Abdul Wakil

115100613111005

TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI

SEKUENSING DAN PCR

1. SEKUENSING

· Pengertian Sekuensing DNA

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.

· Pengertian Hibridasi

Dalam ilmu kimia atom dikenal ada yang namanya hibridisasi. Apa sebenarnya hibridisasi itu? Hibridisasi dapat didefinisikan sebagai peleburan orbital-orbital dari tingkat energy yang berbeda menjadi orbital yang orbital yang energinya setingkat. Menentukan hibridisasi dapat diperoleh dari domain electron dengan melihat PEB dan PEI yang dipromosikan atau perpindahan elektron diatom pusat yang memiliki jumlah elektron penuh dalam orbital tersebut, harus dipromosi ke orbital selanjutnya agar diperoleh orbital setengah penuh untuk mengikat elektron pada ikatannya.

· Prinsip Kerja Southern Blotting

Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.Metode ini diambil dari nama penemunya yaitu Edward M. Southern.Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah membran nitroselulosa.

Blot Southern merupakan sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA. Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh.

Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan probe.Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan. Blot Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan menggunakan DNA sebagai pelacak. Selain Blot Southern, metode lain yang mirip dan dikembangkan dari Blot Southern adalah Blot Western, Blot Northern, dan Blot Southwestern yang memiliki prinsip yang sama, namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang digunakan berbeda. Kegunaan dari Blot Southern adalah untuk menganalisis keberadaan mutan yang ada pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan pada organisme tersebut.

Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap blotting. Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas. setelah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran. Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif, tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran. Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi.

Southern Blot method

· Prinsip Kerja Northern Blotting

Blot Northern digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah blot. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara, tergantung pada label yang digunakan, namun kebanyakan hasil dalam penyataan ‘band’ menunjukkan ukuran RNA yang terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Hal tersebut adalah salah satu alat paling dasar untuk menentukan pada waktu kapan, dan dalam kondisi apa, gen-gen tertentu dinyatakan dalam jaringan hidup.

Northern blotting

· Prinsip Kerja Western Blotting

Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette. Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target. Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut.

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.

Metode analog dengan blotting western dapat digunakan untuk langsung noda protein tertentu dalam sel hidup atau bagian jaringan. Namun, metode “immunostaining”lebih sering digunakan dalam penelitian biologi sel.

Western blotting

· Perbedaan Dan Persamaan Southern Blot, Northern Blot Dan Westhern Blot

Transfer DNA disebut ‘Southern blotting’ (SB), mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Untuk deteksi mRNA digunakan teknik Northern Blot (NB). baik SB dan NB menggunakan gen atau potongan DNA spesifik yang dilabeli probe untuk mempermudah deteksi gen yang dianalisis. untuk protein dikenal sebagai Western Blot menggunakan antibody spesifik.

2. PCR

· Kepanjangan Dan Pengertian PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali), atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.

· Macam-Macam Tipe Dan Modifikasi Dari PCR

1. Real-time PCR

Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkandari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana teknik ini digunakanuntuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Realtime PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilaiabsolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelahdinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yangditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yangdianalisis. Pada analisa PCR konversional deteksi keberadaan DNAdilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasilamplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proseselektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCRmemungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung,keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang munculsebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe(penanda). Pada Real TimePCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis,sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan EthidiumBromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dariReal Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNAyang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksisecara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.

2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kineticpolymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR,dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR biasasumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkanRNA. Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantaitunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Ciri khasRNA adalah tidak terdapat gugus basa timin (T) melainkan diganti olehurasil (U). Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase,karena hanya enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakanRNA karena polimerase DNA hanya dapat mensintesis denganmenggunakan cetakan DNA. Pertama-tama RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunkan enzime reverse transcriptase yang disebutdengan komplemen DNA (cDNA) . dalam hal ini disintesis cDNA dariperpasangan anatar gugus basa U dan A serta G dan C. Dari cDNA inilahdilipat gandakan segemn DNA yang mirip urutan basa nukleotidanyadengan RNA, hanya U diganti kembali ke T. Karena adanya penambahanproses sintesis cDNA, tahapan proses PCR bertambah pula. Tahappertama terjadi proses anneling untuk memasangkan primer untuk memperpanjang segmen cDNA. Setelah terbentuk segmen cDNA ini, barukemudian masuk kepada proses PCR biasa. RT-PCR peting digunakansebagai alat diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus,sebagai informasi untuk studi epidemiologi.

3. Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan(replikasi) sampelDNAmenggunakan bantuanenzimDNA polymeraseyangmenggunakan dua pasangprimeruntuk mengamplifikasifragmen. nested PCR adalah PCR yangsangatspesifik dalam melakukanamplifikasi.Nested PCR dan PCR biasaberguna untuk memperbanyak fragmenDNAtertentu dalam jumlahbanyak.

4. Multiplex PCR

Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuranPCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda.

5. PCR-ELISA

PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkapasam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yangterkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCRakan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukanpengukuran sequen internal pada produk PCR.

· Prinsip Kerja Real-Time PCR

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.

 Prinsip Real Time PCR (qPCR)

· Prinsip kerja Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti amplifikasi logaritmik.

RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik dimana RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan.

Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA at 95°C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya akan dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu anealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation.

Perhatian utama saat memilih temperatur anealing optimal adalah melting temperatur ™ dari primer dan probe (jika digunakan). Temperatur annealing dipilih untuk PCR tergantung langsung pada panjang dan komposisi dari primer tersebut. Hal ini merupakan hasil dari perbedaan ikatan hidrokarbon antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3 ikatan). Temperatur annealing biasanyaberkisar 5 derajat di bawah Tm terendah dari pasangan primer yang digunakan.

Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler. Analaisa produk PCR tergantung pada kebutuhann PCR. Jika menggunakan PCR konvensional, maka produk PCR dapat dideteksi dengan agarose gel electrophoresis dan ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).

· Prinsip kerja PCR-ELISA

PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkapasam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yangterkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCRakan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukanpengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilihkarena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR.PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telahberkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequentersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antarabeberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini jugaberguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampeltidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISAadalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksiperubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yangmengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.