ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh: Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Asep Setiadi : B1J008105 : IV :4 :Anriani Puspita Karunia Ning Widhi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I.

PENDAHULUAN

A.

Latar Belakang

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. .

B.

Tujuan

Tujuan praktikum adalah untuk mengetahui cara kerja dan prinsip kerja elektroforesis.

II.

MATERI DAN METODE

A.

Materi

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu DNA marker, misalnya DNA yang dipotong dengan HindIII, DNA produk PCR, agarosa, larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml), Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM), akuades, larutan Etidium Bromid (EtBr). Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur 1000 ml, labu erlenmeyer 50 ml, seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific), tabung mikrosentrifuga, kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis, sarung tangan, kaca mata UV, UV transluminator, kamera digital.

B.

Matode

Praktikum ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: No. Keterangan Gambar

1. Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%, timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan asisten) 2. Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20 mL

3. Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat jernih.

4. Biarkan larutan agarosa mendingin (55C) dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10 mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke dalam pencetak gel

5. Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke dua ujung pencetak gel dan menempatkan sisir pada salah ujung pencetak gel

6. Tuangkan

larutan

agarosa

ke

dalam

pencetak gel.

7. Setelah gel memadat, pindahkankan gel agarosa beserta pencetak gel ke dalam tangki elektroforesis. Sebelum dipindahkan ke tangki

elekstroforesis, selotip pada kedua ujung pencetak gel dilepas terlebih dahulu 8. Masukkan 10 L sampel DNA yang telah dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke dalam sumur (well) gel agarosa 9. Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose bagian bawah.

10. Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel agarosa di atas UV transillumitor dan tutup kaca pelindung dan amati pita DNA

11. Dokumentasikan pita DNA yang tampak menggunakan kamera .

III.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

B. Pembahasan Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bisakrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda. ( Pratiwi, 2001). Metode Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Prinsip pemisahan dalam elektroforesis didasarkan atas perbedaan migrasi komponen pada fase pendukung, karena adanya perbedaan muatan dan masa molekul ( Zubay, 1989).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar ( Pratiwi, 2001). Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekulmulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. dalam Gel

poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat ( Zubay, 1989). Menurut Soedarmadji (1996), beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: 1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. 5. Kekuatan voltase Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik). 6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain

itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti , 2006). Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka

semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996). Hasil praktikum menunjukkan bahwa DNA sampel terbaca, namun DNA marka tidak terbaca malainkan terjadi penumpukan. Hal ini terjadi mungkin karena kurang tepat dan kurang hati-hati dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumuran, sehingga DNA marka terlalu banyak dan hingga memenuhi sumur sebelahnya. Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang

terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang

mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).

Fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam elektroforesis gel agarosa: a. Aquades b. Etidium bromide c. Baki gel agarosa d. UV Transiluminator e. TAE : sebagai pelarut : sebagai pewarna DNA : sebagai cetakan gel agarosa : untuk melihat pita-pita DNA : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH, a. Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram, b. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA-se DNA marka : DNA penanda Sisir elektroforesis : untuk membuat sumuran pada gel agarosa Tangki elektroforesis : untuk running DNA Loading dye : sebagai pemberat DNA : untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye : untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye : Melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

f. g. h. i.

j. Mikropipet k. Kertas Parafilm l. Sarung tangan

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan : 1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . 2. Hasil yang didapat dilihat dari perpendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis, DNA marka mengalami degradasi atau mengumpul tetapi DNA sampel dapat terbaca. Hal ini terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain kesalahan dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumur gel, waktu yang kurang atau voltase naik turun.

B. Saran Sebisa mungkin semua praktikan melakukan percobaan, kalau tidak buat apa di bikin kelompok yang terdiri dari -+ 5 praktikan.

DAFTAR REFERENSI

Anonim, 2011. http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/ Anonim. 2011 http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta. Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya. Malang Zubay, G.L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New York.