pembuatan gel agarosa

7/25/2019 pembuatan gel agarosa

1/30

DISKUSI PRAKTIKUMBIOTEKNOLOGI

Mia Restu 132210101086Stevanus Ary Pratama 142210101002Della Karissa 142210101004

Nimatin Chirh 142210101006Devi Ayu !arasati 142210101014"ahra Pus#a Diani 142210101016

KELOMPOK C3


2/30

Penetapankadar DNA

Analisis DNAplasmid

elektr!"!resisDNA#

Pem$%atan&el a&ar!sa


3/30

Ke$eradaan DNA dalam s%at% !r&anisme dapat diketa'%i den&an ()ara *ait% se)ara k%alitati" den&an met!de Elektr!"!resis Gel A&ar!sedan se)ara k%antitati" den&an met!de spektr!"!t!metri+

Analisis k%antitati" mer%pakan sala' sat% teknik analisis *an&$ert%,%an %nt%k menent%kan ,%mla' ata% se$erapa $an*ak s%at% -atata% k!mp!nen -at+

K%alitas DNA *an& $er'%$%n&an den&an kem%rnian ter'adapk!ntaminan pr!tein dapat ditent%kan $erdasarkan nilai per$andin&ana$s!r$ansi s%spensi DNA pada pan,an& &el!m$an& (./ nm ter'adap(0/ nm+ Rasi! A(./ 1 A(0/ antara 20 4 (/ men)erminkan DNA *an&relati" m%rni dan ter$e$as dari k!ntaminan pr!tein+ Nilai a$s!r$ansipada pan,an& &el!m$an& (./ nm dapat dik!n5ersikan men,adik!nsentrasi *ait% nilai 2 pada A(./ 6 7/ %& DNA %tas &anda tiap ml+

PENETAPAN KADAR DNA


4/30

METODE PERCOBAAN

A!A%

K%5et k8arsa 2mL

Mikr!pipet

Mikr!tip

&A'AN

DNA 'asilis!lasi

B%9er TE

dd:(O


5/30

Men&'it%n& k!nsentrasiDNA;

DNA


6/30

Ta$el :asil penetapan kadar

:ASIL PENGAMATAN

Sam

#elA260 A280

Ka(a

r

DNA

Kem

urnia

n

C1 /+(72 /+2 (72/ 2+

C2 /+23/ /+/0 23// 2+.C3 /+(3( /+2.( (3(/ 2+3


7/30

Cara per'it%n&an;

a+ Men&'it%n& k!nsentrasi DNA

DNA &1l 6 A(./ = "akt!r pen&en)eran = 7/&1l

akt!r pen&en)eran 6 7l12///

6 21(//

$+ Kem%rnianC2 6 6 6 2

C( 6 6 6 2.

C3 6 6 6 23

=


8/30

Kadar ;

C2 6 A(./ = "akt!r pen&en)eran = 7/&1l 6 /+(72

= (// = 7/&1l6 (72/

C( 6 A(./ = "akt!r pen&en)eran = 7/&1l 6 /+23/= (// = 7/&1l

6 23//

C3 6 A(./ = "akt!r pen&en)eran = 7/&1l 6 /+(3(= (// = 7/&1l

6 (3(/

Kesimp%lan ;

Nilai kem%rnian dari C2 6 2+

C( 6 2+.

C3 6 2+3

Nilai kem%rnian >2+0 maka ada k!ntaminan


9/30

Analisis k%antitati" DNA dapat dianalisis den&an met!de

spektr!"!t!metri+

U,i k%antitati" DNA adala' analisis %nt%k menent%kankand%n&an ata% ,%mla' DNA *an& terdapat dalam s%at%

-at ata% k!mp!nen -at *an& se$el%mn*a tela' diketa'%ike$eradaan DNA plasmidn*a dalam lar%tan )!nt!'n*aden&an )ara %,i k%alitati"+

A$s!r$si spektr!"!t!metri mer%pakan teknik *an& )epatdan ak%rat %nt%k menent%kan k!nsentrasi sampel DNAm%rni+

PEMBA:ASAN


10/30

Pada praktik%m kali ini dilak%kan penetapan kadar DNAmen&&%nakan DNA Plasmid 'asil dari is!lasi DNA kel!mp!k C2C( dan C3 *an& tela' dilak%kan se$el%mn*a+

M%la4m%la dilak%kan pen&en)eran DNA Plasmid kem%diandi%k%r a$s!r$ansin*a den&an U4is di la$!rat!ri%m analisisinstr%men+ Fan& di&%nakan pada praktik%m kali ini *ait%spektr!"!t!metri d!%$le $eem+ Se$el%m peen&%k%ran sampelk%5et $lan&k! diisi den&an a%a$idest )air steril pada pan,an&

&el!m$an& (./ nm 'in&&a didapat a$s!r$ansi A# ///+ K%5et *an& akan di&%nakan dikerin&kan terle$i' da'%l% den&an

dr*er a&ar tidak ada sen*a8a tertin&&al se'in&&amempen&ar%'i nilai a$s!r$ansin*a *an& lain+

Setela' it% dilak%kan preparasi sampel den&an )ara diam$il 7 l

sampel DNA plasmid dan di)amp%r den&an HH7 l a%a$ideststeril+ Lar%tan dit%an&kan men&&%nakan mikr!pipet dandires%spensi+ Karena 5!l%me *an& di&%nakan k%ran& dari 2 mlmaka di&%nakan k%5et 2 ml a&ar tin&&in*a memen%'i standar+Setela' it% di%k%r a$s!r$ansin*a pada pan,an& &el!m$an& (./nm dan (0/ nm se'in&&a diper!le' 'asil a$s!r$ansi+


11/30

Pada 'asil praktik%m s'i"t C men%n,%kkan Kem%rnianDNA memiliki nilai 204(/+ Sedan&kan 'asilkem%rnian *an& didapatkan adala' 2 2. dan23 tidak ses%ai den&an rentan& *an& ditetapkan+

:al ini dikarenakan karena sampel DNA men&and%n&

pr!tein RNA !li&!n%kle!tida primer ata% n%kle!tida+RNA primer dan n%kle!tida men*erap k%at pada (./nm dan tidak $isa di$edakan dari DNA+ K!ntaminanseperti pr!tein dapat men*e$a$kan kele$i'an isi DNAdalam sampel+ Masala' ini dapat diatasi den&an

men&&%nakan met!de alternati5e %nt%k men&%k%rDNA sa a dalam sam el+


12/30

Pemipetan DNA7


13/30

Penetapankadar DNA

AnalisisDNA

plasmidelektr!"!re

sis DNA#

Pem$%atan&el

a&ar!sa


14/30

METODE

A!A%

Nera)a analitik

Erlenme*er

Microwave

Cetakan &el

&A'AN

A&ar!se

TBE 2 tris boric

EDTA# EtBr ethidium

bromide#


15/30

Met!de


16/30

Pada pem$%atan &el a&ar!se a8aln*a menim$an&a&ar!sa se$an*ak /+& kem%dian mem$%atpen&en)eran TBE 7= men,adi TBE 2= den&an )ara

memipet (/ml TBE 7= lal% ditam$a'kan a%adeststeril 'in&&a /ml


17/30

Setela' pen&%k%ran TBE 7= men,adi TBE 2= kem%dian melar%tkan a&ar!sakedalam TBE *an& tela' di$%at terse$%t+ Kem%dian )amp%ran dik!)!k'in&&a '!m!&en* didalam Erlenme*er+ Unt%k memper!le' kelar%tanmaksimal Erlenme*er dit%t%p den&an kapas kem%dian Erlenme*erdipanaskan diatas '!tplate 'in&&a sem%a a&ar!sa men,adi terlar%t dandiper!le' &el a&ar!sa 2+ Pada pr!ses ini lar%tan akan men,adi $enin&+

Setela' it% ditam$a'kan EtBr Et'idi%m Br!mida# se$an*ak 2 l den&anmikr!pipet kem%dian di)amp%rkan ata% dilar%tkan dalam lar%tan &ela&ar!sa den&an )ara memipet naik t%r%n seperti meres%spensi+ Praktikan*an& melak%kan pr!ses ini 'ar%s men&&%nakan sar%n& tan&an nitril+Kem%dian lar%tan diasamkan 'in&&a s%'% 7/C+ Kem%dian disiapkan)etakan ata% tra* a&ar!sa den&an men%t%p sisi l%$an& )etakan den&ansel!tip+ Lal% praktikan men%an&kan lar%tan ke dalam )etakan kem%dian

menempatkan sisir elektr!"!resis %nt%k mem$ent%k s%m%r+ Kem%dian &eldimas%kkan ke dalam lemari pendin&in+ Setela' &el m%lai memadatpen%t%p )etakan dan sisir dilepaskan+ Kem%dian &el a&ar!sa disimpandalam se$%a' 8ada' *an& $erisi a%adest steril+ Kem%dian disimpan dalamlemari pendin&in %nt%k melak%kan elektr!"!resis+


18/30

Gam$ar


19/30


20/30


21/30

Penetapankadar DNA

AnalisisDNA

plasmidelektr!"!re

sis DNA#

Pem$%atan&el

a&ar!sa


22/30

METODE PRAKTIKUM

ALAT DAN BAHAN

Alat: erlenmeyer, microwave dan mikrotip, eppendorf,

cetakan gel, mesin elektroforesis, UV transilluminator.

Bahan :Loading dye, ekstrak DNA, DNA ladder k!

se!agai marker, agarosa, "B# $ %Tris Boric EDTA&, #tBr

%Ethidium Bromide&.


23/30

Elektr!"!resis di,alankan pada 0/ // mA selama ./menit kem%dian &el 'asil elektr!"!resis diamati di

$a8a' sinar U

Sampel 7l 'asil is!lasi DNA &en!m 1 DNA plasmid#*an& tela' di)amp%r den&an ( l l!adin& $%9er

dimas%kkan ke dalam sala' sat% s%m%r dan . l markaDNA 2 k$ ke dalam s%m%r lainn*a

Setela' &el memadat pen%t%p )etakan dan sisrdilepaskan kem%dian )etakan ditempatkan dalam

tan&ki elektr!"!resis *an& $erisi $%9er TBE

CARA K)R*A

)le+tr,resis A-arsa


24/30

'arak migrasi DNA yang akan ditentukan kemudian diinterpolasikan ke dalam garis regresi yangtelah di!uat sehingga dapat diketahui nilai log B( dari DNA terse!ut.

Di!uat garis regresi antara log B( DNA %$& dengan )arak migrasi %y&

Penentuan .+uran DNA


25/30

%a/el hasil u+uran mar+a DNA

:ASIL PENGAMATAN

Gam$ar marka DNA se)ara te!ritisSe$ela' Kiri#


26/30

:asil Pen&amatan.+uran Mar+a DNA *ara+ Mi-rasi

Mar+ay m

*ara+ Mi-rasi Sam#el

mK/ L!& =#

Pita 1 10

Pita 2 8Pita 3 6

Pita 4

Pita 4

Pita 6 3

Pita 5 2

Pita 8 1

2

/H//0

//

/./

/0

/3/

/

(7

(3

3(

37

30

7

37

Persamaan

Re-resi

* 6 4(H2( = 7(H7

.+uran sam#el

+/

237( k$


27/30

Persamaan Re&resi*6 4(H2( = 7(H7

Karena sem%a sampel ,arak mi&rasin*a 6 37 )m maka

Uk%ran DNA ;

* 6 4(H2(= 7(H7376 4(H2(= 7(H7

(H2( = 6 7(H7 37

= 6

= 6 /.2.7

Uk%ran antil!& = 6 237( k$

Hasil Perhitungan


28/30

*solat plasmid yang digunakan dalam praktikum ini adalah isolat plasmid

E.coli. Dari hasil elektroforesis, dapat diamati !ahwa isolate kelompok +

memiliki - )enis plasmid. Dimana, ukuran plasmid ke empatnya sama yaitu

-,/ k!. (enun)ukkan !ahwa keempat plasmid terse!ut tidak sama.

0ondisi ini tidak sesuai dengan pernyataan Nicklin,dkk %111& !ahwa sel

!akteri dapat memiliki satu )enis atau le!ih plasmid DNA dengan ukuran yang

!ervariasi dari ukuran kecil sampai !erukuran sangat !esar atau dise!ut

megaplasmid. 2upernatan hasil isolasi DNA kromosom pada praktikum

se!elumnya akan ditentukan ukurannya yaitu dengan menggunakan metode

elektroforesis agarosa. Dan hasil akhirnya menun)ukkan !ahwa didalam

supernatan terse!ut tidak mengandung DNA kromosom karena setelah cetakandi UV tidak terdapat migrasi dari DNA kromosom. Untuk dapat

divisualisasikan dengan UV, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan

#thidium Bromida %#tBr&. Alasan tidak adanya DNA kromosom yaitu karena

!akteri yang diisolasi merupakan !akteri #.coli hasil rekom!inan.

Pem$a'asan


29/30

#lektroforesis merupakan suatu teknik untuk memisahkan fraksi3fraksi suatu 4at !erdasarkan migrasinya di!awah pengaruh medan

listrik. 5ada praktikum kali ini dilakukan perco!aan

elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa. (arka DNA

yang digunakan pada praktikum kali ini adalah k! 6adder DNA%7 6anes& ( 737. 5roses elektroforesis dilakukan pada

tegangan 87v, kuat arus -77mA dan selama 97 menit. 2etelah

proses selesai dilakukan pengukuran ukuran DNA plasmid dan

didapatkan hasil ukuran DNA sampel adalah -./ k!.

Kesimp%lan


30/30

pembuatan gel agarosa

Documents