah diuapkan dengan alran

gas nitrogen. (b) Residu dilarutkan kembali dengan 50 µL pelarut organik (c) Ambil 1-2 µL diinjeksikan ke dalam injektor

b) Kromatografi Gas - Detector : FID - Kolom : *) Packed Coloum 2 m x 2 mm ID

- 3 % dimetil silikon()OV-1) - 3 % fenilmetil silikon 50 % fenil (V-17)

- Gas : Nitrogen/Helium dengan kecepatan alir 30mL/ mnt

- Suhu : Injektor 210º C Oven 255º C Detektor 275º C

*) Cappilary Coloum yang sesuai (Lihat lampiran 5) Pembacaan Hasil

Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

c. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1). Prinsip Metabolit senyawa kannabis dalam bentuk glukoronida-11-nor-delta-9 tetrahidrokannabinol-9karboksilat (9-Karboksi THC-Gluc) di pecah/hidrolisis dalam suasana basa dengan cara inkubasi temperatur kamar selama 30 menit menjadi senyawa 9-karboksi THC bebas yang kemudian dilanjutkan dengan cara ekstraksi alkilasi untuk mempermudah penguapan senyawa bersifat asam melalui proses derivatisasi metil iodida dalam suasana basa,

131

sehingga membentuk fasa yang akan mengikat THA+ .Senyawa yang terbentuk diekstraksi dengan Toluen dan selanjutnya kelebihan THA+ diabsorpsi oleh resin XAD 7 dan selanjutnya turunan metil bersifat lebih polar ditampung untuk pemeriksaan GC-MS yang sebelumnya diuapkan dan dilarutkan dalam etil asetat

2). Alat

a) Tabung reaksi dengan tutup ulir 12.5 ml b) Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml, c) Rotary Shaker d) Vortex/minishaker e) Kolom Resin XAD 7 f) Pipet pasteur g) Turbo Vap LV h) Gas Nitrogen i) Sentifus j) Vial GC k) GC/MSD

3). Reagen Semua bahan kimia harus pro-analisa a). Larutan induk

11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL, larutan induk Internal Standard Mefruside 100 µg /mL

b). Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) dari SIGMA, c). Larutan NaOH 1 M, d). Larutan Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M dari Aldrich e). Toluen f). Metil Iodida g). Kolom Resin XAD 7 dari Supelco h). Metanol i). Etil Asetat

4). Cara Kerja a). Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 mL

blanko akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar spike 10 µL 11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL dan 2 mL sampel urin (duplo)

b). Tambahkan pada setiap tabung reaksi (1) 20 µL larutan Mefruside 100 µg/mL sebagai ISTD (2) 50 µL Natrium Hidroksida. 6 M, tunggu selama 30 menit

untuk hidrolisa (3) 100 µL Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M (4) 5.0 mL Toluen

132

(5) 100 µL Metil Iodida (6) Tutup tabung reaksi dengan benar dan pastikan tidak

bocor dan kocok pada rotary shaker selama 1 jam (7) Sentifus selama 5 menit (8) Siapkan kolom resin, cuci masing-masing dengan 2 x

1 ml metanol dan toluen (9) Pindahkan fasa organik dari tabung reaksi tersebut

dengan pipet pasteur ke dalam 2.5 – 3 cm kolom resin XAD-7 kolom resin sambil dikumpulkan eluat ke dalam tabung reaksi berlabel. Setelah selesai XAD-7 resin diregenerasi dengan 2 x 2 ml metanol.

(10) Uapkan lapisan toluen sampai kering menggunakan peralatan Turbovap 40º C yang dialiri gas Nitrogen selama 10 menit pada 15 psi

(11) Larutkan residu yang telah kering dengan 100 µL etil asetat

(12) Pindahkan larutan tersebut ke dalam vial GC yang berlabel dengan penomoran dan siap untuk diinjeksikan ke GC-MSD

5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa Metode : Scan Kolom :

Kolom Ultra 2 dari Hewlett Packard, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm

Suhu injektor : 280º C Suhu Detektor 300º C Suhu Oven :

T0 : 80º C, dengan kenaikan 30º C /menit T1 : 210º C, dengan kenaikan 5º C /menit T2 : 250º C, dengan kenaikan 40º C /menit T3 : 300º C, hold time 1 menit

Gas Pembawa ; Helium, Split, Pressure : 18.74 psi Laju Gas : 1.4 mL/mnt, laju konstan Volume Injeksi : 4 µl Waktu Retensi : 9-karboksi THC, 13.39 menit

ISTD Mefruside, 17.menit Run Time 15 menit

Tabel IV.11

Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Untuk 9 Karboksi THC Dan ISTD Setelah Diderivatisasi


9karboksi-THC-CH3 313 357 372 Mefruside 85

133

Penafsiran hasil pemeriksaan Waktu deteksi : Waktu metabolit dapat terdeteksi dalam urin bergantung pada metode immunoassay dan batas deteksi. Biasanya pengguna akut (kurang dari 2 kali seminggu) dapat terdeteksi dalam 1-3 hari dalam urin ketika menggunakan metode dengan batas deteksi di atas 100 ng/mL (atau kurang), untuk pengguna kronis waktu deteksinya lebih lama, dapat lebih dari 1 minggu. Inhalasi positif : Perokok pasif marijuana dapat terdeteksi melalui urin bila menggunakan metode dengan batas deteksi 20 ng/mL, tetapi hal ini jarang terjadi. Bila didapat kadar lebih dari 100 ng/mL, kemungkinan perokok pasif dapat disingkirkan. Variasi kadar : Kadar obat dalam urin dapat berubah 10 kali lipat dalam beberapa jam bergantung pada asupan cairan. Sehingga harus berhati-hati menafsirkan kadar THC yang bervariasi di sekitar batas deteksi, hasil yang negatif kemudian diikuti hasil positif belum tentu berarti adanya penambahan konsumsi marijuana.

134

11. Amfetamin Dan Metamfetamin dalam spesimen manusia a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip Residu hasil ekstraksi yang dielusi dengan eluen tertentu sehingga terbentuk noda dengan warna yang khas.

2) Alat a) Alat KLT

• Plat KLT (20 x 20 cm, 10 x 10 cm, 10 x 5 cm) • Tabung elusi • Pipa kapiler • Botol semprot

b) Oven c) Lampu UV

3) Reagen a) Lapisan Tipis Silica Gel G (lihat lampiran 4) b) Eluen, pilih salah satu :

A : - Metanol 100 mL - Amonia pekat 1,5 mLB : - Etil Asetat 85 mL - Metanol 10 mL - Amonia pekat 5 mL

c) Larutan penampak noda, pilih salah satu : (1) Fast Back K Salt :

Larutan A : Fast Back K Salt 1 % dalam air. Larutan B : Natrium hidroksida 1 M.

(2) Ninhidrin Siapkan larutan ninhidrin 10 % dalam etanol

(3) Reagen Fluoreskamin Siapkan larutan 10 mg fluoreskamin dalam 50 ml aseton

(4) Simons : Larutan A : Natrium karbonat encer 20 % Larutan B : Natrium nitroprusid encer 1 %

d) Larutan Standar Larutan standar amfetamin dan metamfetamin : Siapkan larutan standar dalam metanol mengandung masing-masing 5 mg/mL.

135

4) Cara Kerja a) Ekstraksi

Prinsip Amfetamin dan metamfetamin yang terdapat dalam urin diekstraksi dengan pelarut organik sehingga terbentuk residu, yang dapat dianalisis secara kualitatif dengan alat KLT atau kuantitatif dengan alat KG. Cara Ekstraksi - Masukkan 2 mL urin spesimen ke dalam tabung sentrifus 50

mL dan 0,25 mL larutan standar (larutan 2 metil feniletilamin : 8 µg/mL).

- Tambahkan 2 mL NaOH 1 M, air suling 5 mL dan diklorometan 20 mL dan kocok. Tabung ditutup, kocok sentrifus dengan kecepatan rendah selama 5 menit, lapisan atas dibuang.

- Tambahkan 2 mL asam sulfat 0,15 M, tabung ditutup, kocok dan sentrifus. Lapisan sir sebelah atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 15 mL tambahkan 1 mL natrium hidroksida 1 M dan 2,5 mL 1-klorobutan atau diklorometan. Tutup tabung vortex dengan berat dan disentrifus lapisan organik pindah ke dalam tabung yang bersih, tambahkan 50 µL larutan metanolic asam klorida (9 : 1 v/v).

- Residu siap diperiksa dengan alat KLT atau alat KG. Ekstrak diuapkan dengan vakum sampai kering.

b) Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis - Hasil ekstraksi yang telah dikeringkan dilarutkan kembali

dengan metanol. - Totolkan 5-10 µL larutan standard an hasil ekstraksi pada plat

dengan jarak 2 cm, kemudian elusi dalam tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

- Keluarkan plat dari tabung elusi, kemudian sebelum disemprot dengan larutan penampak noda.

- Pengeringan pada suhu kamar atau di dalam oven pada suhu 120°C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

- Plat yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda, kemudian diamati dengan lampu UV.

- Penampak noda : (1) Fast Black K Salt

- Semprot plat dengan larutan A dan amati warna noda, untuk amin sekunder misalnya metamfetamin akan

136

segera menghasilkan noda. Semprot dengan larutan B sedikit berlebih, akan menghasilkan warna noda untuk amin primer misanya amfetamin.

- Keringkan plat pada udarang kering dan semprot sekali lagi dengan larutan A, supaya menghasilkan noda yang lebih intensif

- Warna bervariasi dari ungu untuk amfetamin sampai merah muda untuk metamfetamin.

- Batas deteksi untuk amfetamin dan metamfetamin adalah 0,05-0,1 µg.

(2) Reagen Ninhidrin - Semprot dengan reagen ninhidrin - Plat keringkan dalam oven pada suhu 120º C sekurang-

kurangnya 15 menit. - Noda warna ungu atau merah muda akan dihasilkan oleh

amfetamin dan noda dengan warna lebih kuat oleh metamfetamin.

(3) Reagan Fluoreskamin - Samprot dengan reagen fluoreskamin. - Plat keringkan dengan udara panas dari blower. - Amati plat di bawah sinar UV pada panjang gelombang

365 nm. - Amfetamin memberikan noda warna kuning

berfluoresensi. - Batas deteksi amfetamin dan amin primer lainnya adalah

10 µg. - Metamfetamin tidak terdeteksi.

(4) Reagen Simons - Semprot plat dengan larutan A, kemudian semprot lagi

dengan larutan B. - Masukkan plat dalam tabung elusi yang kosong dan

beker gelas kecil yang berisi asetaldehid ke dalam tabung elusi yang kosong, tutup tabung elusi.

- Uap asetildehid menyebabkan metamfetamin memberikan noda yang berwarna biru.

- Deteksi minimum untuk metamfetamin dalam urin ± 0,1 µg/mL.

- Amfetamin dan amin primer lainnya memberikan noda warna merah muda sampai merah dan reaksi kurang sensitif.

Pembacaan Hasil Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf Standar.

Rf x 100

137


1) Prinsip

Derivatisasi hasil ekstraksi dilarutkan dengan etil asetat dan pelarut tertentu sesuai dengan metodanya, diinjeksikan ke dalam injektor dengan kondisi tertentu, sehingga dapat ditentukan waktu retensi (Rt), luas area dan puncak kromatogram yang dihasilkan.

2) Peralatan a) Derivatisasi

- Tabung sentrifus berskala - Labu ukur 10 mL

b) Kromatografi Gas


Dibuat dari larutan induk amfetamin, metamfetamin dan larutan standar internal dengan kadar 1 mg/mL dalam etanol. Larutan standar kalibrasi dibuat dari larutan induk dalam urin dengan konsentrasi antara 0-5 µg/mL dan standar internal konsentrasi 5 µg/mL.

b) Derivatisasi ada tiga pilihan, dipilih salah satu : (1) Larutan HFBA :

- 50 µL HFBA ditambahkan ke dalam residu kering. - Tabung ditutup, kocok dengan vortex mixer dan diinkubasi

pada suhu 75º C selama 20 menit. - Buka tutup tabung dan keringkan dengan udara atau

nitrogen pada suhu 30º C, kemudian larutkan dalam 50 µL etil asetat.

- Volume zat yang diinjeksikan dalam injektor 1-2 µL. (2) Larutan TFAA :

- Tambahkan 50 µL TFAA dan 100 µL etil asetat ke dalam ekstrak urin kering dalam tabung.

- Tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu 60º C selama 20 menit.

- Campuran ini diuapkan hati-hati dengan mengalirkan gas nitrogen sampai volume akhir 50 µL pada suhu kamar.

- Injeksikan 1-2 µL ke dalam injektor.

(3) MTBSTFA : - Tambahkan 150 µL MTBSTFA dan 100 µL asetonitril ke

dalam ekstrak urin kering dalam tabung.

138

- Tutup tabung dan panaskan pada suhu 90º C selama 10 menit dan biarkan pada suhu kamar selama 2 jam atau lebih. Tambahkan 500 µL asetonitril pada tabung tersebut di atas. Injeksikan 1-2 µL kedalam injektor.

4) Cara Kerja a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi pada Metoda KLT) b) Pemeriksaan Kromatografi Gas

(1) Kondisi Kromatografi Gas tanpa derivatisasi - Detektor : FID, NPD, ECD - Kolom : Packed column *) (2 m x 3-4 mm I.D)

- dimetil silikon (OV-1, SE-30) - metal fenil silikon (OV-17)

- Suhu : Injektor : 250 - 280º C Oven : 90 - 280º C Detektor : 280 - 300º C

- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 30 mL/mnt *) Capillary Column yang sesuai (Lihat lampiran 5)

(2) Kondisi Kromatografi Gas dengan derivatisasi : - Detektor : FIO, NPO, ECO atau MS dengan ionisasi El-

Kolom dan suhu seperti pada metoda tanpa derivatisasi.


c. Metoda Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1). Prinsip Ekstraksi sederhana terhadap senyawa-senyawa yang bersifat basa ke dalam pelarut organik, dari urin yang dibasakan pada pH 13 dan dijenuhkan dengan natrium sulfat anhidrat. Hasil ekstraksi kemudian dianalisis dengan GC-NPD. Identifikasi dilanjutkan dengan menggunakan GC-MSD yang sebelumnya di derivatisasi dengan MBTFA.

2). Alat

a) Tabung Reaksi dengan tutup ulir 12.5 ml b) Transferpet 1 – 10 µl, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml, c) Rotary Shaker

139

d) Vortex/minishaker e) Pipet pasteur f) Turbo Vap LV g) Gas Nitrogen h) Sentifus i) Dry bath incubator j) Vial GC k) GC/MSD/NPD

3). Reagen

Semua bahan kimia harus pro-analisa a) Larutan stok amfetamin, metamfetamin, MDMA (metilendioksi-

metamfetamin), MDA (metilendioksi-amfetamin) masing-masing 100 ppm dari Cerilliant dalam metanol

b) Larutan ISTD Difenilamin (DPA) 1000 ppm dalam metanol. c) Larutan KOH 6 M d) TBME (tert butil metil eter), e) Natrium sulfat anhidrat f) Asetonitril g) TMCS ( trimetilklorosilan) h) MBTFA (N-metil-bis trifluoroasetamida)

4). Cara Kerja

a) Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 5 ml blanko akuades, 5 ml blanko urin, 5 ml larutan standar campuran dalam urin dengan kadar akhir 1 ppm , dan 5 ml sampel urin

b) Tambahkan setiap tabung reaksi

(1) 10 µL larutan ISTD diphenilamin (DPA) 1000 ppm (2) 0.5 ml KOH 6 M (3) 2.5 ml TBME (tert butil metil eter), (4) 2 g natrium sulfat anhidrat sambil di vortex (5) Tutup tabung reaksi dengan rapat (6) Kocok di rotary mixer selama 20 menit (7) Sentifus selama 10 menit (8) Pindahkan fasa organik 200 µL ke dalam vial berinsert dan

tutup (9) Siap di injekkan ke GC-NPD (10) Jika suspek gol amphetamine lanjutkan, sisa fasa organik

dengan penambahan 5 µL TMCS uapkan ad kering dengan aliran gas Nitrogen kemudian tambahkan 50 µL Acetonitril, vortex 1 menit secara perlahan kemudian tambahkan 25 µL MBTFA, vortex perlahan 1 menit, incubasi 70° C selama 10 menit, pindahkan ke vial berinsert, tutup siap injek ke GC-MSD.

140

5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa

a). Alat Kromatografi Gas Nitrogen Phospourus Detector Metode : StimNPD Kolom :

Kolom HP 5 , panjang 15 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm

Suhu injektor : 280° C Suhu Detektor 300° C Suhu Oven :

T0 : 100° C, hold time 1 menit dengan kenaikan 15° C/menit T1 : 195° C, dengan kenaikan 30° C/menit T2 : 300° C, hold time 4 menit

Gas Pembawa ; Helium, N2, Compressed air Laju Gas : 1.2 mL/mnt, laju konstan Volume Injeksi : 5 µl Waktu Retensi : Amfetamin, 2.35 menit

Metamfetamin, 3.2 menit MDA, 5.6 menit MDMA, 5.9 menit ISTD DPA, 6.5 menit

Run Time 14.8 menit b).Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa (HP 6890-5973)

Metode : Scan Kolom :

Kolom Ultra1, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm

Suhu injektor : 280o C Suhu Detektor 300° C Suhu Oven :

T0 : 80° C, hold time 1 menit dengan kenaikan 15° C/menit T1 : 250° C, hold time 2 menit dengan kenaikan 30° C/menit T2 : 280° C, hold time 1 menit

Gas Pembawa ; Helium, Split, Pressure : 18.74 psi Laju Gas : 1.4 mL/mnt, laju konstan Volume Injeksi : 4 µl Waktu Retensi : Amfetamin, 4.98 menit

Metamftamin, 5.90 menit MDA, 7.79 menit MDMA, 8.65 menit ISTD DPA, 7.63 menit

Run Time 16.33 menit

141

Tabel IV.13 Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Amphetamine,

Methamphetamine, MDA, MDMA dan ISTD Setelah Diderivatisasi


Amphetamine-TFA 140 118 91 Methamphetamine-TFA 154 118 110

MDA-TFA 162 135 275 MDMA-TFA 154 162 135 ISTD DPA 169

Penafsiran hasil Setelah konsumsi MDA, kadar dalam plasma dan urin dari bentuk asli zat dilaporkan kurang dari 0,4 dan 10 µg/mL secara berturutan. Untuk PMA kadar plasma dan urin kurang dari 0,2 dan 5 µg/mL, berturutan. Pada kasus kecanduan kadar MDA dalam plasma adalah 5-25 µg/mL, sedangkan dalam urin adalah 50-150 µg/mL. Untuk PMA kadarnya adalah 0,3-2 µg/mL dalam plasma dan 5-200 µg/mL dalam urin. Pada suatu penelitian menggunakan 1,5 mg/kg berat badan MDMA, kadar plasma maksimum yaitu 0,33 µg/mL, kadar dalam urin 1,4, 14 dan 23 µg/mL ditemukan setelah 1,5,10 dan 22 jam secara berturutan. Kematian terjadi pada kadar MDA sejumlah 2,3-26 µg/mL dalam darah dan 46-175 µg/mL dalam urin, sedangkan untuk MDMA kadar yang menyebabkan kematian ditemukan 0,9-2 µg/mL dalam darah, untuk PMA kadar yang ditemukan 0,3-1,9 µg/mL dalam darah dan 6,0-175 µg/mL dalam urin. Bentuk asli amfetamin telah terdeteksi dalam urin sampai 29 jam setelah satu kali konsumsi 5 mg afhetamin. Metamfetamin dalam bentuk asli juga terdeteksi sampai 23 jam setelah satu kali konsumsi. Analisis amfetamine yang positif biasanya berarti penggunaan amfetamin atau Metamfetamin dalam waktu 24-48 jam. Beberapa hal yang harus diperhatikan. (1) beberapa zat dekongestan dan zat anorektik/pengurang nafsu makan yang mengandung efedrin dan fenilpropanolamin dapat mengakibatkan hasil positif amfetamin menggunakan tes EMIT dan RIA. (2) beberapa obat resep dokter seperti benzphetamine, fenfluramine, mephertamine, phenmetrazine dan phentermine dapat mengakibatkan hasil positif dengan tes immunoassay, (3) beberapa obat mempunyai metabolit berupa metamfetamin atau amfetamin.

142

Sehingga kadang perlu dilakukan pemeriksaan zat induk bila ada keraguan apakah subyek mengkonsumsi amfetamin/metamfetamin.

12. Derivat Amfetamin dalam sisa bahan makanan, minuman, obat

a. Spektrofotometri Metoda ini digunakan untuk pemeriksaan derivat amfetamin dalam sediaan tunggal dan dosis tinggi yang terdapat dalam sisa bahan makanan, minuman, obat yang diduga menyebabkan keracunan. 1) Prinsip

3,4 methylene dioxyamphetamin (MDA) diekstraksi dari sampel dengan pelarut kloroform dan kemudian dilarutkan dalam asam sulfuric 0,1 M diukur pada spektrofotometer pada 340-220 nm secara kuantitatif.

2) Peralatan a) Corong pisah 250 mL b) Tabung sentrifus & sentrifus c) Spektrofotometer & pencatat d) Kertas saring

3) Reagen

a) NaOH 20 % (20 g/dl) Larutan 20 g NaOH dalam air. Larutkan dalam 100 mL air.

b) NaOH 2 % (2 g/dl) Larutan 2 % NaOH dalam air. Larutkan dalam 100 mL air.

c) Kloroform d) Asam Sulfat 0,1 M

- 2,8 mL asam sulfat pekat masukkan ke dalam 100 mL secara perlahan-lahan.

- Dinginkan dan larutkan ke dalam air sampai 1 L.

4) Cara Kerja - Ke dalam corong pisah 250 mL, masukkan 10 mL spesimen

(darah, urin, cairan lambung dan larutan standar darah MDA) dengan larutan NaOH 20 %.

- Ekstrak 2 kali dengan 100 mL klorofom (CHCl3) selama 5 menit. - Cuci lapisan campuran HCCl3 dengan 10 mL NaOH 2 %,

kemudian dengan 20 mL air. Pisahkan lapisan air. - Saring dengan kertas saring lapisan CHCl3. Ke dalam corong

pisah 250 mL yang lain tambahkan 5 mL 0,1 N Asam Sulfat dan ekstraksi selama 5 menit.

- Pisahkan lapisan asam sulfat dan sentrifus.

143

- Tempatkan 3 mL ekstrak Asam Sulfat dalam kuvet dan 0,1 N Asam Sulfat dalam cell standart.

- Catat absorban pada panjang gelombang 340 – 220 nm. Absorsikan pada 285 nm dan 234 nm.

- Ukur absorban pada panjang gelombang 285 nm.

b. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) 1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu, kemudian ditetapkan secara KLT sehingga terbentuk noda yang berwarna khas.

2) Peralatan a) Alat KLT

- Plat KLT (20 x 20 cm, 10 X 10 cm, 10 x 5 cm) - Tabung elusi - Pipet kapiler - Botol semprot

b) Oven c) Lampu UV

3) Reagen : a) Lapisan tipis Silica Gel. G (Lihat Lampiran 4) b) Eluen, pilih salah satu

A : - Metanol 100 mL - Amonia pekat 1,5 mLB : - Etil Asetat 85 mL - Metanol 10 mL - Amonia pekat 5 mL

c) Larutan penampak noda, pilih salah satu : (1) Fast Back K Salt :

Larutan A : Fast Back K Salt 1 % dalam air. Larutan B : Natrium hidroksida 1 M.

(2) Ninhidrin Siapkan larutan ninhidrin 10 % dalam etanol

(3) Fluoreskamin (fluram) Siapkan larutan 10 mg fluoreskamin dalam 50 ml aseton

d) Larutan Standar Larutan standar derivat Amfetamin (MDMA, MDA, PMA dan lain-lain). Siapkan larutan standar dalam metanol mengandung masing-masing 1 mg/mL.

e) Solid Phase Extraction (SPE)

144

4) Cara kerja : a) Ekstraksi

Prinsip Derivat amfetamin yang terdapat dalam urin diekstraksi dengan pelarut organik sehingga terbentuk residu, yang dapat dianalisa secara kualitatif dengan alat KLT atau secara kuantitatif dengan alat KG. Cara ekstraksi - 2 mL urin dengan internal standar (0,25 mL 8 µg/mL larutan

standar internal dicampur dengan buffer phospat 0,1 M pH). - pH dibuat 5 – 7 dengan 0,1 M NaOH atau 0,1 M HCL jika

perlu. - Solid phase Extraction (SPE) cartridges volume 5 mL

dijernihkan dengan 2 mL metanol dan 2 mL 0,1 M Buffer phospat pH 6.

- Spesimen urin dialirkan melalui cartridges dengan perlahan-lahan dalam waktu sekurang-kurangnya 2 menit.

- Cartridges dicuci dengan 1 mL asam asetat 1 M dan kemudian keringkan dengan cara disedot dengan vakum selama 5 menit.

- Cartriges dicuci kembali dengan metanol 6 mL kemdian keringkan lagi selama 5 menit.

- Analit yang terdapat dalam SPE dielusi dengan 2 mL etil asetat yang mengandung 2 % amonia pekat yang dibuat baru.

- Eluat diuapkan secara hati-hati dengan uap nitrogen pada temperatur kurang dari 40º C. Hasil ekstraksi siap untuk dilakukan penetapan dengan alat KLT dan KG.

b) Kromatografi Lapisan Tipis

- Hasil ekstraksi yang telah dikeringkan dilarutkan kembali dengan metanol 50 µL.

- Totolkan 5-10 µL larutan standar dan hasil ekstraksi pada plat dengan jarak 2 cm, kemudian elusi dalam tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

- Keluarkan plat dari tabung elusi, kemudian plat dikeringkan sebelum disemprotkan dengan penampak noda.

- Pengeringan pada suhu kamar atau didalam oven pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

- Plat yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda, kemudian setelah kering diamati dengan lampu UV.

145

c) Penampak noda : (1) Fast Black K Salt

- Semprot plat dengan larutan A dan amati warna noda, untuk amin sekunder misalnya metamfetamin akan segera menghasilkan noda. Semprot dengan larutan B sedikit berlebih, akan menghasilkan warna noda untuk amin primer misanya amfetamin.

- Keringkan plat pada udara kering dan semprot sekali lagi dengan larutan A, supaya menghasilkan noda yang lebih intensif

- Warna bervariasi dari ungu untuk amfetamin sampai merah muda untuk amin sekunder misalnya metamfetamin.

- Batas deteksi untuk Derivat amfetamin adalah 0, 5 µg. (2) Reagen Ninhidrin

- Semprot dengan reagen ninhidrin - Plat keringkan dalam oven pada suhu 120º C sekurang-

kurangnya 15 menit. - Noda warna ungu atau merah muda akan dihasilkan oleh

metamfetamin dan noda dengan warna lebih kuat oleh metamfetamin.

(3) Reagen Fluoreskamin - Samprot dengan reagen fluoreskamin. - Plat keringkan dengan udara panas dari blower. - Amati plat di bawah sinar UV pada panjang gelombang

365 nm. - Amfetamin memberikan noda warna kuning berfluoresensi. - Batas deteksi amfetamin dan amin primer lainnya adalah

+ 10 µL.

Pembacaan hasil Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar

c. Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip

Derivitisasi hasil ekstraksi dilarutkan dengan etil asetat dan pelarut tertentu sesuai dengan metodanya. Injeksikan ke dalam injektor dengan kondisi tertentu, sehingga dapat ditentukan waktu retensi (Rt) luas area dan puncak kromatogram yang dihasilkan.

2) Peralatan

a) Tabung sentrifus berskala b) Labu ukur 10 mL

146


Dibuat dari larutan induk derifat amfetamin (MDMA, MDA, PMA dll) dan standar internal dengan kadar 1 mg/mL dalam etanol. Larutan standar kalibrasi dibuat dari larutan induk dalam urin dengan konsentrasi antara 0 – 5 µg/mL dan standar internal 5 µg/mL.

b) Derivatisasi spesimen dapat memakai salah satu dari 3 larutan dibawah ini : (1) Larutan HFBA :

- HFBA (50 µL) ditambahkan ke dalam residu kering. - Tabung ditutup campur dengan vortex dan inkubasi

pada 75º C selama 20 menit. - Buka tutup tabung tersebut keringkan isinya dengan

gas nitrogen pada suhu 30º C. - Residu dilarutkan dalam 50 µL etil asetat suntikkan 1-2

µL kedalam injektor. (2) Larutan KOH

- 50 µL Kalium hidroksida 0,5 M ditambah ke dalam residu kering kemudian tambahkan 500 µL toluen.

- Campur dan sentrifus sehingga terpisah 2 lapisan (lapisan organik dan lapisan air), lapisan organik dipindahkan ke tabung yang bersih dan tambah 5 µL larutan HFBA

- Larutan dikocok, tambahkan segera 500 µL natrium bicarbonat 10 % v/v smbil dikocok terus menerus.

- Tabung disentrifus ambil 1 µL lapisan atas (toluen) disuntikkan ke dalam injektor.

(3) Larutan TFAA : - 100 µL etil asetat dan 50 µL larutan TFAA ditambahkan

ke dalam residu kering. - Tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu 60º C

selama 20 menit. - Campuran tersebut diuapkan segera hati-hati sampai

50 µL, 1 – 2 µL disuntikkan ke dalam injektor.

4) Cara Kerja a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi Metoda KLT)

b) Kromatografi Gas

(1) Kondisi Kromatografi Gas dengan derivitisasi sebagai berikut : - Detektor : FID, NPD, ECD - Kolom : Packed Column *) (2 m x 3-4 mm I.D)

147

- dimetil silikon (OV-1, SE-30) atau - metal penil silikon (DB-1, OV-17)

- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 30 mL menit - Suhu : Injektor : 250 – 280º C

Oven : 90 – 280º C Detektor : 280 – 300º C

(2) Kondisi Kromatografi Gas tanpa derivatisasi sebagai berikut : - Detektor : FID, NPD - Kolom : Packed Column *) (2 m x 3-4 mm I.D)

- dimetil silikon (OV-1, SE-30) atau - metal penil silikon (DB-1, OV-17)

- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 30 mL menit

- Suhu : Injektor : 250 – 280º C Oven : 90 – 280º C Detektor : 280 – 300º C

*) Capilary column pilih yang sesuai (lihat lampiran 5)

Pembacaan hasil :

Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

148

13. Barbiturat dalam sisa bahan makanan, minuman dan obat

a. Spektrofotometri

Metoda ini digunakan untuk pemeriksaan Barbiturat dalam sediaan tunggal dan mempunyai dosis tinggi yang terdapat pada sisa bahan makanan, minuman, obat yang diduga menimbulkan keracunan. 1) Prinsip

Golongan obat barbiturat diekstraksi dari spesimen dengan pelarut organik, residu yang didapat dilarutkan dengan akuades dalam suasana basa diukur dengan spektrofotometer pada 240 nm secara kualitatif dan tambahkan asam bila diukur dengan spektrofotometer pada λ 200-400 nm secara kuantitatif.

2) Alat

a) Spektrofotometer & pencatat b) Cairan pemisan c) Kertas saring d) Labu ukur 10 mL

3) Reagen

a) Larutan bufer borat pH = 8,4 : Campurkan 22,4 g dinatrium tetraborat dengan 70 mL larutan asam hidroklorida dalam akuades (1 mol/L), kemudian encerkan hingga 2 L dengan akuades.

b) Larutan asam hidroklorida dalam akuades (2 mol/L). Larutan asam sulfat pekat (kerapatan relatif 1,83).

c) Larutan amonium hidroksida pekat (kerapatan relatif 0,88). d) Campuran natrium sulfat/karbon aktif :

Tambahkan 100 mg karbon aktif kepada 100 g natrium sulfat anhidrat, kemudian campurkan hingga homogen dan panaskan dalam cawan evaporasi pada 100º C selama 8 jam. Biarkan dingin dan simpan dalam botol yang tertutup rapat.

Standar : Satu seri larutan yang masing-masing mengandung 5, 10, 25 dan 50 mg/L Barbital dalam plasma blanko yang dibuat dengan mengencerkan larutan standar natrium barbital dalam air (1,12 g/L), yang setara dengan asam dietilbarbiturat dengan konsentrasi 1,00 g/L

149

4) Cara Kerja

b) Tambahkan 5 mL spesimen , 2 mL larutan asam hidroklorida dalam akuades (2 mol/L) dan 60 mL dietileter (dengan hati-hati) ke dalam corong pisah kapasitas 250 mL.

c) Basahi tutup corong pisah dengan akuades, tutup corong pisah dan goyang perlahan-lahan selama 2 menit.

d) Biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan kemudian fasa bawah (fasa air) dibuang dengan membuka kran corong pisah.

e) Tambahkan ekstrak dietileter ke dalam 10 mL larutan buffer borat dalam corong pisah kedua dan kocok selama 1 menit.

f) Biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan kemudian fasa bawah (fasa air) dibuang lagi dengan membuka kran corong pisah.

g) Cuci dinding dalam corong pisah dengan 5 mL akuades, biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan kemudian fasa air dibuang lagi dengan membuka kran corong pisah.

h) Tambahkan 4 g campuran natrium sulfat karbon ke dalam ekstrak dietileter dalam corong pisah. Kocok isi corong pisah agar terdispersi dan saring. Setelah disaring, tampung ekstrak dietileter dalam erlenmeyer kapasitas 150 mL.

i) Tambahkan lebihn lanjut 20 mL dietileter ke dalam corong pisah, kocok dan tambahkan ke dalam ekstrak dietileter dalam Erlenmeyer dengan bantuan corong fitrasi.

j) Uapkan ekstrak dietileter hingga kering dalam penangas air pada 40°C dibawah atmosfer udara tekan atau gas nitrogen.

k) Tambahkan 5,0 mL akuades ke dalam ekstrak kering dalam Erlenmeyer, goyang perlahan-lahan dan biarkan selama 5 menit.

l) Saring dengan kertas saring larutan dalam erlenmeyer dan tampung filtrat dalam tabung reaksi ukuran 12,5 cm.

m) Periksa titik nol spektrofotometer pada 240 nm menggunakan akuades baik pada posisi spesimen maupun pada posisi referensi. Gunakan sel/kuvet kuarsa ukuran 1 x 1 x 4 em

n) Tambahkan 4 mL filtrat dari tabung reaksi ke dalam set yang bersih dan tambahkan 50 µL larutan amonium hidroksida pekat dan aduk dengan pengaduk plastik. Pastikan bahwa pH larutan kira-kira 10.

o) Ukur segera absobansi pada 240 nm dengan akuades sebagai blanko.

p) Apabila perlu, encerkan secara akurat larutan ekstrak dengan akuades sehingga absorbansi terbaca pada kisaran yang baik dan catat faktor pengenceran yang digunakan. Apabila pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer yang dilengkapai fasilitas skanning, skan pada 200-450 nm

150

q) Ulangi pengukuran atau skanning setelah 5 menit. r) Tambahkan 0,1 mL asam sulfat pekat ke dalam sel, aduk

menggunakan pengaduk plastik dan pastikan bahwa pH larutan di sekitar 2 ( menggunakan kertas indikator universal).

s) Ulangi pembacaan (249 nm) atau skan (200-450nm)

Pembacaan Hasil Sejumlah senyawa dapat mengganggu analisis ini. Glutetimida akan terhidrolisis engan cepat pada keadaan alkalis, sehingga absorbansi pada 240 nm akan turun secara signifikan setelah 5 menit pada pH = 11 (langkah 15 di atas) apabila senyawa ini ada. Adanya senyawa lain, seperti metaqualon (misalnya dikloralfenazon) dapat diatasi dengan memperhatikan spectra pada daerah 200-450 nm. Penambahan 0,1 mL larutan natrium hidroksida ke dalam ekstrak amoniakal (langkah 14 di atas) menghasilkan pergeseran spectra lanjut yang karakteristik yang dapat dimanfaatkan dalam analisis kualitatif. Sensitivitas : Barbiturat 2 mg/L

b. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip

Barbiturat diekstraksi dari spesimen biologis dengan pelarut organik, kemudian diuapkan hingga diperoleh residu. Selanjutnya residu dianalisa dengan KLT.

2) Peralatan a) Alat KLT

- Lempeng KLT silika gel GF 254 ( 20 x 20 cm, 10 x 10 cm, 10 x 5 cm)

- Tabung elusi - Pipa kapiler - Botol semprot

b) Oven c) Lampu UV

3) Reagen

Semua bahan kimia harus reagen pro-analisa. a) Asam klorida (HCl) 6 N

Larutkan 50,0 mL asam klorida pekat dalam 100 mL akuades. b) Diisopropil eter

151

c) Kalium permanganat (KMnO4) 100 mg/100mL. Larutkan 0,1g kalium permanganat dalam air dan encerkan hingga 100 mL.

d) Merkuri sulfat (HgSO4) 2 g/100 mL, campurkan 10,0 mL asam sulfat pekat sambil digoyang. Biarkan larutan dingin kemudian encerkan hingga 250 mL dengan akuades.

e) Difenil karbason (OPC) 10 mg/100 mL. Larutkan 10 mg OPC dalam 100 mL kloroform. Simpan dalam botol gelap.

f) Penampak noda (1) Kalium permanganat (KMnO4) (2) Merkuri sulfat (HgSO4) (3) Difenil karbason (DPC)

4) Cara Kerja

a) Ekstraksi

Prinsip Golongan obat barbiturat diekstraksi dengan pelarut organik dan ditambah dengan basa kuat sehingga terbentuk lapisan alkali, yang dapat dianalisa secara kualitatif dengan alat KLT dan secara kuantitatif dengan alat KG. Cara Ekstraksi : (1) Pipet 3,0 mL spesimen (darah, serum, plasma, urin dan isi

lambung ke dalam tabung gelas 60 mL atau corong pisah 100 mL. Untuk blanko campur 3,0 mL larutan standar barbiturat dan 3,0 mL akuades.

(2) Atur pH untuk semua spesimen sampai 6,5 (3) Tambahkan 50,0 mL kloroform pada setiap spesimen dan

kocok selama 3 menit. (4) Buang lapisan air dari semua spesimen kecuali whole blood

dan saring. Jika menggunakan whole blood, lapisan kloroform sebaiknya dipisahkan dengan hati-hati. Saring setiap ekstrak kloroform yang terdapat pada butir (3) menggunakan kertas saring E&D # 615.

(5) Kocok lapisan kloroform dari semua spesimen kecuali whole blood dengan 5 mL buffer fosfat pH 7. Biarkan lapisan memisah dan buang lapisan air.

(6) Masukkan 40,0 mL lapisan kloroform (yang telah dicuci) ke dalam botol gelas ukuran 60 mL.

(7) Tambahkan 5,0 mL NaOH 0,45 N dan kocok campuran selama 1 menit. Tambahkan 10,0 mL NaOH 0,45 N ke dalam ekstrak larutan standar.

152

(8) Pipet lapisan alkali ke dalam tabung dan sentrifus (lapisan kloroform dapat disaring atau dapat juga disimpan untuk menentukan adanya kemungkinan terdapatnya obat netral).

b) Kromatografi Lapisan Tipis

(1) Kumpulkan lapisan alkali yang bening dari sentrifus pada

metoda ekstraksi, masukkan ke dalam botol gelas yang bertutup 60 mL dan asamkan larutan ini dengan asam klorida 6 N, tambahkan 10,0 mL kloroform dan kocok selama 3 menit.

(2) Pisahkan lapisan air kemudian saring lapisan organik ke dalam cawan penguap dan uapkan sampai menjadi residu (kerjakan di dalam lemari asam).

(3) Larutkan residu dalam 0,2 mL kloroform dan totolkan pada lempeng kaca KLT. Setiap lempeng harus ditotolkan larutan standar barbiturat yang sesuai (atau diphenilhydantoin).

(4) Lempeng kaca KLT dielusi dengan diisopropil eter. (5) Keringkan lempeng kaca KLT tersebut pada suhu kamar. (6) Semprot lempeng dengan kalium permanganat, merkuri

sulfat dan difenil karbason. Catat hasil setelah penyemprotan.

Pembacaan Hasil

Bandingkan nilai Rf ekstrak dan warna yang timbul dengan standar. Reaksi warna setelah penyemprotan

Jenis Barbiaturat Nilai Rf KMnO4 HgSO4 DPC

Amobarbital 0.78 - Abu-abu Violet Butabarbital 0.72 - Abu-abu Violet Heksobarbital 0.62 Kuning Abu-abu Violet Pentobarbital 0.80 - Abu-abu Violet Fenobarbital 0,62 - Abu-abu Violet Sekobarbital 0,87 Kuning Abu-abu Violet

c. Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip

Barbiturat diekstraksi dari spesimen biologis dengan pelarut organik kemudian diuapkan sehingga diperoleh residu,selanjutnya dianalisa dengan kromatografi gas.

153

2) Peralatan

Alat kromatografi gas. Kondisi Kromatografi Gas : a) Detektor : FID b) Kolom : Apiezon *) L 10% c) Suhu : 210º C d) Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 50 mL/menit *) Cappilary Column yang sesuai

3) Reagen

a) Larutan standar golongan barbiturat b) Gas Nitrogen

4) Cara Kerja a) Ekstraksi (lihat ekstraksi metoda KLT) b) Pemeriksaan Kromatografi Gas

- Bahan untuk kromatografi gas berasal dari ekstraksi spesimen - Larutkan residu hasil ekstraksi tersebut dalam 50 µL metanol

dan injeksikan ke dalam alat kromatografi gas. - Buat larutan standar barbiturat dalam 1 µL larutan tersebut ke

dalam alat kromatografi gas.


Waktu retensi relatif Jenis Barbiaturat Kolom Apiezon L 10%

Suhu 210º C

Barbital 1,0 Allobarbital 1,47 Butabarbital 1,84 Amylobarbital 2,14

14. Benzodiazepin dalam Spesimen Manusia

a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip

Hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu, sehingga terbentuk noda dengan warna yang khas. Nilai Rf dari noda gugus fungsional yang didapat setelah penyemprotan atau di bawah sinar lampu UV dapat mendeteksi dan mengidentifikasi berbagai jenis golongan benzodiazepin.

154

2) Peralatan Alat KLT : a) Pipet kapiler b) Lempeng KLT dilapisi silika gel dengan ketebalan 0,25 mm c) Tabung elusi (Developing tank) d) Lampu UV

3) Reagen

a) Etanol 70 % b) Campuran aseton : toluen : CHCl3 = 25 : 40 : 40.

Campur 25 mL aseton, 40 mL toluen dan 40 mL CHCl3 c) Larutan baku benzodiazepin untuk ditotolkan dengan kadar 1

mg/mL. Larutkan 10 mg masing-masing bahan baku obat dalam etanol, encerkan dengan etanol sampai 10 mL

d) Reagen penampak noda iodoplatina atau dragendorf. (1) Reagen Iodoplatinat

Larutkan 0,25 mL reagen platinat klorida dan 5 g kalium iodida dalam 100 mL akuades, tambahkan 2 mL asam klorida, campur sampai homogen.

(2) Reagen Dragendorf Larutan A : Campur 2 g bismut subnitrat dan 25 mL asam

asetat glasial atau pekat dan 100 mL akuades. Larutan B : Larutkan 40 g kalium iodida dalam akuades. Campur 10 mL larutan A dan 10 mL larutan B, tambahkan 20 mL asam asetat glasial dan 100 akuades.

4) Cara Kerja a) Ekstraksi

Prinsip Golongan obat Benzodiazepin yang terdapat dalam spesimen diekstraksi dengan pelarut organik sehingga terbentuk residu yang dapat dianalisa secara KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan KG (Kromatografi Gas) Cara Ekstraksi : (1) Tambahkan 5-20 mL spesimen (darah, plasma, urin atau 10

g hati yang sudah dihomogenkan dengan 10 mL akuades) ke dalam corong pisah yang telah berisi 100 mL dietil eter. Tambahkan 5 mL buffer fosfat pH 7 pada spesimen.

(2) Kocok kuat-kuat selama 3 menit dan sentrifus, bila perlu untuk memecah emulsi.

155

(3) Buang lapisan air bagian bawah dan saring lapisan eter melalui kertas saring whatman # 1.

(4) Tambahkan 5 mL H2SO4 0,2 N dan kocok kuat-kuat selama 3 menit untuk mengekstraksi kelebihan obat yang bersifat basa (lihat tabel 3 di bawah ini)

(5) Pindahkan lapisan asam, masukkan ke dalam corong pisah lain, pisahkan lapisan dietil eter. Tambahkan 1 mL NaOH jenuh dan 25 mL CHCl3 ke dalam ekstrak asam. Kocok kuat-kuat dan saring CHCl3 melalui kertas whatman # 1 ke dalam beker dan uapkan dengan pemanasan dan udara. Biarkan sampai kering pada suhu kamar dengan pengeringan udara atau nitrogen dengan hati-hati untuk mencegah pemecahan atau penguapan obat.

(6) Tambahkan 5 mL HCl 2 N ke dalam lapisan dietil eter (butir 5) dan ekstraksi dengan mengocok campuran. Pindahkan lapisan asam, masukkan ke dalam corong pisah lain sisihkan dietil eter. Tambahkan dengan hati-hati 1 mL NaOH jenuh dan tambahkan 25 mL CHCl3 ke dalam ekstrak asam. Kocok kuat-kuat dan saring CHCl3 melalui kertas saring whatman # 1 ke dalam beker. Uapkan seperti butir 5) diatas.

(7) Tambahkan 5 mL NaOH 0.45 N ke dalam lapisan dietil eter, kocok kuat-kuat selama 1 menit. Ambil dan buang lapisan air, saring dan uapkan dietil eter (penguapan seperti pada lapisan eter butir 5).

(8) Tambahkan dengan teliti 200 µL CHCl3 ke dalam setiap beker glass (butir 5), 6), 7) dan aduk untuk memperoleh hasil ekstraksi benzodiazepin.

Tabel IV.9

Distribusi Dari Benzodiazepin

Eter (Netral)

Asam Klorida (weaker bases)

Asam Sulfat (stronger bases) Akuades

Klorazepat 7 68 25 Klordiazepoksid 1 15 84 Demoksepam Most Desmetilklorida Zepoksid-asam Oksazepam 39 60 1 Diazepam 5 85 10 Desoksidemoksepam Most Nitrazepam 0 90 10 Medazepam 1 13 86 Flurazepam 0 0 99 Klonazepam 69 31 0 Umum Kafein Beberapa Kafein Nikotin Interfering Lemak Methakualon Putrescines Bahan Subtances Quinine

156

Keterangan * Persentase dari masing-masing obat yang ditemukan pada beberapa traksi hasil dari

ekstraksi benzodiazepin dalam spesimen dengan Buter pH 7, pelarut yang dipakai dietil eter.

Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis

a) Totolkan 3 noda hasil ekstraksi benzodiazepin (4.a.8) pada

lempeng kaca KLT yang sama, totolkan pula larutan standar obat. Tempatkan lempeng kaca KLT yang telah ditotol pada tabung elusi yang berisi campuran aseton : Toluen : Kloroform. Salah satu sisi dalam tabung elusi diberi kertas untuk meratakan kecepatan elusi.

b) Setelah eluen sampai tanda, angkat lempeng kaca KLT yang telah dielusi, keringkan pada suhu kamar atau dibantu dengan menyemprotkan udara dingin. Kemudian lihat dibawah lampu UV pada λ 254 nm. Bandingkan noda yang didapat dari ekstrak spesimen dengan larutan standar obat yang diketahui. Lihat tabel 4 dibawah ini.

c) Jika terdapat noda berwarna gelap dari serapan yang kuat, sesuai dengan benzodiazepin dan atau metabolitnya, yang terdeteksi pada lempeng kaca KLT, semprot lempeng kaca KLT dengan reagen penampak noda. Reaksi positip adalah noda coklat keungu-unguan (asam iodoplatinat) atau jingga (dragendorf). Apabila obat dan metabolit diketemukan pada spesimen biologi, kemungkinan identifikasi dapat lebih meyakinkan.

d) Apabila tidak ada noda atau hanya terlihat noda lemah, uji yang lebih sensitif dapat dilakukan dengan merendam lempeng kaca sampai basah dengan H2SO42N (sampai jenuh), biarkan penguapan dengan pengeringan (tidak lebih dari 5 menit) dalam lemari asam dan amati di dalam ruangan gelap atau dalam kotak dengan lampu UV pada λ 254 nm. Reaksi positip untuk benzodiazepin dan metabolitnya adalah warna kuning - hijau atau noda putih yang berfluoresensi. Obat yang mendapat perlakuan seperti ini tidak dapat dikonfirmasikan dengan scanning UV. Hasil kerokan noda pada metoda KLT ini dapat diteruskan untuk pengujian secara spektrofotometri.

157

Sensitivitas Deteksi dengan metoda KLT ini adalah 1-2 µg. Tetapi dengan kadar total 3 µg (3 mL dalam cell 5 cm) akan memberikan spektrum UV yang lebih jelas untuk semua uji benzodiazepin.


1) Prinsip Golongan benzodiazepin diekstraksi dari spesimen biologis dengan pelarut organik kemudian diuapkan sehingga diperoleh residu, selanjutnya dianalisa dengan Kromatografi gas.

2) Alat Kondisi Kromatografi Gas : a) Detektor : FID b) Kolom : Packed Column *) 2,5% SE- 30 atau 2,5% OV- 17 c) Suhu : 180º C - 225º C d) Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 50 mL/menit *) Cappilary Column yang sesuai

3) Reagen

a) Larutan standar golongan benzodiazepin b) Gas Nitrogen

4) Cara Kerja a) Ekstraksi (lihat ekstraksi metoda KLT) b) Pemeriksaan Kromatografi Gas

(1) Bahan untuk kromatografi gas adalah residu hasil ekstraksi diatas. Larutkan residu hasil ekstraksi tersebut dalam 50 µL metanol dan injeksikan ke dalam alat kromatografi gas.

(2) Buat larutan standar golongan benzodiazepin dalam 1 µg/mL metanol dan injeksikan 1 µg/mL larutan tersebut kedalam alat kromatografi gas.

158


Waktu retensi relatif

KOLOM

SE – 30 OV – 17

JENIS BENZODIAZEPIN 180º C 225º C 180º C 225º C

Diazepam - 1,16 9,5 - Klordiazepoksid - 1,46 - 2,9 Nitrazepam - 2,9 - 4,6

C. Metoda Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

Hasil derivatisasi untuk pemeriksaan secara kromatografi gas dapat

dilanjutkan dengan menginjeksikan 1-2 µL larutan standar/metabolit dan hasil derivatisasi ke dalam injektor Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM).

Cara lain untuk pemeriksaan konfirmasi benzodiazepin sama seperti

prosedur pemeriksaan Kanabis dalam spesimen manusia tapi tidak perlu diinkubasi/hidrolisa. Reagensia maupun kondisi alat sama hanya menggunakan larutan standar kalibrasi standar benzodiazepin bebas dan metabolitnya sebagai pembanding dan internal standard larutan Mefruside 1 µg/mL. Konsentrasi larutan standar untuk kurva kalibrasi disesuaikan dengan cut off level konfirmasi untuk GC/MS.

159

15. Pemeriksaan Alkohol dalam spesimen manusia

a. Metoda Kromatografi Gas (KG) 1) Prinsip

Pengambilan udara yang mengandung alkohol dalam botol bertutup perforasi yang dipanaskan dalam penangas air dengan menggunakan disposable syringe dan kemudian udara yang terisap diinjeksikan ke dalam kromatografi gas.

2) Alat • Alat kromatografi gas yang dilengkapi oleh detector FID (Flame

Ionisation Detector) • Kolom Porapak Q (mesh 80-100) • Disposable syringe

3) Reagen Kondisi Kromatografi Gas : • Kolom : Porapak Q (mesh 80-100) • Suhu kolom : 160°C • Gas pembawa : Nitrogen • Aliran gas : 50 ml / menit • Detektor : FID (Flame Ionisation Detector)

4) Cara Kerja a. Masukkan 0,5 ml sampel ke dalam botol hijau Mc Cartney 5 ml yang

mempunyai tutup perforasi. Tutup botol dengan kuat, tempatkan dalam penangas air selama 5 menit pada suhu 37°C (untuk membuat zat tersebut dengan titik didih yang rendah) atau 56°C (untuk membuat zat tersebut dengan titik didih yang lebih tinggi)

b. Tanpa pendinginan, pindahkan 1 ml udara di atas sampel menggunakan 1 ml disposable tuberlin syringe

c. Sampel udaranya kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas.

5) Interpretasi Hasil Bandingkan waktu retensi sampel terhadap standar etanol Waktu retensi relatif*

Porapak Q (mesh 80-100)

160°C Obat 0,22 0,44

Metanol Etanol

160

Keterangan : *Waktu retensi diukur dari injection point.

b. Metoda Spektrofotometri/Metoda Dubowski

1) Prinsip Spesimen atau hasil destilasi uap jaringan di destilasi secara langsung dalam larutan asam tungstat untuk mengendapkan protein. Cairan dari destilat dicampur dengan sejumlah tertentu larutan standar kalium dikromat dalam larutan asam sulfat sehingga mencapai keasaman 15 N dan dioksidasi pada suhu 100°C. Residu ini diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm dan konsentrasi alkohol pada spesimen dihitung dari kurva kalibrasi atau table yang disiapkan dari larutan yang diketahui kadar alkoholnya.

2) Alat

• Peralatan destilasi uap dari Dubowski dan Shupe (Sciensifiglass apparatus)

• Penangas air elektrik pada suhu 100°C atau pada suhu yang konstan pada 100°C dengan cairan yang mudah larut (cairan UCON 50-HB-280X)

• Spektrofotometer (450 nm) • Pipet • Labu ukur yang bertutup gelas

3) Reagen

• Reagen pengoksidasi : 0.0214 N kalium dikromat 1.0500 g K2Cr2O7 dalam 1 liter dari 50% volume asam sulfat. 1 ml dari reagen setara dengan 0.247 mg etil alkohol

• Larutan Natrium tungstat 10% w/v • Asam sulfat 2/3 N • Larutan Asam tartrat 10% w/v

4) Cara Kerja

Spesimen darah, urin, saliva, cairan serebrospinal, destilasi jaringan a) Masukkan spesimen dan reagen ke dalam labu destilasi 125 ml. Sedangkan untuk spesimen darah digunakan tabung 250 ml,

masukkan 10 ml akuades (untuk analisa darah 20 ml), 2 ml spesimen (1 ml spesimen dapat dianalisa dengan mengumpulkan hasil destilat dalam labu ukur 5 ml dilanjutkan dengan langkah c hingga e), 5 ml asam sulfat 2/3 N dan 5 ml natrium tungstat 10%. Campur isi labu dengan memutar labu dan pasang pada alat destilasi. Destilasi

161

dimulai ketika darah sudah terkoagulasi sempurna dan berubah menjadi warna coklat gelap.

b) Destilasi pelan-pelan di dalam labu ukur bertutup gelas 10 ml, hingga volume kurang dari 10 ml selama 8-10 menit, menggunakan mikroburner dengan api 2.5-4 cm, volume diatur sampai garis tanda 10 ml dengan akuades, tutup dan campur dengan baik.

c) Ke dalam tabung kultur gelas borosilikat bertutup ulir dari teflon, masukkan 1 ml destilat dan 5 ml reagen pengoksidasi, campur dengan pemutaran yang kuat. Segera tutup tabung dan panaskan selama 8 menit dalam penangas air elektrik 100°C, masukkan tabung di atas level cairan.

d) Dinginkan tabung pada suhu kamar (25°C atau kurang), di bawah air mengalir atau dalam icebath, campur dengan memutar dan pindahkan cairan ke dalam kuvet. Baca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 450 nm, setelah alat dipasang pada 100% transmitant dengan kuvet yang berisi akuades.

e) Konsentrasi alkohol dalam sampel (%w/v) diketahui dengan table kalibrasi atau kurva yang disiapkan dari beberapa seri spesimen yang kadar alkoholnya telah diketahui.

Spesimen jaringan. a) Cairkan dengan cepat 10 g bekuan jaringan dengan ice cold waring

diblender. Timbang segera 2 g dari spesimen yang telah cair dengan ketelitian 0.01 g dan pindahkan secara kuantitatif ke dalam labu destilasi 250 ml, dengan 30 ml larutan asam tartrat 10%. Tambahkan 2-3 tetes cairan antifoam atau 0.1 g senyawa paraffin dengan titik lebur yang rendah. Campur dengan memutar dan pasangkan tabung pada peralatan destilasi.

b) Destilasi dengan kecepatan uap yang benar dari generator yang

mengandung akuades. Kumpulkan destilat kira-kira 20-30 ml dalam tabung destilat 125 ml dalam 8-10 menit

c) Ke dalam destilasi tersebut tambahkan 5 ml asam sulfat dan 5 ml

natrium tungstat 10%, campur dengan memutar labu. Pasangkan pada alat destilasi dan lanjutkan seperti untuk cairan tubuh (butir b-d seperti cara kerja spesimen darah, urin, saliva di atas)

d) Konsentrasi alkohol pada jaringan, dihitung seperti butir (e) cara

kerja spesimen darah, urin, saliva di atas, dari table kalibrasi yang sama.

162

Khusus

a. Bagian terpisah dari spesimen yang didestilasi dari larutan asam

tungstat ke dalam tabung destilat 125 ml, tambahkan 10 ml merkuri klorida jenuh dan 10 ml suspensi kalsium hidroksida. Campuran ini didestilasi kembali dan analisis selanjutnya seperti cara kerja spesimen darah, urin, saliva.

b. Untuk menentukan submikro dan ultramikro yang terbawa dalam

darah segar dan urin pada metode difusi cawan Conway. Untuk analisa submikro, 0,01 ml darah atau urin ditempatkan pada bagian luar dari cincin chamber dari cawan conway, dan 1,00 ml kalium karbonat untuk memudahkan pelepasan alkohol, 2,50 ml kalium dikromat, reagen oksidasi ditempatkan di tepi cawan Conway.

Untuk analisa ultramikro, 0,02 ml sampel ditempatkan diluar cincin chamber dari cawan conway yang berdiameter 44 mm, bersamaan dengan 0,50 ml reagen oksidasi kalium dikromat di tepi cawan conway.

DAFTAR PUSTAKA

1. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2002. Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GC/MS) Confirmation of Drugs, approved Guideline, Vol. 22. Number 22. Diakses dari URL : www.nccls.org.

2. Departemen Kesehatan RI, Direktorat Laboratorium Kesehatan. 2002. Pedoman Pemeriksaan Barbiturat, Benzodiazepin dan Alkohol Dalam Spesimen Manusia Dengan Metode KLT, KG dan Spektrofotometer. Jakarta.

3. Departemen Kesehatan RI, Direktorat Jenderal Pelayanan Medik. 2004.Pedoman Pemeriksaan Laboratorium Toksikologi Obat. Jakarta.

4. Departemen Kesehatan dan Kesejahteraan Sosial, Direktorat Jenderal Kesehatan Masyarakat. 2001.Buku Pedoman Praktis Mengenai Penyalahgunaan Narkotika, Psikotropika dan Adiktif Lainnya (NAPZA). Jakarta.

5. Department of Health and Human Services, Substance Abuse and Mental Health Services Administration. 2004. The Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs. Diakses dari URL : www.drugfreeworkplace.gov.

6. Moffat, A.C. et al. (ed.) 1986. Edisi 2. Clarke’s Isolation and Identification of Drugs. The Pharmaceutical Press. London.

7. Moffat, A.C. et al. (ed.) 2004. Edisi 3.Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. Vo.1 dan 2.The Pharmaceutical Press. London.

8. Regional Laboratory for Toxicology.2007. Drugs of Abuse Guidelines. Diakses dari URL : www. Toxlab.co.uk.

9. United Nations. Division of Narcotic Drugs. Recommended Methods for Testing Amphetamine and Methamphetamine. New York. 1987.

10. Undang-Undang RI Nomor 22 tahun 1997 tentang Narkotika

11. Undang-Undang RI Nomor 5 tahun 1997 tentang Psikotropika

12. United Nations. Division of Narcotic Drugs. 1998. Recommended Methods for Testing Barbiturate Under International Control. New York.

13. United Nations. Division of Narcotic Drugs. Recommended Methods for Testing Benzodiazepine Derivatives Under International Control. New York. 1988.

14. United Nations. Division of Narcotic Drugs. 1987. Recommended Methods for Testing Cannabis. New York.

15. United Nations. Division of Narcotic Drugs. 1986. Recommended Methods for Testing Heroin. New York.

16. United Nations International (Drugs Control Programme). 1995. Recommended Methods for The Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring – Substituted Amphetamine Derivatives in Biological Specimens. New York.

17. United Nations. Division of Narcotic Drugs. 1987. Recommended Methods for Testing Illicit Ring-Subtituted Amphetamine Derivatives. New York.

18. United Nations. Division of Narcotic Drugs. 1988. Recommended Methods for Testing Opium, Morphine and Heroin. New York.

19. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/amphetamine/

20. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org /wiki/barbiturate/

21. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/benzodiazepine/

22. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/buprenorphine/

23. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/cannabinoids/

24. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/cocaine/

25. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/heroin/.

26. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/methadone/

27. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org /wiki/methamphetamine/

28. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/ wiki/methylenedioxymethamphetamine/

29. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/wiki/morphine/

30. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Di akses di URL : http://en.wikipedia.org/wiki/nitrazepam/

pemeriksaan narkotika, psikotropika dan alkohol … · residu kemungkingan mengandung obat golongan...

Documents